汪蕊露， 李 進(jìn)， 王 翀， 劉虎虎， 盧向陽(yáng)， 田 云

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 長(zhǎng)沙410128)

氮素作為有機(jī)分子的重要組成元素，生物體的生長(zhǎng)代謝都離不開(kāi)它的參與。植物從土壤中吸收大量的氮素以維持生命活動(dòng)，而土壤中的氮素含量是衡量土壤生產(chǎn)力大小的主要影響因子[1]，為平衡土壤中氮素流失、提高生產(chǎn)力，需進(jìn)行固氮作用，固氮的主要方式有天然固氮、工業(yè)固氮以及生物固氮，其中生物固氮主要是利用固氮微生物中的酶系統(tǒng)將空氣中的氮?dú)庾兂砂钡淖饔?，生物固氮相比于人工固氮和天然固氮?lái)說(shuō)更廣泛，自然界中主要依靠生物進(jìn)行固氮，這種方式對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的氮素循環(huán)產(chǎn)生重要的作用。

固氮細(xì)菌從生物固氮形式來(lái)分主要有3大類(lèi)：聯(lián)合固氮菌、共生固氮菌以及自生固氮菌。聯(lián)合固氮菌因不能與宿主生物體形成特定的固氮共生結(jié)構(gòu)，所以易受病蟲(chóng)害等生物逆境以及干旱等非生物逆境影響，固氮效率較低[2]；共生固氮菌宿主特異性強(qiáng)，只與特定的豆科植物形成根瘤，作用對(duì)象較為單一[3]；自生固氮菌固氮效率較低，且當(dāng)?shù)礉M足自身代謝需求后，剩余氮源便會(huì)抑制固氮菌活性，但自生固氮菌分布廣且適應(yīng)能力強(qiáng)，即使在營(yíng)養(yǎng)匱乏的土壤中也能生存并進(jìn)行固氮。自生固氮菌可通過(guò)體內(nèi)酶系統(tǒng)進(jìn)行催化反應(yīng)，將生成的氮素營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供給植物利用，因此可顯著提高農(nóng)作物產(chǎn)量。有研究發(fā)現(xiàn)自生固氮菌具有產(chǎn)植物激素的功能，對(duì)植物的生長(zhǎng)代謝有重要作用[4]，另外還能產(chǎn)有機(jī)酸，可顯著降低土壤中無(wú)效鉀的含量[5]，因此自生固氮菌廣泛應(yīng)用于固氮菌劑中，在取代氮肥的應(yīng)用上擁有廣闊前景，同時(shí)也將對(duì)我國(guó)農(nóng)業(yè)發(fā)展產(chǎn)生重大影響[6]。

本研究從多地采樣篩選出穩(wěn)定性好且適應(yīng)能力強(qiáng)的自生固氮菌并對(duì)其進(jìn)行特性研究，從而為生產(chǎn)應(yīng)用中的固氮菌劑提供更為豐富的固氮菌資源，現(xiàn)階段高效自生固氮菌的篩選已成為農(nóng)業(yè)應(yīng)用的基礎(chǔ)，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展至關(guān)重要。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

本試驗(yàn)所用的材料是2017年12月在湖南長(zhǎng)沙、湖南岳陽(yáng)、山西朔州、浙江寧波、江蘇南京、河南洛陽(yáng)等地植物根際以及淤泥土壤約15～20 cm深處采集的土樣(表1)，采樣量約為1 000 g，各2份，一份樣品放入4℃冰箱保存，另一份樣品進(jìn)行試驗(yàn)。

表1 采樣統(tǒng)計(jì)表

1.2 培養(yǎng)基

無(wú)氮培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基參考文獻(xiàn)[7]配制，生理生化鑒定培養(yǎng)基參考《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[8]配制。

1.3 自生固氮菌的篩選

將選取的土樣分別稱(chēng)取適量樣品并倒入無(wú)菌水，攪拌均勻后放入30 ℃，180 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)30 min，采用梯度稀釋法將培養(yǎng)液稀釋成10-2、10-3、10-4、10-5以及10-2(煮沸10 min)、10-3(煮沸10 min)的懸浮液，將不同濃度懸浮液在以蔗糖為唯一碳源的固體無(wú)氮培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布，經(jīng)多次平板劃線進(jìn)一步純化、分離得到單菌落。

利用乙炔還原法，在裝有液體無(wú)氮培養(yǎng)基的血清瓶中接種菌株并打入乙炔，培養(yǎng)1 d后吸取0.1 mL瓶中氣體打至氣相色譜儀中得到乙烯峰面積，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定菌體蛋白濃度，通過(guò)固氮酶活性計(jì)算公式得出菌株的固氮酶活性。

固氮酶活性=(瓶子上方體積×所測(cè)菌株乙烯峰面積)/(1 nmol乙烯峰面積×瓶?jī)?nèi)氣體體積×菌體蛋白×反應(yīng)時(shí)間)

1.4 自生固氮菌的鑒定

1.4.1 形態(tài)學(xué)觀察及生理生化鑒定

肉眼觀察菌落的形態(tài)特征；生理生化依據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》進(jìn)行鑒定[8]。

1.4.2 16S rDNA序列鑒定

運(yùn)用基因組DNA抽提試劑盒采用磁珠法對(duì)菌株總基因組DNA進(jìn)行提取，之后使用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGCTACCTTGTTACGACTT-3′)對(duì)16S rDNA序列進(jìn)行擴(kuò)增[9]，反應(yīng)體系如表2所示，PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化回收。最后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)到感受態(tài)細(xì)胞中并送去測(cè)序，送回的序列使用NCBI進(jìn)行序列比對(duì)并使用Mega 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察、生理生化鑒定結(jié)果對(duì)所篩菌株的種屬進(jìn)行確定。

表2 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系

1.5 生長(zhǎng)條件的優(yōu)化

通過(guò)碳源、氮源、初始pH、溫度、轉(zhuǎn)速和蔗糖濃度等單因素生長(zhǎng)優(yōu)化的試驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合Box-Behnken設(shè)計(jì)的原則，最終確定3個(gè)因素以A(蔗糖濃度)、B(轉(zhuǎn)速)、C(溫度)表示，以波長(zhǎng)600 nm處菌液的吸光值(Y)為考察指標(biāo)，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)[10]，其中中水平為單因素試驗(yàn)結(jié)果中的最佳條件，也稱(chēng)為0水平[11]，試驗(yàn)設(shè)計(jì)中所用的因素與水平見(jiàn)表3。

表3 菌株C-5-2生長(zhǎng)條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平

1.6 數(shù)據(jù)處理

單因素試驗(yàn)應(yīng)用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，響應(yīng)面試驗(yàn)使用Design-Expert軟件進(jìn)行二次多元回歸擬合及方差分析檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 自生固氮菌的篩選

從湖南長(zhǎng)沙、湖南岳陽(yáng)、山西朔州、浙江寧波、江蘇南京、河南洛陽(yáng)植物根際或淤泥土壤采集10份土樣，進(jìn)行富集培養(yǎng)后，利用稀釋濃度梯度法以及平板劃線法進(jìn)行固氮菌的分離與篩選，最終得到500多株單菌，進(jìn)一步將分離得到的菌株接種至液體無(wú)氮培養(yǎng)基中，得到可生長(zhǎng)的菌株93株，其中有株具有固氮酶活性，分別編號(hào)為C-5-2、A-5-11、HQ-5，試驗(yàn)結(jié)果表明從山西省朔州市玉米根際土壤篩選出的自生固氮菌C-5-2具有更高的固氮酶活性，達(dá)到140.14 nmol C2H4/mg.protein.hr。

2.2 自生固氮菌C-5-2的鑒定

固氮菌C-5-2的菌株形態(tài)如圖1所示，革蘭氏染色顯微鏡觀察如圖2所示，表4為菌株形態(tài)以及生理生化特征結(jié)果。進(jìn)一步對(duì)16S rDNA測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對(duì)，構(gòu)建16S rDNA序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖3)，對(duì)菌株序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)菌株C-5-2與Azotobacter-chroococcumATCC 9043T以及Azotobacterchroococ-cumsubsp.ChroococcumIAM 12666T的相似性都達(dá)到99%，綜合形態(tài)學(xué)觀察、生理生化鑒定、16S rDNA序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果表明：菌株C-5-2鑒定為Azotobacter屬，命名為Azotobactersp. strain C-5-2。

圖1 C-5-2菌株形態(tài)平板圖Figure 1 Morphological plate map of strain C-5-2

圖2 菌株C-5-2革蘭氏染色顯微鏡觀察Figure 2 Microscopic observation of strain C-5-2 with Gram stain

表4 菌株的形態(tài)與生理生化特征Table 4 Morphological and physiological and biochemicalcharacteristics of the strain

圖3 菌株C-5-216S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Figure 3 16S rDNA phylogenetic tree of strain C-5-2

2.3 生長(zhǎng)條件的優(yōu)化

2.3.1 單因素優(yōu)化

由圖4(a)所示碳源的利用情況可看出可溶性淀粉、乳糖以及蔗糖中固氮菌的生長(zhǎng)速度較快，另外肉眼觀察到在這幾種碳源下培養(yǎng)后的菌株菌體形態(tài)良好，實(shí)際研究過(guò)程考慮成本等各方面因素選用蔗糖進(jìn)行試驗(yàn)；氮源的利用情況如圖4(b)所示，在無(wú)氮、牛肉膏以及酵母提取物中生長(zhǎng)情況良好，在實(shí)際試驗(yàn)過(guò)程考慮各方面因素選用無(wú)氮條件進(jìn)行研究。如圖4(c)所示，菌株C-5-2在初始pH 9.0的條件下呈現(xiàn)較好的生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)，且初始pH 9.0與10.0的條件下的生長(zhǎng)情況相似，另外對(duì)菌株C-5-2在堿性環(huán)境下培養(yǎng)后的溶液pH進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)溶液pH呈中性；如圖4(d)所示，菌株在溫度為30 ℃的條件下生長(zhǎng)最佳，且在35 ℃時(shí)同樣可促進(jìn)菌株生長(zhǎng)；如圖4(e)所示，轉(zhuǎn)速在150 r/min時(shí)，菌株生長(zhǎng)的速度最快且菌株生長(zhǎng)情況最佳，轉(zhuǎn)速為200 r/min時(shí)同樣有利于菌株的生長(zhǎng)，而轉(zhuǎn)速低于100 r/min時(shí)則會(huì)抑制菌株生長(zhǎng)；如圖4(f)所示，蔗糖濃度在10 g/L時(shí)菌株生長(zhǎng)情況最佳，在15 g/L的蔗糖濃度下也表現(xiàn)出良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，隨著蔗糖濃度的升高對(duì)菌株生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用。

(a)碳源對(duì)菌株C-5-2生長(zhǎng)條件的優(yōu)化結(jié)果；(b)氮源對(duì)菌株C-5-2生長(zhǎng)條件的優(yōu)化結(jié)果；(c)pH對(duì)菌株C-5-2生長(zhǎng)條件的優(yōu)化結(jié)果；(d)溫度對(duì)菌株C-5-2生長(zhǎng)條件的優(yōu)化結(jié)果；(e)轉(zhuǎn)速對(duì)菌株C-5-2生長(zhǎng)條件的優(yōu)化結(jié)果；(f)蔗糖濃度對(duì)菌株C-5-2生長(zhǎng)條件的優(yōu)化結(jié)果。圖4 單因素生長(zhǎng)條件的優(yōu)化Figure 4 Optimization of single factor growth conditions

綜上所述，自生固氮菌C-5-2的單因素生長(zhǎng)條件確定為初始pH 9.0、溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速150 r/min、蔗糖濃度10 g/L且在無(wú)氮條件下。

2.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化

(1)影響Azotobactersp.strain C-5-2生長(zhǎng)的主要因素分析。使用Design-Expert軟件進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到蔗糖濃度(g/L)、轉(zhuǎn)速(r/min)以及溫度(℃)與Azotobactersp.strain C-5-2培養(yǎng)后的OD600的二次多項(xiàng)回歸方程：

Y=1.32+0.023A-0.059B+0.31C+0.035AB-0.083AC+0.11BC-0.11A2-0.14B2-0.35C2

對(duì)以上試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，由表5可知，模型P<0.05，表明模型方程達(dá)到顯著水平；失擬項(xiàng)P=0.0610>0.05，表明差異不顯著，說(shuō)明本試驗(yàn)無(wú)其他因素的顯著影響，模型是適合的，可用于Azotobactersp.strain C-5-2生長(zhǎng)條件的優(yōu)化試驗(yàn)；另外AB以及AC的P值都大于0.05，說(shuō)明蔗糖濃度與轉(zhuǎn)速以及蔗糖濃度與溫度的交互作用對(duì)菌株C-5-2生長(zhǎng)情況影響不顯著，而B(niǎo)C的P值<0.05，則說(shuō)明溫度與轉(zhuǎn)速的交互作用對(duì)菌株C-5-2生長(zhǎng)情況影響顯著。模型的決定系數(shù)R2=0.965 1，表示菌株響應(yīng)值同各因素實(shí)際值以及預(yù)測(cè)值之間具有良好的擬合度，且可信度較高。

(2)響應(yīng)曲面分析。通過(guò)響應(yīng)面軟件分析得到三因素互作的響應(yīng)曲面，如圖5所示，模型的3D曲面以及等高線反映A(蔗糖濃度)、B(轉(zhuǎn)速)、C(溫度)3個(gè)因素的交互作用對(duì)Azotobactersp.strain C-5-2生長(zhǎng)情況的影響趨勢(shì)，當(dāng)單因素的數(shù)值增大時(shí)，響應(yīng)面值也相應(yīng)增加，當(dāng)響應(yīng)面值達(dá)到最佳之后，隨著單因素?cái)?shù)值的增加，響應(yīng)面值又開(kāi)始下降[12]，因此能夠獲得A(蔗糖濃度)、B(轉(zhuǎn)速)、C(溫度)這3種因素的極值。分析表明Azotobactersp.strain C-5-2最優(yōu)生長(zhǎng)條件如下：蔗糖濃度10 g/L、轉(zhuǎn)速148 r/min以及溫度32℃。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，在pH 9.0的液體無(wú)氮培養(yǎng)基中接種2%的菌液培養(yǎng)20 h后菌株的OD600可達(dá)到1.42。

表5 分析回歸和方差結(jié)果

(a)(b)分別為蔗糖濃度與轉(zhuǎn)速交互作用的3D曲面和等高線；(c)(d)分別為蔗糖濃度與溫度交互作用的3D曲面和等高線；(e)(f)分別為轉(zhuǎn)速與溫度交互作用的3D曲面和等高線。圖5 生長(zhǎng)條件的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)Figure 5 Response surface optimization test for culture conditions

3 討論與結(jié)論

自生固氮菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮重要作用。方華舟等[13]從稻田土壤中篩選得到固氮菌屬的菌株，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)水稻有明顯的促生效果。盧秉林等[14]研究發(fā)現(xiàn)圓褐固氮菌N45和生物氮肥在與中量化學(xué)氮肥配施時(shí)能增加小麥的產(chǎn)量和改善小麥的品質(zhì)。成艷紅等[15]將紅壤中篩出的自生固氮菌CM12進(jìn)行玉米盆栽試驗(yàn)，研究發(fā)現(xiàn)施加自生固氮菌劑的玉米土壤中MBN的含量與對(duì)照相比提高了2.37倍，同時(shí)增加了玉米植株的氮素含量。自生固氮菌不與植物形成宿主關(guān)系且適應(yīng)能力強(qiáng)，所以在實(shí)際生產(chǎn)中可廣泛應(yīng)用，同時(shí)因其可提高土壤品質(zhì)、增加農(nóng)作物產(chǎn)量以及綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)已成為21世紀(jì)新型肥料發(fā)展的重要方向之一[16]，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)自生固氮菌的篩選尤為重視，何建清等[17]從青稞根際篩選出6株促生效果較好的固氮菌，其中包括假單胞菌屬、無(wú)色桿菌屬以及根瘤菌屬等；王娟娟[18]從小麥中篩出20株固氮菌，其中有11株屬于固氮菌屬(Azotobactersp.)；Tikhonova等[19]在泥炭蘚中篩選出一株自生固氮菌株Azospirillumpalustre，編號(hào)為B2T；Siddiqi等[20]從活性污泥中篩選出自生固氮菌株Ciceribacterazotifigens等。研究學(xué)者致力于篩選出更多的菌株，以豐富固氮微生物的種類(lèi)，為微生物氮肥提供更多的可能性。

現(xiàn)階段以聯(lián)合固氮菌和共生固氮菌的研究?jī)?nèi)容較多，自生固氮菌的研究相對(duì)較少，但自生固氮菌以良好的適應(yīng)能力以及不依附于植物生存等優(yōu)勢(shì)較為明顯，好氣性的自生固氮菌在固氮方面能力較強(qiáng)[21]，此類(lèi)固氮菌在全國(guó)各地的士壤中都有分布[22]，同時(shí)它屬于植物促生菌(PGPR)，可促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育，具有固氮、溶磷解鉀以及分泌植物所需的生長(zhǎng)激素等作用。自生固氮菌相比于共生固氮菌根瘤菌來(lái)說(shuō)固氮作用偏低[23]，但其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中有巨大的應(yīng)用潛力，可通過(guò)生物固氮為小麥、玉米等多種農(nóng)作物提供氮素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[24-26]，因此篩選出具有穩(wěn)定性能以及高效固氮能力的自生固氮菌對(duì)農(nóng)業(yè)發(fā)展具有重要的意義。

本試驗(yàn)從山西朔州的玉米根際土壤中篩選到一株固氮酶活性達(dá)140.14 nmol C2H4/mg.protein.hr自生固氮菌C-5-2，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化鑒定以及16S rDNA序列鑒定為Azotobacter屬，命名為Azotobactersp.strain C-5-2，自生固氮菌C-5-2的篩選為固氮菌的研究提供了材料，同時(shí)可高效地應(yīng)用于固氮菌劑中進(jìn)行資源化利用。在碳源氮源的利用方面，基本與同屬的固氮菌利用情況相似[27]，在蔗糖為碳源以及無(wú)氮的條件下都能較好生長(zhǎng)，因此可在生產(chǎn)應(yīng)用中簡(jiǎn)化培養(yǎng)條件并降低生產(chǎn)成本；生長(zhǎng)條件的優(yōu)化結(jié)果表明自生固氮菌C-5-2在蔗糖濃度10 g/L、溫度32 ℃、轉(zhuǎn)速148 r/min且pH 9.0時(shí)生長(zhǎng)情況最佳，其中pH的優(yōu)化試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)菌株在中性以及弱堿性環(huán)境中都能進(jìn)行生長(zhǎng)且在弱堿性環(huán)境中生長(zhǎng)最佳，菌株易產(chǎn)酸，在堿性溶液中培養(yǎng)后呈現(xiàn)中性狀態(tài)，而現(xiàn)階段報(bào)道的菌株適應(yīng)的最佳pH 5.5～7.2[19,28]，因此本試驗(yàn)篩選菌株與一般的在堿性環(huán)境下難以生存的菌株形成差異，在菌肥應(yīng)用中能更好地用于不同酸堿度的土壤，因此可以更廣泛地應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。