孫協(xié)平，余 芯，周廣文，韓國(guó)強(qiáng)，江 波，羅友進(jìn)

（1 長(zhǎng)江師范學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院，重慶408100）（2 重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所）

硒是植物有益元素，既能促進(jìn)植物生長(zhǎng)，也能提高植物抗逆性[1-2]，其主要通過提高抗氧化酶活性和抗氧化物質(zhì)含量來實(shí)現(xiàn)，與谷胱甘肽氧化循環(huán)關(guān)系密切。作為生物機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶之一的谷胱甘肽過氧化物酶（GPX），可通過催化氧化型谷胱甘肽（GSSG）生成還原型谷胱甘肽（GSH），消除自由基，阻斷自由基進(jìn)一步損害機(jī)體[3-4]。在植物體內(nèi)，硒能提高谷胱甘肽氧化循環(huán)，進(jìn)而提高抗氧化水平[5-7]。硒代蛋氨酸（Se-Met）分子式為C5H11NO2Se，是硒元素取代了蛋氨酸中硫元素而合成的一種氨基酸，也是硒在自然界中以有機(jī)形式存在于植物中的一種化合物，其生物利用效率較高[8]。同時(shí)Se-Met 比亞硒酸鈉毒性低，可代替亞硒酸鈉作為硒源，起到降低環(huán)境污染的作用[9]。

生物胺是一類具有生物活性含氮的低分子量有機(jī)化合物的總稱，在促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)，促進(jìn)蛋白質(zhì)、RNA 及DNA 的合成，消除自由基，增強(qiáng)代謝等方面都有一定的作用[10]。色氨酸代謝過程中產(chǎn)生的色胺、5-羥色氨酸、N-乙酰-5 羥色胺、5-羥色胺（血清素）、5-甲氧色氨酸、褪黑素等[11-12]均屬于生物胺，具有多種生理功能。其中5-羥色胺廣泛分布于動(dòng)物組織中，參與哺乳動(dòng)物肌肉收縮、血壓調(diào)控以及消化系統(tǒng)中各器官的生理、病理調(diào)控等過程[13]。褪黑素是一種強(qiáng)大的抗氧化劑，能直接清除自由基[14-17]。

葡萄（Vitis viniferaL.）含有豐富的5-羥色胺、褪黑素等生物胺類物質(zhì)，其含量受到環(huán)境、品種等因素的影響[18-20]。陽光玫瑰葡萄品質(zhì)優(yōu)良、經(jīng)濟(jì)效益高，是我國(guó)主栽葡萄品種之一。本課題以該品種為試驗(yàn)材料，分析比較硒代蛋氨酸對(duì)陽光玫瑰谷胱甘肽氧化循環(huán)等抗氧化能力方面和色氨酸代謝相關(guān)酶活性和物質(zhì)的含量的影響，并利用成本較低的富硒酵母（主要成分為硒代蛋氨酸）處理幼樹，分析對(duì)5-羥色胺到褪黑素合成相關(guān)酶活性的影響，以期明確硒代蛋氨酸對(duì)葡萄生理參數(shù)和色氨酸代謝的影響，從而為生產(chǎn)富硒高生物胺類物質(zhì)的葡萄提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理

2018 年3 月3 日將陽光玫瑰葡萄枝條扦插于珍珠巖與蛭石（1∶10）為基質(zhì)的無紡布營(yíng)養(yǎng)袋中，之后添加適量沙子，防止雜草與水分蒸發(fā)。5 月6 日將硒代蛋氨酸溶于水配制成溶液，并澆灌葡萄扦插幼苗，使基質(zhì)硒含量為1.0 mg/L，對(duì)照澆同等量的水。每個(gè)處理4 次重復(fù)，每2 株扦插苗為1 次重復(fù)，共計(jì)8 株。統(tǒng)一進(jìn)行澆水、除草、施肥、打杈等常規(guī)管理，6 月20 日采集葡萄根系測(cè)定其抗氧化水平。2019 年1 月13 日（休眠期）去掉無紡布袋中原有基質(zhì)，對(duì)葡萄的根系和枝條進(jìn)行適當(dāng)修剪，種植于7 加侖花盆中，基質(zhì)為園土、草炭、蛭石、珍珠巖（1∶2∶1∶1），放置于溫室中。2019 年8 月10 日分別采集對(duì)照和硒代蛋氨酸處理的葡萄葉片測(cè)定其抗氧化水平，以及色氨酸與5-羥色胺含量，每個(gè)處理3 次重復(fù)，每2 株為1 次重復(fù)，共計(jì)6 株。2019 年11 月15 日（休眠期）根據(jù)基質(zhì)體積計(jì)算富硒酵母用量，將其溶于2 L 水中進(jìn)行澆灌，使基質(zhì)硒含量為1.0 mg/L，對(duì)照澆同等量的水，每個(gè)處理3 次重復(fù)，單株為1 次重復(fù)，共計(jì)3 株。2020 年8月10 日采集葡萄葉片和根系，測(cè)定褪黑素合成相關(guān)酶活性。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 抗氧化物質(zhì)和酶活性的測(cè)定

葡萄根系及葉片谷胱甘肽（GSH）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）、谷胱甘肽還原酶（GR）、谷胱甘肽S 轉(zhuǎn)移酶（GST）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）的含量以及總抗氧化水平（T-AOC）均采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定[1]。

1.2.2 色氨酸、5-羥基色胺酸、色胺以及5-羥色胺含量的測(cè)定

利用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定葡萄葉片中色氨酸和5-羥色胺含量。取適量樣品（約0.5 g）粉碎混勻，加入5 mL 0.4 mol/L 高氯酸溶液，放于超聲波萃取30 min，然后過0.45 μm 濾膜后，進(jìn)樣。4種物質(zhì)均采用色譜柱syncronis C18（Dim 250 mm×4.6 mm，5 μm），進(jìn)樣量為20 μL，流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)均為280 nm。色氨酸的流動(dòng)相為水（0.05 mol/L 磷酸二氫鉀，用磷酸調(diào)pH 值至2.68）∶甲醇＝80∶20，5-羥基色胺酸和5-羥色胺的流動(dòng)相均為水（0.5%磷酸）∶甲醇＝90∶10，色胺流動(dòng)相為流動(dòng)相A：90%乙腈/10%（含0.1%乙酸的0.01 mol/L 乙酸銨溶液），流動(dòng)相B：10%乙腈/90%（含0.1%乙酸的0.01 mol/L 乙酸銨溶液）進(jìn)行時(shí)間梯度淋洗[21]。其中，5-羥色氨酸的檢測(cè)線為0.56 μg/g，色胺的檢測(cè)線為0.943 μg/g。

1.2.3 褪黑素合成相關(guān)酶活性的測(cè)定

5-羥色胺-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（SNAT）、N-乙酰-5-羥色胺-O-甲氧基轉(zhuǎn)移酶（ASMT）、芳香烷基胺-N-乙酰基轉(zhuǎn)移酶（AANAT）以及咖啡酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（CAMT）活性均采用酶聯(lián)免疫分析試劑盒進(jìn)行測(cè)定[1]。其中SNAT 檢測(cè)范圍為5～180 IU/g、ASMT為1.5～50.0 IU/g、AANAT 為3～140 IU/g、CAMT為125～4 500 mU/g。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用Origin 8.5 軟件分析數(shù)據(jù)，其中差異顯著性分析采用LSD 方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 硒代蛋氨酸對(duì)葡萄扦插苗根系谷胱甘肽氧化循環(huán)的影響

陽光玫瑰葡萄扦插苗根系與硒代蛋氨酸直接接觸后，谷胱甘肽氧化循環(huán)受到一定程度的促進(jìn)作用，如表1 所示。硒代蛋氨酸處理雖然對(duì)谷胱甘肽（GSH）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量以及GSH/GSSG 比值、GSH＋GSSG 總量影響不顯著，但顯著提高了谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）活性（提高10.42%），顯著降低了谷胱甘肽還原酶（GR）活性（降低12.15%）。

表1 硒代蛋氨酸對(duì)葡萄扦插苗根系谷胱甘肽氧化循環(huán)的影響

2.2 硒代蛋氨酸對(duì)葡萄扦插苗根系抗氧化能力的影響

如表2 所示，硒代蛋氨酸處理降低了陽光玫瑰葡萄根系丙二醛（MDA）含量（降低0.40%）、總抗氧化能力（T-AOC，降低12.97%）和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（GST）活性（降低1.25%），但與對(duì)照差異均未達(dá)到顯著水平。其中，過氧化氫酶（CAT）活性硒代蛋氨酸處理與對(duì)照出現(xiàn)了完全一致的現(xiàn)象。

表2 硒代蛋氨酸對(duì)葡萄扦插苗根系抗氧化能力的影響

2.3 硒代蛋氨酸對(duì)葡萄幼樹葉片谷胱甘肽氧化循環(huán)的影響

硒代蛋氨酸處理對(duì)葡萄幼樹葉片谷胱甘肽氧化循環(huán)起到明顯的促進(jìn)作用（表3）。葉片谷胱甘肽（GSH）含量和谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）活性均顯著提高，分別提高8.62%、9.15%；氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量略微提高，谷胱甘肽還原酶（GR）活性略微降低，但均未達(dá)到顯著水平。硒代蛋氨酸處理后的葉片 GSH＋GSSG 含量提高9.06%，GSH/GSSG 比值增加8.22%，但均未達(dá)到顯著水平。

表3 硒代蛋氨酸對(duì)葡萄幼樹葉片谷胱甘肽氧化循環(huán)的影響

2.4 硒代蛋氨酸對(duì)葡萄幼樹葉片抗氧化能力的影響

如表4 所示，硒代蛋氨酸處理后陽光玫瑰葡萄幼樹葉片丙二醛（MDA）含量降低1.71%，總抗氧化能力（T-AOC）和過氧化氫酶（CAT）活性分別提高3.41%和7.39%，而谷胱甘肽S 轉(zhuǎn)移酶（GST）活性降低0.51%。硒處理下葡萄幼樹葉片4 個(gè)抗氧化參數(shù)與對(duì)照差異均未達(dá)到顯著水平。

表4 硒代蛋氨酸對(duì)葡萄幼樹葉片抗氧化能力的影響

2.5 硒代蛋氨酸對(duì)葡萄幼樹葉片色氨酸代謝相關(guān)物質(zhì)含量的影響

從表5 可以看出，與對(duì)照相比，硒代蛋氨酸處理后的陽光玫瑰葡萄幼樹葉片色氨酸含量顯著降低（降低20.89%），而5-羥基色胺酸、色胺含量均低于檢測(cè)值。硒代蛋氨酸處理后葉片5-羥色胺含量顯著高于對(duì)照（提高869.57%）。

表5 硒代蛋氨酸對(duì)葡萄幼樹葉片色氨酸代謝相關(guān)物質(zhì)含量的影響 μg/g

2.6 富硒酵母對(duì)葡萄葉片和根系褪黑素合成相關(guān)酶活性的影響

如表6 所示，富硒酵母處理顯著降低了陽光玫瑰葡萄葉片SNAT 活性（降低26.81%），對(duì)ASMT活性的影響甚微。富硒酵母處理后陽光玫瑰葡萄葉片AANAT 與CAMT 活性分別提高9.74%、19.44%，但均未達(dá)到顯著水平。

富硒酵母處理后陽光玫瑰葡萄根系SNAT 活性較對(duì)照降低19.39%，達(dá)到顯著水平。與對(duì)照相比，富硒酵母處理提高了陽光玫瑰葡萄根系A(chǔ)SMT 活性，提高幅度為9.76%，達(dá)到顯著水平。富硒酵母處理降低了陽光玫瑰葡萄根系A(chǔ)ANAT 活性（降低3.30%），提高了CAMT 活性（提高15.91%），但均未達(dá)到顯著水平（表6）。

表6 富硒酵母對(duì)葡萄葉片和根系褪黑素合成相關(guān)酶活性的影響

3 討論與結(jié)論

在谷胱甘肽氧化循環(huán)中，GSH 在GPX 的催化下形成GSSG，GSSG 又在GR 的催化下合成GSH，在這過程中GSH、GPX 參與自由基的消除[3-4]。李孟奇[5]研究表明，不同類型硒處理能提高番茄植株GSH 含量、GPX 活性以及GSH/GSSG 比值，增強(qiáng)其總抗氧化能力。孫協(xié)平等[21]通過不同形態(tài)硒處理苗期青脆李，表明4種形態(tài)硒均能提高根系谷胱甘肽氧化循環(huán)效率，在大豆研究中也得到類似的結(jié)果[22]。在本研究中，硒代蛋氨酸處理對(duì)陽光玫瑰葡萄扦插苗根系和幼樹葉片的谷胱甘肽氧化循環(huán)有一定的促進(jìn)作用。

植物體內(nèi)MDA 含量可用來分析細(xì)胞質(zhì)膜的過氧化程度[23]，MDA 含量越少說明植物細(xì)胞質(zhì)膜發(fā)生的過氧化作用越少。適當(dāng)補(bǔ)硒能夠明顯降低花椰菜植株MDA 含量[4]。本試驗(yàn)中，硒代蛋氨酸處理的葡萄扦插苗根系和幼樹葉片MDA 含量均略低于對(duì)照，表明硒代蛋氨酸處理能夠降低葡萄細(xì)胞質(zhì)膜的過氧化程度。CAT、T-AOC 是判斷植物抗氧化能力的生理參數(shù)，本研究中經(jīng)硒代蛋氨酸處理的葡萄幼樹葉片抗氧化水平優(yōu)于扦插苗根系抗氧化水平，但均未達(dá)到顯著水平，這可能與硒的形態(tài)和濃度有關(guān)。GST 在毒理學(xué)上有一定的作用，如能催化還原型谷胱甘肽與多種親電、親脂底物結(jié)合，降低底物的毒性[24]。本研究中硒代蛋氨酸處理的葡萄根系和葉片的GST 含量均低于對(duì)照，但未達(dá)到顯著水平。

色氨酸在色氨酸脫羧酶、色氨酸羥化酶、羥化酶的催化下分別形成5-羥基色氨酸、色胺與5-羥色胺[11-12]。色胺是植物激素吲哚乙酸（IAA）的前體，能合成IAA，故與5-羥色胺的合成存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系[25]。在本研究中，硒代蛋氨酸處理后5-羥基色氨酸和色胺均未檢測(cè)出，但對(duì)色氨酸與5-羥色胺含量產(chǎn)生了顯著影響。有研究報(bào)道，不同類型硒處理能顯著增加番茄5-羥色胺含量，但對(duì)色氨酸影響不顯著[5]，本研究與其不同之處為硒處理顯著降低了色氨酸含量。而在青脆李上，低劑量的硒代蛋氨酸處理對(duì)色氨酸和5-羥色胺含量影響均不顯著[26]。可見不同植物、不同濃度硒處理會(huì)產(chǎn)生不同的結(jié)論。硒作為植物有益元素，在促進(jìn)葡萄生長(zhǎng)上也起到一定的作用，這可能是硒促進(jìn)了IAA 的合成導(dǎo)致的，王海波等[27]研究指出有機(jī)硒處理對(duì)葡萄IAA 含量產(chǎn)生一定的促進(jìn)作用。

褪黑素是一種強(qiáng)大的抗氧化劑，在植物中可以防止植物氧化脅迫[28]。孫協(xié)平等研究表明，外源硒對(duì)甜櫻桃葉片褪黑素含量有一定的調(diào)控作用[29]。從5-羥色胺合成褪黑素還需經(jīng)過一系列酶促反應(yīng)，涉及主要酶有SNAT、ASMT、CAMT、AANAT[11-12,28]，其中AANAT 是褪黑素合成的關(guān)鍵酶[30]。褪黑素的合成場(chǎng)所主要是線粒體和葉綠體[28]。本研究中葉片SNAT和AANAT活性均高于根系，而ASMT和CAMT活性均低于根系，存在器官差異，而且富硒酵母處理僅對(duì)褪黑素合成少部分酶活性（SNAT、ASMT）產(chǎn)生顯著影響。學(xué)術(shù)界對(duì)此也存在明顯的爭(zhēng)議，有研究表明硒能夠促進(jìn)褪黑素合成，也有研究表明硒與褪黑素之間不存在必然聯(lián)系[31-32]。因此硒能否促進(jìn)褪黑素的合成仍需要進(jìn)一步研究。