范 悅，李 欠，常寶勤

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州，730070）

黃芩［Scutellariae Radix］來源于唇形科植物黃芩［ScutellariabaicalensisGeorgi］干燥的根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其性苦，味寒，具有清肺熱、除燥濕、瀉火解毒、安胎止血等功效［1］。在疾病治療過程中，黃芩常與其他清熱類中藥配伍使用，其主要用于溫濕、暑濕、胸悶、濕熱痞滿、肺熱咳嗽、高熱煩渴等。黃芩產(chǎn)地主要位于西北、東北地區(qū)，如黑龍江、遼寧、內(nèi)蒙古、甘肅等地。黃芩苷是黃芩的主要有效成分之一，屬于黃酮類化合物，其含量是評價(jià)黃芩質(zhì)量高低的重要標(biāo)準(zhǔn)［2］。黃芩苷具有抑菌、利尿、抗炎、抗病毒及解痙、抗癌等顯著的生物活性［3］，在臨床醫(yī)學(xué)具有舉足輕重的地位。同時(shí)，黃芩苷能夠吸收紫外線、抑制氧自由基、一定程度上可以抑制機(jī)體生成黑色素，因此除常用于醫(yī)藥外，也可用于化妝品［4-5］。目前，在黃芩中提取黃芩苷的方法主要有回流提取法、常規(guī)煎煮法、微波提取法、和超聲提取法［6-10］。

定量核磁共振波譜（quantitive Nuclear Magnetic Resonance，qNMR）法在化合物的確定及結(jié)構(gòu)分析中具有獨(dú)特的地位，兼?zhèn)淞硕ㄐ澡b別和定量測定，現(xiàn)如今，qNMR法已廣泛應(yīng)用于食品、農(nóng)業(yè)、化學(xué)及藥學(xué)，特別是在代謝組學(xué)、新藥研發(fā)、對照品研究等方面應(yīng)用廣泛，對小分子、大分子結(jié)構(gòu)的解析和成分含量的測定都有相關(guān)報(bào)道［11-14］。核磁共振波譜與其他檢測方法相比，不需自身對照品，節(jié)約成本且簡化和縮短樣品前處理的步驟及時(shí)間，適合于價(jià)格昂貴或難獲得標(biāo)準(zhǔn)品的物質(zhì)的測定［15-19］。qNMR法是基于原子核的積分面積與質(zhì)子數(shù)成正比，因而定量只與原子數(shù)有關(guān)，因此無需應(yīng)用任何校正因子和被測物的對照品。內(nèi)標(biāo)法中某種確定的物質(zhì)可以作為參照物，若同時(shí)測多種成分含量時(shí)只需要一種內(nèi)標(biāo)即可，選用的內(nèi)標(biāo)物需與待測樣品共溶于測試溶劑中，具有適宜寬度的單峰、不與待測樣品相互作用、分子量與待測樣品特征峰質(zhì)子數(shù)之比合理，信號峰與待測物的信號峰不存在干擾等特點(diǎn)［1］。

目前，黃芩苷含量的測定通常采用熒光分光光度法、紫外分光光度法、法和高效液相色譜法等［20-23］，這些方法存在操作復(fù)雜、進(jìn)樣時(shí)間長、成本高、受環(huán)境限制、需使用對照樣品測試等缺點(diǎn)，而qNMR法具有檢測準(zhǔn)確，操作簡捷，低成本，且不需要待測物質(zhì)的對照品等優(yōu)點(diǎn)。因此建立黃芩中黃芩苷的快速提取和檢測方法非常重要。

本研究在有效提取黃芩苷的基礎(chǔ)上，建立了一種核磁共振波譜法測定黃芩中黃芩苷含量的方法，對建立的方法進(jìn)行了驗(yàn)證，并用于實(shí)際樣品的分析，這對進(jìn)一步提升黃芩苷的開發(fā)和利用具有重大意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：HX 203T精密電子天平（慈溪市天東衡器廠）；JFSD—100粉碎機(jī)（上海嘉定糧油儀器有限公司）；超聲波清洗機(jī)（深圳市得康科技有限公司，40 KHz）；600 MHz核磁共振譜儀（Bruker）；

黃芩藥材（蘭州安泰堂中藥飲片有限公司，產(chǎn)地：甘肅）；二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide-d6，DMSO-d6，薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司，批號：HC060001，99.9%）；吡嗪（上海麥克林生化科技有限公司）；黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，純度>98%）；甲醇（天津市富余精細(xì)化工有限公司，分析純）。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)選用相對定量的方法更能精確的測定待測物質(zhì)的含量。將精密稱定重量的待測樣樣品與已知量的內(nèi)標(biāo)物混合測定，通過比較樣品特征峰的面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值計(jì)算待測樣品的含量。分別精密稱定已準(zhǔn)備好的樣品和純度已知的內(nèi)標(biāo)物，同時(shí)溶于合適的氘代試劑中，混合均勻，配制成溶液，移入符合標(biāo)準(zhǔn)的核磁管，經(jīng)1H-qNMR測定，分析圖譜，選擇分離度好且不受其他峰干擾的特征峰作為供試樣品和內(nèi)標(biāo)的定量峰［17］。運(yùn)用公式［1］：

Ws為待測樣品的量；Wr為內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量；As為待測樣品特征峰的峰面積；Ar為內(nèi)標(biāo)峰的峰面積；Es待測樣品的質(zhì)子當(dāng)量重量；Er內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)子當(dāng)量重量（質(zhì)子當(dāng)量重量=相對分子質(zhì)量/特征峰的質(zhì)子數(shù)）

1.2.1 黃芩苷的提取工藝

粉碎黃芩藥材，過40目篩，精密稱取藥材，加入65%甲醇（料液=1：20），用10%的HCl調(diào)節(jié)混合溶液pH至4，浸潤1 h稱重，在50℃下，超聲提取1 h，待提取液冷卻，補(bǔ)重，利用減壓抽濾裝置進(jìn)行抽濾，取濾液，80℃水浴濃縮至半，用10%HCl調(diào)節(jié)pH值至1-2后，80℃保溫2 h，待沉淀不在析出，離心機(jī)在12000 r/min轉(zhuǎn)速下，離心5 min，棄去上清液，收集沉淀，烘干，稱重［10，24］。

1.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液制備

精密稱取1.6018 g內(nèi)標(biāo)物吡嗪（99%），溶解至2mL DMSO-d6中，即為內(nèi)標(biāo)溶液。

1.2.3 供試品溶液的制備

精密稱定“1.2.1”得到的沉淀5 mg于試管中，用移液槍精密加入490μL DMSO-d6和“1.2.2”下已配置好的內(nèi)標(biāo)溶液10μL，超聲溶解，移至核磁管待測。

1.2.4 核磁測試條件

脈沖序列（Zg）為30，譜寬（SWH）為11904.8Hz，測定溫度為293.7 K，脈沖延遲時(shí)間（D1）為1 s，脈沖寬度（P1）為14.90 s，掃描次數(shù)（NS）為32次。利用核磁共振譜儀測定樣品，得到的檢測圖譜采用手動調(diào)整相位和基線，并進(jìn)行手動積分。

2 結(jié)果與討論

2.1 內(nèi)標(biāo)物和氘代溶劑的選擇

定量核磁共振波譜法應(yīng)用于藥物含量測定時(shí)，內(nèi)標(biāo)物的選擇是很重要的［25］，需要具備較高的純度，穩(wěn)定性強(qiáng)，且主要吸收峰不干擾待測物質(zhì)的波譜信號、不與樣品發(fā)生反應(yīng)。選用的氘代溶劑時(shí)應(yīng)注意：有較好的溶解性，信號峰不與待測峰發(fā)生重疊。經(jīng)初步測定，黃芩苷和吡嗪在DMSO-d6中溶解性最好，并且信號峰不與樣品峰重疊，也沒有干擾。因此試驗(yàn)選擇DMSO-d6作為氘代試劑、吡嗪作為內(nèi)標(biāo)物。對黃芩苷類進(jìn)行qNMR分析之前，選擇合適的定量峰。優(yōu)先選擇耦合裂分?jǐn)?shù)最少的，且分離度較好的峰，根據(jù)以上要求，故以黃芩苷中δ5.24（d 5.23）的峰為定量峰，以δ8.66為內(nèi)標(biāo)定量峰（圖1-2）。

圖1 黃芩苷結(jié)構(gòu)式（左）和吡嗪結(jié)構(gòu)式（右）Fig.1 Baicalin structural formula（left）and pyrazine structural formula（right）

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

取黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品，精密稱定20 mg，溶解于1 mL DMSO-d6中，分別取450μL、200μL、100μL、50μL、20μL、13μL于試管中，分別加入“1.2.2”配置好的內(nèi)標(biāo)溶液50μL，其次分別加入DMSO-d6至500μL，混合均勻，移入核磁管中，在“1.2.4”條件下檢測，得到黃芩苷對照品在0.52-16 mg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

圖2 黃芩苷（A）和黃芩藥材（B）的1H NMR譜Fig.2 1H NMR spectra of baicalin（A）and baicalin herb（B）

2.2.2 精密度考察

在“1.2.4”試驗(yàn)條件下，精密稱取在“1.2.3”的條件下配置好的樣品溶液，利用600 MHz核磁共振譜儀重復(fù)測定6次，利用公式計(jì)算，結(jié)果顯示黃芩苷的RSD值為0.597%（見表1），表明本方法具有較好的精密度，且樣品有良好的穩(wěn)定性。

表1 精密度試驗(yàn)Tab.1 The precision test

2.2.3 穩(wěn)定性考察

在“1.2.4”試驗(yàn)條件下，根據(jù)“1.2.3”的條件下將黃芩苷待測樣品制成待測溶液于核磁管中，分別在0、4、8、16、20、24 h測定，得到核磁圖譜，經(jīng)分析結(jié)果顯示黃芩苷的RSD值為0.375%（見表2），表明黃芩苷在室溫條件下保存24 h時(shí)，穩(wěn)定性較好。

圖3 黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.3 The Baicalin standard curve graph

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)Tab.2 The stability test

2.2.4 重復(fù)性考察

根據(jù)“1.2.3”的試驗(yàn)條件下，平行制備6份供試品溶液，分別制成待測溶液于核磁管中，在“1.2.4”試驗(yàn)條件下檢測，得到核磁圖譜，以樣品定量峰面積與內(nèi)標(biāo)物定量峰面積的比值，計(jì)算得到黃芩苷的含量，結(jié)果黃芩苷的含量為11.914%，RSD值為0.777%（見表3），結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)Tab.3 The repeatability test

2.2.5 加樣回收實(shí)驗(yàn)

在“1.2.1”實(shí)驗(yàn)條件下得到的樣品沉淀，取同一批含量已知的沉淀，精密稱定2.500 mg，平行6份，于5 mL的離心管中，分別精密加入黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品1.667 mg、內(nèi)標(biāo)物0.1 mg，溶于500μL DMSO-d6中，

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用超聲法提取黃芩中的黃芩苷，通過混合均勻，移入核磁管中，在“1.2.4”條件下測定黃芩苷含量，結(jié)果得到平均回收率為102.538%，RSD值為1.044%（見表4），加標(biāo)回收率范圍在101.015%～104.091%之間，表明試驗(yàn)過程中的系統(tǒng)誤差較小，試驗(yàn)方法準(zhǔn)確度可靠。優(yōu)化提取，得到適合定量核磁共振波譜法測定黃芩中黃芩苷含量的最佳提取方法為：過40目篩的黃芩藥材，與65%甲醇混勻（料液=1：20），將pH調(diào)至4，在50℃下，超聲提取1 h，這為優(yōu)化黃芩中黃芩苷的提取工藝優(yōu)化提供參考；同時(shí)建立了定量核磁共振波譜法檢測黃芩中黃芩苷含量的新檢測方法，此方法可做到快速取樣檢測，具有實(shí)用性強(qiáng)，效率高、準(zhǔn)確性強(qiáng)、節(jié)約標(biāo)準(zhǔn)品等特點(diǎn)，尤其對于某些難以長時(shí)間保存、化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定的成分來說，1H-qNMR為其精準(zhǔn)測定和質(zhì)量控制提供了新的途徑。

表4 加樣回收試驗(yàn)Tab.4 The sample recovery test