闕 斌 常佩芬 周紅梅 馮思婷 王 曉 郭 倩 聶紹平※

（1.首都醫(yī)科大學附屬北京安貞醫(yī)院冠心病中心，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院心內(nèi)科，北京 100700；3.北京市心肺血管疾病研究所，北京 100029）

心絞痛（AP）是由于冠狀動脈供血不足，導致心肌細胞出現(xiàn)暫時性缺血缺氧而導致的以胸痛為主要癥狀的臨床綜合征，是冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。–HD）最常見的表現(xiàn)。我國CHD 患病人數(shù)每年以20%的速度增長，其病死率占循環(huán)系統(tǒng)疾病的10%～20%[1]。本病隸屬中醫(yī)“胸痹”“真心痛”范疇，多由心脈痹阻而誘發(fā)疼痛[2]，故活血化瘀是臨床胸痹心痛的主要治法之一。

葛根-丹參是《施今墨對藥》中收載的常用藥對，其所針對的病機環(huán)境為瘀血阻滯，病位在血脈或經(jīng)脈[3]。葛根甘平，解肌退熱，通經(jīng)活絡(luò)，擴張心腦血管，改善血液循環(huán)；丹參味苦，性寒，活血祛瘀，通經(jīng)止痛，清心除煩，涼血消癰。二藥配伍，相互促進，活血化瘀，祛瘀生新[4]。葛根可促進血管平滑肌的運動，以推動血液運行；丹參可祛除出血后或血流緩慢所形成的血管內(nèi)外瘀血，以保證血行暢通。該配伍自20 世紀以后成為現(xiàn)代臨床治療心腦血管病變的常用藥對，特別是對于冠心病心絞痛的治療具有較好療效。故本研究基于中藥“多成分、多靶點、多通路”研究思路，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學預測葛根-丹參藥對治療冠心病心絞痛的作用機制，進而篩選有效活性成分、作用靶點及相關(guān)信號通路，為實驗研究及臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 活性化合物及靶標蛋白的篩選 在TCMSP 中分別錄入葛根、丹參進行檢索，按生物利用度（OB≥30%）和類藥性（DL≥0.18）條件篩選出有效成分，通過該數(shù)據(jù)庫導出所選活性成分對應的靶點。然后將導出的靶點導入Unitprot 數(shù)據(jù)庫（https：//www.unitprot.org/），進行基因的標準化處理。

1.2 靶標蛋白基因名的確定及化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 在Genecards（https：//www.genecards.org/）、OMIM（https：//www.omim.org/）數(shù)據(jù)庫中以“Coronary heart disease”“Angina”為關(guān)鍵詞進行檢索，將檢索到的蛋白名稱復制到Uniprot 數(shù)據(jù)庫中進行基因的標準化處理，得到疾病相關(guān)的靶點信息。將在Genecards、OMIM 中檢索得到的CHD 與葛根-丹參藥對的靶點在Venny 2.1 中映射篩選出共同靶點。

1.3 蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將該藥對所涉及的相關(guān)靶點上傳至在線STRING 11.0 軟件（https：//string-db.org/），通過參數(shù)設(shè)置將評分條件設(shè)定為＞0.40，并隱藏圖中孤立的蛋白質(zhì)，最終輸出PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 關(guān)鍵核心基因GO功能注釋及KEGG富集通路分析 為進一步了解上述篩選出的靶標蛋白基因的功能以及在信號通路中的作用，將篩選得到的葛根-丹參作用靶點導入DAVID 數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp），進行GO 功能注釋和KEGG 富集通路分析，并基于R 軟件進行可視化。

2 結(jié)果

2.1 葛根-丹參活性成分的篩選及其作用靶點收集 通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫，檢索出葛根-丹參藥對的所有化學成分，包括丹參202 個、葛根18 個。以O(shè)B≥30%和DL≥0.18為參數(shù)共獲得了69 個滿足條件的化合物，其中丹參為65 個，葛根4 個。

2.2 葛根-丹參藥對與冠心病心絞痛靶點篩選 基于Genecards、OMIM 數(shù)據(jù)庫進行檢索，獲得冠心病心絞痛相關(guān)的疾病靶點7556 個。剔除預測不到靶點的化合物共得到55 個，其中丹參52 個、葛根3 個。將7556 個疾病靶點與55 個藥對成分靶點通過Venny 2.1 軟件取交集后得到疾病-藥物成分共同靶點72 個。

2.3 潛在作用靶點的蛋白互作網(wǎng)絡(luò) 運用STRING 11.0構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，得到的PPI 網(wǎng)絡(luò)包含72 個節(jié)點，638條邊，平均度值為17.7，其中節(jié)點表示靶標蛋白，每條邊表示靶標蛋白與蛋白之間的相互作用關(guān)系。根據(jù)節(jié)點的度值繪制出大于平均度值且較高的30 個關(guān)鍵蛋白質(zhì)節(jié)點。度值排名前7 位的是IL6、FOS、CASP3、EGFR、JUN、MYC、VEGFA。見圖1。

2.4 潛在核心靶點的GO功能注釋與KEGG富集通路分析 利用DAVID 平臺對潛在功能靶點進行基因功能分析，得到112 個GO 條目，涉及分子功能（MF）、生物過程（BP）和細胞組成（CC）3 個部分。DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、核受體活性、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性等排列靠前，結(jié)果見圖2（根據(jù)P 值列出前20 個）。KEGG 富集通路結(jié)果共得到119 條通路，主要包括IL-17 信號通路、TNF 信號通路、PI3K-AKT 信號通路等。見圖3。

圖3 葛根-丹參藥對治療冠心病心絞痛KEGG富集通路氣泡圖

3 討論

研發(fā)表明，葛根-丹參合用具有防治心肌梗死、防治動脈硬化、抗炎、抗氧化、抑制細胞凋亡等藥理作用[5，6]。丹參-葛根藥對在臨床應用廣泛，以葛根為主要成分研制的愈風寧心滴丸具有抗血小板聚集，擴張冠狀動脈血管，降低心肌耗氧量等作用[7]。而從丹參中提取的單體化合物丹參酮ⅡA 已被多項研究證實可抑制血管平滑肌細胞增殖和遷移，進而起到保護血管內(nèi)皮細胞的作用[8]。

PPI 網(wǎng)絡(luò)分析預測，網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵蛋白節(jié)點主要包括IL-6、FOS、CASP3、EGFR 等。經(jīng)皮冠狀動脈內(nèi)介入治療術(shù)的術(shù)后再狹窄是局部血管損傷后的一種修復反應，涉及炎癥反應、血管平滑肌細胞過度增殖及凋亡減少等多種因素參與。IL-6 通過促進機體全身炎癥反應及局部凝血作用，進而刺激血管平滑肌細胞增生，使動脈粥樣硬化斑塊增長且趨于不穩(wěn)定[9]。FOS 基因可編碼c-Fos 蛋白的合成，研究發(fā)現(xiàn)c-FOS 蛋白異常表達來源于心肌的缺血、缺血再灌注[10]。

GO 功能分析發(fā)現(xiàn)的潛在靶點主要涉及DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、核受體活性、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性等方面，提示葛根-丹參通過參與調(diào)控上述生物學過程進而發(fā)揮其藥理作用。KEGG 富集分析篩選出與冠心病心絞痛密切相關(guān)的信號通路，如TNF 信號通路、PI3K-AKT 信號通路、IL-17 信號通路等，涉及免疫炎癥反應、細胞增殖凋亡等生物學過程。PI3K-AKT 信號通路主要參與細胞增殖、分化、凋亡等多個環(huán)節(jié)[11]。研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT信號通路通過調(diào)節(jié)心肌細胞凋亡、血管內(nèi)皮再生、炎癥反應等影響心肌梗死的進展[12]。炎癥與心絞痛關(guān)系密切，而TNF 則是經(jīng)典的炎癥靶標，其可溶性受體（TNFR1 和TNFR2）在細胞應激反應和炎癥級聯(lián)反應中具有重要作用，且與心血管事件的風險增加有關(guān)[13]。TNF-α 激活的信號轉(zhuǎn)導通路可能參與了血管功能障礙、動脈粥樣硬化的發(fā)生和進展，以及心肌梗死后的心臟重構(gòu)[14]。

綜上所述，本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學，從系統(tǒng)生物學角度挖掘葛根-丹參治療冠心病心絞痛的潛在作用機制，發(fā)現(xiàn)各活性成分之間可能通過調(diào)控炎癥反應、細胞增殖凋亡等途徑發(fā)揮治療作用，為進一步認識疾病本質(zhì)，進而探索藥物作用機制提供依據(jù)。