彭秋菊, 趙 姍, 孫 冉, 張 素, 李 祝

(貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院 山地植物資源保護(hù)與保護(hù)種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點實驗室山地生態(tài)與農(nóng)業(yè)生物工程協(xié)同創(chuàng)新中心，貴陽 550025)

糠醛作為一種呋喃化合物，年需求量巨大，是近十年研究最多的生物質(zhì)平臺化合物之一，其分子中具有呋喃環(huán)和醛基，化學(xué)性質(zhì)活潑，為眾多化學(xué)品的前體或衍生物[1]。以糠醛為原料直接或間接衍生出的化工產(chǎn)品達(dá)1 600多種, 應(yīng)用涉及醫(yī)藥、農(nóng)藥、樹脂、食品、香料等眾多領(lǐng)域[2]。在農(nóng)藥領(lǐng)域，糠醛常用于多種農(nóng)藥合成的前體化合物，比如2-呋喃丙烯醛(殺蟲劑)、環(huán)戊酮(滅菌劑)和1,4-二氧喹喔啉甲醛雙腙(具有抗菌活性)等[3-5]。此外，糠醛本身還具有殺菌作用，顧振華[6]、Intisar等[7]報道了糠醛具有抑菌活性。

近年來，利用黑曲霉聯(lián)合固體酸水解花生殼制備糠醛[8]，引起廣泛關(guān)注，黑曲霉是一種低等真核微生物，對環(huán)境的營養(yǎng)要求較低，培養(yǎng)基中含有碳氮源、磷、鉀、鎂等元素就能生長良好，是一種常用的安全菌種，由于自身及其代謝產(chǎn)物對環(huán)境無污染、安全，且具備很多活性酶系等優(yōu)點，在生物質(zhì)資源化利用中有著明顯的優(yōu)勢[9]。目前，相關(guān)文獻(xiàn)表明黑曲霉可以作為一種生防菌株拮抗病原菌。劉超等[10]篩選出1株對稻瘟病菌具有很強抑制作用的菌株黑曲霉JS-1，彭閣等[11]從根際土壤分離出黑曲霉，對煙草黑脛病菌也具有較好的抑制效果。黑曲霉作為一種生防菌，主要來源于黑曲霉所產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物對病原菌的拮抗作用。黑曲霉的代謝產(chǎn)物對茄病鐮刀菌、根癌農(nóng)桿菌和青枯雷爾氏菌等具有抑制作用[12-14]。張素等[15]與趙妗頤[16]等發(fā)現(xiàn)黑曲霉超臨界萃取物(SE)對齊整小核菌和鏈格孢菌具有一定的拮抗作用，SE中5-羥甲基糠醛含量最多，但其抑菌效果并不明顯，因此可以推測SE中含量較低的糠醛，具有較好的抑菌活性。

微生物產(chǎn)糠醛的相關(guān)報道較少，而實驗室前期發(fā)現(xiàn)糠醛為黑曲霉的主要抑菌物質(zhì)之一并建立了測定方法，但測定的含量較低[17]。為穩(wěn)定黑曲霉產(chǎn)糠醛的培養(yǎng)體系，本次實驗通過響應(yīng)面分析法(RSM)優(yōu)化培養(yǎng)條件。響應(yīng)面分析法是一種較好的試驗設(shè)計方法，被廣泛應(yīng)用于培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化中[18]。本研究旨在通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化黑曲霉產(chǎn)糠醛的培養(yǎng)條件，為利用最佳的培養(yǎng)基條件優(yōu)化黑曲霉產(chǎn)糠醛的含量提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與培養(yǎng)基

黑曲霉(Aspergillusniger)xj：來源于李祝等[19]首次從果樹根系土壤中分離得到，現(xiàn)保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，CCTCC編號：M206021，專利公開號：CN 1847388。

PDA固體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，馬鈴薯200 g/L，瓊脂20 g/L，pH 7.0，高壓蒸汽滅菌鍋中121 ℃滅菌30 min。

PDB液體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，馬鈴薯200 g/L，pH 7.0，高壓蒸汽滅菌鍋中121 ℃滅菌30 min。

1.1.2 試劑

1 g/L吐溫-80：吸取0.1 g吐溫-80于99 mL蒸餾水中，得到0.1%吐溫-80工作液。

體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇：分別量取等量的無水乙醇和蒸餾水混合，搖勻備用。

1.2 方法

1.2.1 制備孢子懸浮液

將活化的黑曲霉接種于PDA平板上，26 ℃培養(yǎng)7 d后無菌條件下利用1 g/L 吐溫-80溶液沖洗孢子并過濾制備孢子懸浮液。參照袁洪威等[20]用分光光度法測定黑曲霉孢子濃度的方法對孢子計數(shù)后置于4 ℃冰箱中備用。

1.2.2 高效液相色譜法測定黑曲霉發(fā)酵液中糠醛的含量

參照張素等[17,21]利用HPLC測定黑曲霉產(chǎn)糠醛的含量。具體步驟：將斜面試管保藏好的黑曲霉，活化之后制成均一孢子懸液，將孢子懸液以體積分?jǐn)?shù)為8%～12%接種于發(fā)酵瓶中培養(yǎng)7 d，10 000 r/min離心15 min取上清液。將上清液用300 mL乙醚萃取(分2次進(jìn)行，萃取后得到200 mL乙醚)，自然揮干乙醚，再用6 mL甲醇溶解后12 000 r/min離心2 min取上清液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后進(jìn)行HPLC分析。色譜條件：Spheriorb C18色譜柱(5 μm, 4.6 mm×150 mm)，以乙睛∶0.1%乙酸水 (冰乙酸調(diào)) =10∶90 (體積比)為流動相，柱溫30 ℃，流速為1.0 mL/min，檢測波長λ=277 nm。

1.2.3 糠醛標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

參照張素等[17]利用HPLC測定黑曲霉菌絲體中糠醛含量。略微進(jìn)行修改：稱取糠醛標(biāo)準(zhǔn)品1 mg，制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。將其稀釋成為質(zhì)量濃度為1、5、10、20和40 μg/mL，用上述條件進(jìn)行測定。橫坐標(biāo)為質(zhì)量濃度 (x，μg/mL)，縱坐標(biāo)為峰面積 (y)。

1.2.4 培養(yǎng)基優(yōu)化

單因素試驗主要以淀粉、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和甘露醇為碳源，濃度設(shè)置為10、20、40、60和80 g/L；以硝酸鈉、硝酸鉀、尿素、亞硝酸鈉、硫酸銨為氮源，濃度設(shè)置為0.5、1、2、3和5 g/L；pH值設(shè)置為3、5、7、9和11；溫度設(shè)置為18 ℃、22 ℃、26 ℃、30 ℃和34 ℃；轉(zhuǎn)數(shù)設(shè)置為90、120、150、180和210 r/min等5個變量考察各個因素對黑曲霉發(fā)酵液產(chǎn)糠醛含量的影響。

1.2.5 響應(yīng)面分析法優(yōu)化培養(yǎng)條件

(1)Plackett-Burman(PB)正交設(shè)計。采用Minitab 17 軟件中的 Plackett-Burman設(shè)計法，對碳源、氮源、pH值、溫度、轉(zhuǎn)數(shù)等5個因素進(jìn)行試驗設(shè)計，以各個因素的正效應(yīng)高、負(fù)效應(yīng)低(-1)兩個水平進(jìn)行篩選，篩選出對黑曲霉發(fā)酵液中糠醛含量作用顯著的因素(表1)。

表1 PB試驗因素及水平Table1 PB experimental factors and levels

(2)最陡爬坡試驗。根據(jù)PB試驗結(jié)果確定最陡爬坡的方向與步長。分別以葡萄糖40 g/L、尿素2 g/L、pH值7 等3個因素為最陡爬坡初始值，步長分別為15、0.5 和0.5 g/L，試驗設(shè)計細(xì)節(jié)如表2。

表2 黑曲霉產(chǎn)糠醛的最陡爬坡設(shè)計方案Table 2 Design scheme of steepest climb for furfural production by A. niger

(3) 響應(yīng)面分析法。根據(jù)最陡爬坡試驗結(jié)果，選取對黑曲霉產(chǎn)糠醛影響較為顯著的葡萄糖濃度、尿素濃度、pH值等3個因素，以黑曲霉產(chǎn)糠醛的產(chǎn)量為響應(yīng)值，建立三因素三水平的試驗設(shè)計(表3)。

表3 Box-Behnken試驗因素與水平Table 3 Box-Behnken experimental factors and levels

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

利用HPLC制得的糠醛標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1可知，糠醛標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=61.57x+79.732(R2=0.999)，糠醛質(zhì)量濃度的線性范圍0～40 μg/mL之間呈良好的線性關(guān)系，滿足樣品測試要求。

圖1 糠醛HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 HPLC standard curve of furfaral

2.2 單因素優(yōu)化試驗

由圖2(a)可知，在不同的碳源下黑曲霉產(chǎn)糠醛的量不同，在添加的5種碳源中，葡萄糖為唯一碳源時，黑曲霉產(chǎn)糠醛的量最大，故選擇葡萄糖作為最優(yōu)碳源。選取葡萄糖濃度為10、20、40、60和80 g/L進(jìn)行試驗，發(fā)現(xiàn)當(dāng)濃度為40、60和80 g/L，黑曲霉提高產(chǎn)糠醛的能力明顯增大，分別達(dá)到2.88、2.85 和2.88 μg/mL[圖2(b)]。由圖2(c)可知，不同氮源對黑曲霉產(chǎn)糠醛的影響結(jié)果表明，5種氮源都可以被利用，但利用的能力存在著明顯不同。以尿素為氮源時，黑曲霉產(chǎn)糠醛含量影響最大(3.28 μg/mL)，選取尿素濃度為0.5、1、2、3、5 g/L進(jìn)行試驗，當(dāng)濃度為3 g/L，黑曲霉產(chǎn)糠醛產(chǎn)量最高，含量為3.78 μg/mL[圖2(d)]。微生物只有在適宜pH條件下才能良好生長，當(dāng)培養(yǎng)基初始pH為中性(pH 7)時，黑曲霉產(chǎn)糠醛的量較高，含量為3.7 μg/mL [圖2(e)]。當(dāng)培養(yǎng)溫度為26 ℃時糠醛含量為3.92 μg/mL，隨著培養(yǎng)溫度的升高，發(fā)酵液中糠醛含量開始減少，34 ℃時降到0.62 μg/mL，因此確定黑曲霉產(chǎn)糠醛的最適溫度為26 ℃[圖2(f)]。在培養(yǎng)過程中，搖瓶轉(zhuǎn)速是為了給微生物提供氧量，轉(zhuǎn)速過高或過低都不利微生物的生長，當(dāng)轉(zhuǎn)數(shù)在150 r/min左右時，黑曲霉產(chǎn)糠醛含量較高，為3.91 μg/mL[圖2(g)]。

不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)。圖2 單因素優(yōu)化試驗結(jié)果Figure 2 Experimental results of by single-factor optimization

2.3 PB設(shè)計結(jié)果

根據(jù)PB設(shè)計試驗所得的數(shù)據(jù)，用Minitab17.0軟件分析得出對應(yīng)的一階回歸方程：

y=2.440+0.372A+0.409B+0.552C-

0.005D+0.045E

試驗設(shè)計及結(jié)果如表4，各因素對響應(yīng)值Y的影響效果分析如表5，存在3個變量的P值小于0.05[葡萄糖(A)、尿素(B)和初始pH值(C)]，表明它們對糠醛產(chǎn)量影響顯著。2個變量的P值大于0.05[溫度(D)、轉(zhuǎn)速(E)]，表示它們對糠醛產(chǎn)量影響不顯著。

表4 PB試驗設(shè)計方案及結(jié)果Table 4 PB experimental design scheme and results

表5 回歸方程的變量分析Table 5 Variable analysis of regression equation

因此選用葡萄糖(A)、蔗糖(B)、初始pH值(C)等3個因素做進(jìn)一步的最陡爬坡試驗。

2.4 最陡爬坡試驗優(yōu)化

選定葡萄糖(A)、尿素(B)、pH值(C)等3個因素為自變量，以黑曲霉產(chǎn)糠醛含量為響應(yīng)值，設(shè)計最陡爬坡試驗。其試驗結(jié)果如表6所示。即以葡萄糖濃度70 g/L、尿素濃度3 g/L、初始pH值8為組合中心點進(jìn)行響應(yīng)面分析。

表6 黑曲霉產(chǎn)糠醛的最陡爬坡設(shè)計及結(jié)果Table 6 Design and results of steepest ascent for furfural production by A. niger

2.5 響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化

2.5.1 響應(yīng)模型的建立與分析

在PB試驗、最陡爬坡試驗基礎(chǔ)上，用中心組合設(shè)計進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化。以黑曲霉產(chǎn)糠醛含量為響應(yīng)值，用Minitab17.0軟件設(shè)計出三因素三水平的Box-Behnken試驗，試驗結(jié)果如表7，對表7中數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到以黑曲霉產(chǎn)糠醛含量(y)為響應(yīng)值的二次多項式回歸方程：

y=3.925+0.217A+0.113B+0.099C-0.128A2-

0.374B2-0.077C2-0.094AB+0.112AC+0.090BC

其中，y為響應(yīng)值(黑曲霉產(chǎn)糠醛含量)；A、B、C分別代表葡萄糖、尿素、pH值。各因素對黑曲霉發(fā)酵液中糠醛含量的方差分析如表8，F(xiàn)值分析結(jié)果表明：葡萄糖、尿素和pH值等3個要素的影響極顯著(P<0.01)。

表7 黑曲霉產(chǎn)糠醛的響應(yīng)面結(jié)果Table 7 Response surface results of furfural production by A. niger

表8 Box-Behnken 試驗設(shè)計回歸分析結(jié)果Table 8 Regression analysis of experimental results based on Box-Behnken design

2.5.2 響應(yīng)面分析

利用Minitab17.0軟件對表8中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合。響應(yīng)面圖和等高線圖能直接反映出各因素間對黑曲霉產(chǎn)糠醛含量的交互作用情況，響應(yīng)面坡度越陡峭，表明因素作用越顯著。由圖3可知，葡萄糖與尿素、pH與葡萄糖以及尿素與pH的相互作用較顯著，由等高線分析可知，3個因素對黑曲霉產(chǎn)糠醛含量的影響呈現(xiàn)：葡萄糖>尿素>pH。

(a)葡萄糖; (b)尿素;(c)pH值。Y: 糠醛含量/(μg/ mL)。圖3 葡萄糖與尿素、pH與葡萄糖和尿素與pH的響應(yīng)面與等高線圖Figure 3 Response surface and contour plot of glucose and urea, pH and glucose and urea and pH

2.5.3 確定最佳培養(yǎng)條件與驗證回歸模型

對數(shù)學(xué)模型進(jìn)行分析，得到最優(yōu)培養(yǎng)條件為葡萄糖80 g/L、尿素3.03 g/L、pH值8.2。發(fā)酵液中糠醛含量預(yù)測最大值為4.156 μg/mL。用響應(yīng)面分析所得的最優(yōu)培養(yǎng)條件結(jié)合單因素試驗得到的優(yōu)化條件進(jìn)行驗證，得到糠醛含量的3次試驗平均值為4.094 μg/mL，和預(yù)測的理論值只相差0.06 μg/mL，結(jié)果可靠。

3 討論與結(jié)論

微生物產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物其生成效率與黑曲霉菌株自身特性相關(guān)，也受培養(yǎng)條件的影響，因此培養(yǎng)基營養(yǎng)成分及條件對黑曲霉產(chǎn)糠醛是非常重要的。李麗等[22]采用單因子實驗研究碳源、氮源、初始pH值、溫度和轉(zhuǎn)速等因子對解淀粉芽孢桿菌M1產(chǎn)芽孢量的影響。鄧雪萍[23]利用碳源、氮源、初始pH值、溫度和搖瓶轉(zhuǎn)速等因子對枯草芽孢桿菌EF-B01菌株進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化。說明碳源、氮源、pH值、溫度及搖瓶轉(zhuǎn)速是進(jìn)行培養(yǎng)的常見要素。本研究利用單因素試驗對這5種要素進(jìn)行評估。5種碳源中，黑曲霉產(chǎn)糠醛最有效的碳源是葡萄糖，能夠有效促進(jìn)黑曲霉的生長，分析原因可能是葡萄糖是一種速效碳源，有助于菌體的生長繁殖。這與Dyal等[24]的發(fā)現(xiàn)被孢霉菌株也是較容易利用單糖一致。5種氮源中，尿素對黑曲霉產(chǎn)糠醛含量影響最佳，尿素作為常見氮源，可為微生物的生長提供更利于吸收利用的營養(yǎng)成分[25]。此外，王福榮[26]和白愛枝等[27]發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中pH值、培養(yǎng)溫度和搖瓶轉(zhuǎn)速對微生物的生長繁殖和代謝產(chǎn)物的積累有重要影響，是培養(yǎng)過程中控制優(yōu)化的重要參數(shù)。因此本次試驗考察碳源、氮源、pH值、溫度和搖瓶轉(zhuǎn)速對黑曲霉產(chǎn)糠醛的條件，為黑曲霉產(chǎn)抗菌物質(zhì)的培養(yǎng)條件奠定基礎(chǔ)。

傳統(tǒng)的數(shù)理統(tǒng)計方法包括線性回歸分析和正交試驗設(shè)計，它們雖已廣泛應(yīng)用于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和科學(xué)研究，但仍存在一些缺點，而響應(yīng)面分析方法在很大程度上彌補了這兩種方法的不足[28-29]。目前，已有報道利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化黑曲霉產(chǎn)代謝物的條件。李祝等[30]采用響應(yīng)面法優(yōu)化黑曲霉xj產(chǎn)抗菌物質(zhì)的培養(yǎng)基條件，優(yōu)化后的發(fā)酵液抗菌活性提高了83%；魏寶東等[31]利用響應(yīng)面法優(yōu)化黑曲霉代謝產(chǎn)物誘導(dǎo)子的誘導(dǎo)條件來產(chǎn)納他霉素，優(yōu)化后其產(chǎn)量提高了1.68倍；馮培勇等[32]利用響應(yīng)面法對黑曲霉產(chǎn)纖維素酶的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后纖維素酶活力提高34.4%。以上都說明利用響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化，能不同程度地提高產(chǎn)物的活性及產(chǎn)量。而在本研究中，通過響應(yīng)面法優(yōu)化黑曲霉產(chǎn)糠醛的培養(yǎng)條件，最優(yōu)培養(yǎng)條件為葡萄糖80 g/L、尿素3.03 g/L、pH 8.2、溫度26 ℃、轉(zhuǎn)速150 r/min，培養(yǎng)3 d后黑曲霉發(fā)酵液中糠醛含量達(dá)到4.094 μg/mL，較優(yōu)化前提高20.2%。優(yōu)化后的含量值不高，原因可能是糠醛作為黑曲霉所產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，且本身具有抑菌作用，優(yōu)化后含量過高會對黑曲霉本身產(chǎn)生不利的影響。該結(jié)果表明在不影響黑曲霉本身的情況下對糠醛進(jìn)行優(yōu)化，可建立一種良好的培養(yǎng)條件體系，同時豐富了糠醛作為抑菌活性物質(zhì)的相關(guān)報道，為防治植物病害方面奠定基礎(chǔ)。