馬 力，宋延平，楊彥平，趙林濤

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712046；2.陜西省中醫(yī)藥研究院，西安 710003；3.西安雨田農(nóng)業(yè)科技股份有限公司，西安 710065）

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine productive and re?spiratory syndrome，PRRS），也稱(chēng)藍(lán)耳病，由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）感染的一種以豬繁殖障礙和呼吸癥狀為主的急性、強(qiáng)傳染性疾??；目前在我國(guó)廣泛流行，主要損傷豬肺泡巨噬細(xì)胞、降低機(jī)體免疫力、引起繼發(fā)感染，仔豬發(fā)病后主要表現(xiàn)為耳廓發(fā)紺（俗稱(chēng)藍(lán)耳?。?、呼吸道癥狀、高熱；懷孕母豬引起流產(chǎn)、產(chǎn)死胎或木乃伊胎［1］。目前該病以預(yù)防為主，但由于病毒傳播速度快、毒株變異力強(qiáng)等問(wèn)題，不能有效控制大面積地傳播和流行，對(duì)生豬養(yǎng)殖業(yè)造成極大危害［2］。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)中藥具有廣譜抗病毒、增強(qiáng)免疫等作用，對(duì)PRRS的預(yù)防和治療具有積極作用。張道廣等［3］通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，綠原酸、黃芩多糖、板藍(lán)根水提物等在體外抑制PRRSV增殖，對(duì)其具有較好的阻斷和抑制作用；唐耀平等［4］對(duì)自行研制的中獸藥方劑排毒逐瘀散與經(jīng)典中獸藥方劑清瘟敗毒散、白虎湯對(duì)PRRS的防治作用進(jìn)行了對(duì)比試驗(yàn)，結(jié)果顯示，3種中獸藥方劑對(duì)預(yù)防和治療均有較好效果；黃德利等［5］將金銀花等12味中藥制成制劑，加入飼料中連用3天，與空白組相比，對(duì)PRRS有很好的預(yù)防效果。

金銀花（LonicerajaponicaThunb.）自古以來(lái)就被譽(yù)為清熱解毒的良藥，性甘寒氣芳香，清熱而不傷胃，透達(dá)又可祛邪；既能宣散風(fēng)熱，還善清熱涼血，近年來(lái)作為抗生素的替代品，逐漸被應(yīng)用在畜禽養(yǎng)殖行業(yè)，防治多種畜禽疾病，效果顯著［6］，然而關(guān)于金銀花抗PRRS的基礎(chǔ)研究較少，特別是對(duì)其作用機(jī)制及通路的研究。中獸藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以生物信息學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合多向藥理學(xué)、分子網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)以及計(jì)算機(jī)模擬分析等技術(shù)，通過(guò)構(gòu)建中藥-化學(xué)成分-靶點(diǎn)-通路-疾病之間的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，從整體的角度闡釋中獸藥的作用機(jī)制［7］。本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方法來(lái)探討金銀花治療PRRS的物質(zhì)基礎(chǔ)和靶點(diǎn)信息，為應(yīng)用中藥金銀花及其提取物治療PRRS奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 金銀花潛在活性成分與靶點(diǎn)的收集

在 TCMSP 平 臺(tái)（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）［8］，利用口服利用度（OB）和類(lèi)藥性（DL）兩個(gè)參數(shù)對(duì)金銀花的潛在活性化合物進(jìn)行篩選，設(shè)定其閾值為：OB≥30%，DL≥0.18［9］，為了避免遺漏潛在有效成分（已有文獻(xiàn)證明其抗病毒的有效性），這部分活性成分也被納入研究中。同時(shí)利用該數(shù)據(jù)庫(kù)收集這些潛在活性化合物所對(duì)應(yīng)的蛋白靶點(diǎn)，最后利用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.uniprot.org/），將靶點(diǎn)蛋白轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的基因。

1.2 PRRS相關(guān)宿主靶點(diǎn)的獲取

在CTD數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//ctd.mdibl.org）［10］中輸入關(guān)鍵 詞“Porcine Reproductive and Respiratory Syn?drome”，查詢(xún)并收集PRRS相關(guān)宿主靶點(diǎn)基因，并利用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)將所得靶點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)化。

1.3 篩選交集靶點(diǎn)

利用在線Venny 2.1.0軟件將金銀花中主要活性成分作用的靶點(diǎn)與CTD數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的PRRS相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行映射分析，獲得金銀花防治PRRS的潛在作用靶點(diǎn)。

1.4 蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建與分析

潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org/）［11］，限定物種為“Sus scrofa”，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖；將蛋白質(zhì)互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)保存為“.tsv”文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2［12］可視化，并利用其內(nèi)置net?work analyzer分析工具分析網(wǎng)絡(luò)特征參數(shù)，包括連接度中心性（Degree centrality，DC）、緊密度中心性（Closeness centrality，CC）、介度中心性（Betweenness centrality，BC）等，這些參數(shù)值越大，說(shuō)明它們?cè)诰W(wǎng)絡(luò)中越重要，可能是金銀花防治PRRRS的關(guān)鍵作用點(diǎn)。

1.5 “藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

將活性成分與對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)基因?qū)隒ytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，其中用“節(jié)點(diǎn)”（node）表示藥物、成分、靶點(diǎn)和疾病，用“邊”（edge）表示相互之間的關(guān)系；同時(shí)應(yīng)用net?work analyzer子功能計(jì)算各個(gè)節(jié)點(diǎn)的重要屬性值，篩選金銀花抗PRRS的重要活性成分。

1.6 GO功能及KEGG通路富集分析

Metascape平臺(tái)（http：//metascape.org）［13］可對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行通路富集分析，整合了GO、KEGG、Uniprot等多個(gè)權(quán)威的功能數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)基因或蛋白質(zhì)進(jìn)行注釋、富集分析，其中GO功能分析包括生物學(xué)過(guò)程（Biological process，BP）、分子功能（Molecularfunc?tion，MF）及細(xì)胞組分（Cellular component，CC）。將潛在作用靶點(diǎn)信息導(dǎo)入Metascape進(jìn)行GO及KEGG分析，保存其結(jié)果并對(duì)其進(jìn)行可視化。

1.7 分子對(duì)接

從Protein Data Bank（PDB，http：//www.rcsb.org）［14］下載關(guān)鍵蛋白結(jié)構(gòu)，從ZINCdatabase（http：//zinc.docking.org/）［15］中找到主要活性成組分的三維結(jié)構(gòu)。將改造后的蛋白和組分引入AutoDock Vina進(jìn)行分子對(duì)接，在相同條件下進(jìn)行分子對(duì)接模擬，兩者結(jié)合能越低，構(gòu)象越穩(wěn)定，發(fā)生作用可能性越大。一般以結(jié)合能絕對(duì)值大于4.25說(shuō)明具有結(jié)合活性，大于5.0表明有較好的結(jié)合活性，大于7.0說(shuō)明具有強(qiáng)烈的結(jié)合活性［9］。選擇構(gòu)象最高、結(jié)合自由能絕對(duì)值最大的對(duì)接結(jié)果，并應(yīng)用Pymol軟件將對(duì)接結(jié)果可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 金銀花潛在活性成分及靶點(diǎn)

利用TCMSP平臺(tái)，根據(jù)設(shè)定的OB和DL值，從236個(gè)化合物中篩選出23個(gè)符合條件的化合物，通過(guò)查閱文獻(xiàn)補(bǔ)充了5個(gè)具有藥理活性的成分，例如，綠原酸（Heriguard，OB 11.93%）和咖啡酸酯（Caffeate，DL 0.05）是金銀花抗病毒的有效成分，已被證實(shí)具有強(qiáng)大的抗病毒活性［16-17］。最終28個(gè)潛在活性成分（排除7個(gè)沒(méi)有作用靶點(diǎn)的化合物）共獲得470個(gè)蛋白質(zhì)靶點(diǎn)；去重后，發(fā)現(xiàn)有220個(gè)靶點(diǎn)蛋白，經(jīng)UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)轉(zhuǎn)換成基因名。

2.2 PRRS的靶點(diǎn)獲取

CTD數(shù)據(jù)庫(kù)中共獲取PRRS相關(guān)宿主基因744個(gè)。

2.3 金銀花防治PRRS的靶點(diǎn)獲取

將PRRS相關(guān)宿主基因與金銀花潛在活性成分的靶點(diǎn)基因相互映射后，共篩得70個(gè)交集靶點(diǎn)，作為金銀花防治PRRS的潛在作用靶點(diǎn)，見(jiàn)圖1。

圖1 藥物與疾病交集靶點(diǎn)韋恩圖Fig.1 Venn diagramof drug and disease intersection target

2.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

將70個(gè)靶點(diǎn)基因?qū)隨tring數(shù)據(jù)庫(kù)，限定物種為“Sus scrofa”，分析數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖（隱藏掉沒(méi)有交集的靶點(diǎn)）。結(jié)果顯示，該網(wǎng)絡(luò)共涉及64個(gè)節(jié)點(diǎn)、657條邊，如圖2所示節(jié)點(diǎn)顏色越深越大，說(shuō)明其在網(wǎng)絡(luò)中越重要。將30個(gè)靶蛋白基因度值高于中位數(shù)（20.51）的列于表1，TNF、ALB、CASP3、IL6、IL10、MAPK14等靶點(diǎn)蛋白基因度值較大，表明這些靶點(diǎn)與其他靶點(diǎn)相互作用較強(qiáng)，正是藥物作用于機(jī)體時(shí)發(fā)揮作用。

表1 金銀花防治PRRS的靶點(diǎn)（度值大于中位數(shù)）Tab.1 Targets of honeysuckle for prevention and treatment of PRRS（degree value greater than median）

圖2 蛋白-蛋白網(wǎng)絡(luò)互作圖Fig.2 Protein-protein network interaction diagram

2.5 “藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將活性成分與對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)基因?qū)隒ytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建了金銀花抗PRRS的“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。其中JYH代表金銀花，PRRS代表疾病，主要的活性成分用藍(lán)色的多邊形表示，綠色的三角形代表關(guān)鍵靶點(diǎn)（如圖3）。對(duì)化學(xué)成分進(jìn)行度值計(jì)算，發(fā)現(xiàn)度值較高的槲皮素、木犀草素、山奈酚、β-胡蘿卜素、β-谷甾醇、金圣草（黃）素等金銀花的潛在活性成分可能是防控PRRS的關(guān)鍵成分（見(jiàn)表2）。

表2 金銀花防治PRRS的關(guān)鍵成分及重要參數(shù)Tab.2 Key components and important parameters of Honeysuckle for prevention and treatment of PRRS

圖3 藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Drug-component-target-disease network

2.6 GO功能和KEGG通路富集分析

利用Metascape平臺(tái)對(duì)70個(gè)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析，根據(jù)P-value＜0.05篩選結(jié)果，如圖4所示，7條生物過(guò)程條目主要涉及細(xì)胞凋亡信號(hào)通路、細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控及細(xì)胞因子的正向調(diào)節(jié)作用等；7條分子功能條目主要涉及與轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞因子、趨化因子、及NF-κB的結(jié)合，參與激酶調(diào)節(jié)活動(dòng)和抗氧化活性等，6條細(xì)胞組分條目主要涉及胞漿核周區(qū)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、核膜、樹(shù)突及質(zhì)膜蛋白復(fù)合物等。

圖4 GO功能富集結(jié)果圖Fig.4 GOfunctional enrichment resultsdiagram

同樣地，也利用該平臺(tái)對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行了KEGG通路富集分析，共得到相關(guān)通路276條，刪除明顯與研究疾病不相關(guān)的通路（如癌癥通路），保留富集基因最多的17條通路（P-value＜0.05），如圖5所示，富集基因數(shù)目最多的通路集中于病毒感染（如卡波濟(jì)肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、麻疹、朊病毒病等通路）、炎癥通路（IL-17信號(hào)通路、炎癥性腸病、趨化因子、壞死性凋亡、NF-κB信號(hào)通路等）、氧化反應(yīng)相關(guān)的通路（p53、HIF-1信號(hào)通路）、細(xì)胞周期信號(hào)通路等。這些通路不但直接與抗病毒相關(guān)，而且在抗炎、氧化應(yīng)激和免疫力調(diào)節(jié)方面發(fā)揮作用，因此推測(cè)這些通路可能是金銀花防治PRRS的核心通路。

圖5 KEGG通路富集氣泡圖Fig.5 Enrichment Bubble Diagram of KEGGpathway

2.7 分子對(duì)接結(jié)果及可視化

金銀花中DC值最高的3個(gè)化合物（槲皮素、木犀草素和山奈酚）分別與治療核心靶點(diǎn)一一進(jìn)行對(duì)接，這些關(guān)鍵成分與核心靶點(diǎn)蛋白的結(jié)合能普遍較高，這進(jìn)一步表明金銀花可能通過(guò)多組分靶通路模式發(fā)揮治療PRRS的作用，部分對(duì)接結(jié)果見(jiàn)表3和圖6。

圖6 分子對(duì)接可視化圖Fig.6 Visualization of molecular docking

表3 分子對(duì)接結(jié)果Tab.3 Molecular docking results

3 討論

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的技術(shù)對(duì)金銀花的有效成分、作用靶點(diǎn)、生物富集通路等幾個(gè)方面進(jìn)行了深入探討。

通過(guò)篩選獲得的金銀花中的有效活性成分有槲皮素、木犀草素、山奈酚、β-胡蘿卜素、β-谷甾醇等，它們可能是金銀花體內(nèi)發(fā)揮藥效的主要活性成分。槲皮素具有抗病毒、抗炎及抗氧化等廣泛的生理活性［18］，研究者通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)槲皮素能明顯地抑制PRRSV病毒活性，可能是通過(guò)抑制病毒的復(fù)制而實(shí)現(xiàn)的［19］。木犀草素對(duì)PRRS在內(nèi)的40多種病毒均有抑制作用，通過(guò)影響宿主細(xì)胞中的激酶和轉(zhuǎn)錄因子活性影響病毒復(fù)制，亦或利用其結(jié)構(gòu)特異性阻斷病毒與宿主細(xì)胞的結(jié)合而阻斷病毒進(jìn)入細(xì)胞；同時(shí)它控制多種炎癥信號(hào)通路（NF-κB、MAPK/AP-1、JAK/STAT等）抑制炎性細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的表達(dá)［20，21］。山奈酚可以通過(guò)減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)和提高線粒體的功能，減輕囊胚自噬和DNA損傷的程度，對(duì)豬卵母細(xì)胞和豬繁殖發(fā)育具有良好的保護(hù)作用［22］。β-胡蘿卜素由于其多烯烴結(jié)構(gòu)而具有良好的抗氧化活性，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其可以緩解早期斷奶仔豬腸上皮細(xì)胞炎癥和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)而發(fā)揮抗炎、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)功能［23］。在研究β-谷甾醇對(duì)斷奶仔豬的影響中發(fā)現(xiàn)，良好的抗氧化能力能有效提高豬精子的體外獲能和體外受精效果，通過(guò)降低TNFα、超敏反應(yīng)C蛋白等的含量，促進(jìn)外周淋巴細(xì)胞增殖，具有調(diào)節(jié)育豬機(jī)體免疫功能［24］。

PRRSV感染后導(dǎo)致豬體內(nèi)炎癥調(diào)節(jié)失衡，在感染晚期炎癥因子大量表達(dá)，形成“炎癥因子”風(fēng)暴，這也是PRRSV極易導(dǎo)致豬死亡的重要因素［25］。金銀花作用的靶點(diǎn)主要富集在炎癥細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子（TNF）、白介素6（IL6）和白介素10（IL10）等，PRRSV感染后，致炎因子（TNF、IL6、IL10）能促進(jìn)白細(xì)胞聚集和活化，增加毛細(xì)血管的通透性并誘導(dǎo)發(fā)熱、厭食、精神萎靡等一系列反應(yīng)，引起支氣管哮喘樣癥狀［26-28］，作用于該類(lèi)致炎因子可調(diào)控PRRSV感染后的一系列癥狀。另外，胱天蛋白酶3（CASP3）［29］是細(xì)胞凋亡途徑的關(guān)鍵酶，也被稱(chēng)為凋亡的炎性介質(zhì)，通過(guò)調(diào)控細(xì)胞凋亡信號(hào)通路和細(xì)胞增殖，在炎癥反應(yīng)中起重要作用。MAPK14是MAPKs家族的重要成員之一，在炎癥等病理過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用［30］。

KEGG富集通路結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，金銀花作用于PRRS的通路與多種病毒感染有關(guān)，說(shuō)明金銀花主要成分和靶點(diǎn)作用于多種抗病毒通路，發(fā)揮廣泛的抗病毒作用，多種炎癥信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)PRRS感染后炎癥因子風(fēng)暴的治療。HIF-1信號(hào)通路參與免疫調(diào)節(jié)和抗氧化活性，作用于該通路有助于提高PRRS病豬免疫力和抗氧化活性。

綜上，金銀花主要活性成分槲皮素、木犀草素、山奈酚等，作用于與PRRS疾病相關(guān)的靶點(diǎn)基因TNF、ALB、CASP3、IL6、IL10、MAPK14等，主要調(diào)控病毒感染、炎癥、氧化應(yīng)激和免疫調(diào)節(jié)等信號(hào)通路發(fā)揮防治PRRS的作用，接下來(lái)還需進(jìn)一步的動(dòng)物試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。