袁慧姣 韓 波

慢加急性肝衰竭（acute-on-chronic liver failure,ACLF）是臨床常見的一種肝臟衰竭疾病，是肝衰竭中常見的類型，多由慢性肝炎發(fā)展而來(lái)，其進(jìn)展迅速，病情危重，預(yù)后不良，病死率極高，目前，尚無(wú)治療ACLF的特效藥和方法，現(xiàn)臨床上多采用抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等傳統(tǒng)療法，但病毒的耐藥性等因素使治療效果不能讓人滿意，臨床上雖有肝移植、人工肝替代治療等新型技術(shù)，但存在供體短缺、價(jià)格昂貴、并發(fā)癥多等弊端[1]。該疾病受多種信號(hào)通路調(diào)節(jié)，目前研究發(fā)現(xiàn)，STING-IRF3信號(hào)通路對(duì)ACLF的發(fā)生[2]、進(jìn)展具有重要的調(diào)控作用，核因子κB和IKK是STING-IRF3信號(hào)通路中重要的轉(zhuǎn)錄因子[3-4]，兩者功能的發(fā)揮依賴于轉(zhuǎn)錄后的反應(yīng)修飾（post-transcriptional modification, PTM），通過磷酸化的修飾使蛋白具有活性進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)功能[5-7]。本研究就核因子κB和IKK蛋白在ACLF中的表達(dá)情況以及其與患者臨床特征和預(yù)后相關(guān)性進(jìn)行分析?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年3月至2018年11月于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院治療的144例ACLF患者作為研究對(duì)象，其中男100例，女44例，年齡20～62歲，平均（40±6.32歲）。

納入標(biāo)準(zhǔn)：1）符合ACLF診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；2）行手術(shù)治療且術(shù)后經(jīng)病理檢查確診；3）簽署了知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）除ACLF外還存在其他肝功能障礙；2）臨床以及隨訪資料不完整。

1.2 方法

收集144例ACLF患者的各項(xiàng)臨床資料，手術(shù)過程中收集的肝組織標(biāo)本和日常的血液、尿液作為試驗(yàn)組。同時(shí)收集144例正常人的血液、尿液以及肝臟組織作為對(duì)照組。比較兩組核因子κB和IKK蛋白的磷酸化水平以及表達(dá)量，分析核因子κB和IKK蛋白的磷酸化水平和表達(dá)量與ACLF臨床病理特征的關(guān)系。對(duì)144例ACLF患者進(jìn)行為期4年的回訪，隨訪方式包括電話隨訪、微信隨訪、回院復(fù)查等，比較核因子κB和IKK蛋白不同表達(dá)水平4年的生存率。采用Logistic多因素回歸分析影響ACLF患者預(yù)后死亡的相關(guān)因素。

1.3 檢測(cè)與評(píng)價(jià)

鼠抗人的核因子κB多克隆抗體、鼠抗人的p-核因子κB多克隆抗體、兔抗人的IKK多克隆抗體、兔抗人的p-IKK多克隆抗體和鼠抗人的actin多克隆抗體均購(gòu)自于美國(guó)Cell Signaling Technology公司，蛋白裂解液及蛋白質(zhì)免疫印跡法跑膠儀、轉(zhuǎn)膜儀和化學(xué)發(fā)光儀購(gòu)自廣州天能公司，ECL-化學(xué)發(fā)光液購(gòu)自美國(guó)密理博公司，對(duì)不同試驗(yàn)組的蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)的蛋白條帶的灰度進(jìn)行量化，當(dāng)試驗(yàn)組中核因子κB和IKK蛋白的灰度值高于對(duì)照組，則判定結(jié)果為陽(yáng)性；反之則為陰性（不同試驗(yàn)組中的內(nèi)參蛋白actin的灰度值為一致），嚴(yán)格按照試劑盒中的說(shuō)明書與試驗(yàn)規(guī)范手冊(cè)進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；采用Logistic多因素回歸分析影響ACLF患者預(yù)后死亡的危險(xiǎn)因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組各樣本核因子κB蛋白表達(dá)量與磷酸化水平比較

對(duì)照組與試驗(yàn)組比較，核因子κB蛋白表達(dá)量不變（P＞0.05），而p-核因子κB蛋白表達(dá)量明顯減少（P＜0.05）。見圖1，表1。且在144例ACLF患者中，肝組織p-核因子κB蛋白陽(yáng)性95例，表達(dá)率為65.9%高于對(duì)照組中僅存的5例（χ2=24.759，P＜0.05），血清p-核因子κB蛋白陽(yáng)性102例，表達(dá)率為70.8%高于對(duì)照組中的8例（χ2=36.191，P＜0.001），尿液中p-核因子κB蛋白陽(yáng)性96例，表達(dá)率為66.7%高于對(duì)照組中的6例（χ2=29.178，P＜0.001）。

表1 兩組各樣本中核因子κB蛋白表達(dá)量與磷酸化水平比較

圖1 兩組各樣本中核因子κB蛋白表達(dá)量與磷酸化電泳結(jié)果

2.2 兩組各樣本中IKK蛋白表達(dá)量與磷酸化水平比較

無(wú)論在肝臟、血液還是尿液中，試驗(yàn)組中IKK與p-IKK蛋白表達(dá)量明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）。見圖2，表2。在144例ACLF患者中，肝組織IKK蛋白陽(yáng)性84例，表達(dá)率為58.3%高于對(duì)照組中的6例（χ2=33.075，P＜0.001），血清IKK蛋白陽(yáng)性96例，表達(dá)率為66.7%高于對(duì)照組中的8例（χ2=38.284，P＜0.01），尿液中IKK蛋白陽(yáng)性91例，表達(dá)率為63.2%高于對(duì)照組中的5例（χ2=25.793，P＜0.01）；肝組織p-IKK蛋白陽(yáng)性112例，表達(dá)率為77.8%高于對(duì)照組中的4例（χ2=17.043，P＜0.05），血清p-IKK蛋白陽(yáng)性89例，表達(dá)率為61.8%高于對(duì)照組中的5例（χ2=26.342，P＜0.05），尿液中p-IKK蛋白陽(yáng)性100例，表 達(dá)率為69.4%高于對(duì)照組中的6例（χ2=19.012，P＜0.05）。

表2 兩組各樣本IKK表達(dá)量與磷酸化水平

圖2 兩組各樣本IKK蛋白表達(dá)量與磷酸化水平電泳結(jié)果

2.3 144例ACLF患者預(yù)后情況

隨訪4年結(jié)束后，核因子κB和IKK蛋白表達(dá)均為陽(yáng)性患者4年生存率為5.89%（5/80）；核因子κB蛋白表達(dá)為陽(yáng)性，IKK蛋白表達(dá)為陰性的患者，其4年的生存率為20.12%（18/92）；核因子κB蛋白表達(dá)為陰性，IKK蛋白表達(dá)為陽(yáng)性的患者，其4年的生存率為25.18%（14/52）。不同核因子κB和IKK蛋白表達(dá)水平的ACLF患者5年生存率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），且經(jīng)非條件多因素Logistic回歸模型結(jié)果顯示：核因子κB蛋白（陽(yáng)性）、IKK蛋白（陽(yáng)性）以及病理學(xué)Ⅲ期為影響ACLF患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.001）。見表3。

表3 影響ACLF患者預(yù)后單因素和多因素分析結(jié)果

3 討論

STING-IRF3作為一類常見的信號(hào)通路，主要參與機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)，STING能識(shí)別機(jī)體的外源性DNA，識(shí)別后通過招募TANK結(jié)合激酶1（TANK binding kinase 1, TBK1）和干擾素調(diào)節(jié)因子（interferon regulatory factor, IRF）-3形成復(fù)合物后，該復(fù)合物由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，與細(xì)胞核中能識(shí)別IRF-3的目的基因的反應(yīng)元件結(jié)合，促進(jìn)炎癥基因的表達(dá)，如核因子κB蛋白、IKK蛋白[9-11]。本研究中通過檢測(cè)144例ACLF患者的肝組織、血液和尿液中STING-IRF3通路的下游轉(zhuǎn)錄因子核因子κB蛋白、IKK蛋白的磷酸化水平發(fā)現(xiàn)，患者體內(nèi)核因子κB蛋白、IKK蛋白的磷酸化水平明顯上升，導(dǎo)致機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)減弱，無(wú)法正常抵御外來(lái)病原體的入侵。

核因子κB蛋白、IKK蛋白作為炎癥介質(zhì)，參與多種信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)。核因子κB蛋白最早由David Baltimore發(fā)現(xiàn)[12]，當(dāng)機(jī)體受到刺激后，外部的刺激因子與膜受體結(jié)合進(jìn)而激活I(lǐng)KK，活化后的IKK自身發(fā)生磷酸化修飾，使得其被泛素小體降解，最終釋放核因子κB二聚體，核因子κB自由進(jìn)入細(xì)胞核，結(jié)合在目的基因的反應(yīng)元件區(qū)域，啟動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[13]。劉巧紅等[14]的研究發(fā)現(xiàn)，通過解毒化瘀通腑顆粒可有效緩解ACLF患者的癥狀，且患者體內(nèi)的核因子κB等磷酸化蛋白水平有所下降，其結(jié)果從側(cè)面證明了本研究結(jié)論的正確性。

綜上所述，STING-IRF3通路可通過炎癥介質(zhì)核因子κB、IKK來(lái)影響ACLF患者的病情，該蛋白在ACLF中的陽(yáng)性率明顯高于正常對(duì)照組。但本研究中發(fā)現(xiàn)，ACLF患者體內(nèi)的IKK蛋白表達(dá)量與其磷酸化形式均有所增高，這可能是部分IKK蛋白轉(zhuǎn)化為其自身磷酸化形式，進(jìn)而行使其生物學(xué)功能，其具體的轉(zhuǎn)化機(jī)制可能還需要更進(jìn)一步的研究。