葉 楓 莫小輝 胡婷婷 李 昕 魏子妤 李嘉祺 陳廣潔 Christos C. Zouboulis 鞠 強

1上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院皮膚科，上海，200127；2上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)與微生物學(xué)系，上海，200025；3勃蘭登堡醫(yī)學(xué)院德紹臨床醫(yī)學(xué)中心皮膚性病科、變態(tài)反應(yīng)及免疫科，德國德紹，06847

雄激素誘導(dǎo)的皮脂腺脂質(zhì)大量分泌是尋常痤瘡發(fā)生的前提條件，抗雄激素治療是女性痤瘡治療的重要手段，包括口服雌孕激素和螺內(nèi)酯等，但外用抗雄激素藥物缺乏。Clascoterone是一種新型的外用雄激素受體抑制劑，2020年兩項Ⅲ期臨床試驗證實其外用治療尋常痤瘡具有良好的療效和安全性[1，2]。2020年8月，1% Clascoterone乳膏被美國FDA批準用于12歲及以上尋常痤瘡患者[3]。Rosette等發(fā)現(xiàn)Clascoterone在體外以高親和力結(jié)合雄激素受體(androgen receptor, AR)并調(diào)控AR轉(zhuǎn)錄可能是其抗痤瘡機制[4]，但Clascoterone治療尋常痤瘡的具體作用機制仍有待深入探討。本文體外研究了Clascoterone對永生化人皮脂腺細胞增殖、脂質(zhì)合成和相關(guān)炎癥因子的影響，意在闡明Clascoterone治療痤瘡的細胞和分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料 雙氫睪酮(DHT，美國Selleck公司)、Clascoterone(美國TargetMol公司)、亞油酸(LA，美國Sigma公司)分別溶于DMSO(美國Sigma公司)分裝儲存，完全培養(yǎng)基稀釋后處理細胞。兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、過氧化物酶體增殖物激活受體(Peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)、脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase ，F(xiàn)ASN)、辣根過氧化物酶偶聯(lián)二抗來自美國CST公司，兔抗人硬脂酰輔酶A去飽和酶(Stearoyl-CoA desaturase，SCD1)、小鼠抗人固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(Sterol regulatory element-binding protein 1，SREBP1)、脂滴包被蛋白2(Perilipin 2，PLIN2)來自美國Abcam公司。細胞培養(yǎng)箱、生物安全柜、臺式冷凍離心機來自美國Thermo Fisher公司。

1.2 細胞培養(yǎng)與處理 SZ95人皮脂腺細胞由德國Dessau臨床醫(yī)學(xué)中心Zouboulis教授贈送。使用含有10%胎牛血清、500 U/mL青霉素、500 μg/mL鏈霉素、5 ng/mL表皮生長因子(均來自美國Gibco公司)的Sebomed基礎(chǔ)培養(yǎng)基(美國Merck公司)中，在37℃、5% CO2的濕潤環(huán)境下培養(yǎng)。對照組加入新鮮的完全培養(yǎng)基，DHT組加入10 μM DHT，Clascoterone組加入50 μM Clascoterone，共處理組加入10 μM DHT和50 μM Clascoterone。100 μM LA誘導(dǎo)皮脂腺細胞成熟。研究中DMSO終濃度在0.1%以下，該濃度對SZ95細胞生物學(xué)活性無影響[5]。

1.3 CCK8 將SZ95細胞以每孔5×103個接種于96孔板中，培養(yǎng)過夜后分組處理，設(shè)置12個復(fù)孔，沒有細胞的孔作為空白對照。處理對應(yīng)時間后加入CCK8溶液(上海碧云天)，37℃孵育2 h后使用多功能酶標儀(美國BioTek公司)檢測450 nm的吸光度，650 nm為參比波長。通過吸光度反映細胞數(shù)量。

1.4 尼羅紅染色 將SZ95細胞以每孔2×104個接種于黑色透底96孔板(美國Corning公司)中，培養(yǎng)24 h后分組處理。處理48 h后棄去培養(yǎng)液并用 PBS 清洗，隨后用PBS稀釋的10 μg/mL尼羅紅和15 μg/mL二乙酸熒光素(fluorescein diacetate，F(xiàn)DA)(均來自美國Sigma公司)分別染色，37℃避光孵育10 min，PBS清洗后，使用多功能酶標儀以激發(fā)波長485 nm/發(fā)射波長565 nm、激發(fā)波長494 nm/發(fā)射波長523 nm分別檢測尼羅紅和FDA熒光強度。結(jié)果以尼羅紅和FDA的比值表示，實驗組與對照組的百分比反映細胞內(nèi)相對脂質(zhì)含量。

1.5 蛋白質(zhì)免疫印跡 將SZ95細胞以每孔2×105個接種于12孔板中，培養(yǎng)24 h后分組處理，處理相應(yīng)時間后收集上清液用于ELISA。同時，PBS清洗細胞并加入含有蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑(TargetMol公司)的RIPA(上海雅酶)提取總蛋白，置于冰上充分裂解后最高速離心15 min，上清液用于BCA法蛋白定量(美國Thermo Fisher公司)和加入蛋白上樣緩沖液(上海雅酶)，99℃金屬浴變性。通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，冰浴轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯膜(美國Bio-Rad公司)。5%脫脂奶粉(美國BD公司)封閉1 h，TBST(上海雅酶)洗膜3次。加入一抗，4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，使用Amersham多功能成像儀(美國GE公司)、ECL化學(xué)發(fā)光顯影液(美國Millipore公司)顯影。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA) 將細胞上清液4℃、300×g離心后分裝。按照ELISA試劑盒(深圳達優(yōu))說明書操作，使用多功能酶標儀檢測450 nm吸光度，620 nm為參比波長。根據(jù)標準曲線計算樣本的細胞因子濃度。

1.7 實時熒光定量PCR 將SZ95細胞以每孔6×104個接種于24孔板中，培養(yǎng)24 h后。處理3 h后使用離心柱法抽提總RNA，檢測濃度和純度后使用PrimeScript RT Master Mix(日本TaKaRa公司)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用PowerUp SYBR Green Master Mix(美國ABI公司)在ViiA7實時熒光定量PCR系統(tǒng)(美國ABI公司)中檢測。mRNA相對表達量用2-ΔΔCt表示。以GAPDH作為內(nèi)參基因。引物(上海生工)序列見表1。

表1 RT-qPCR檢測基因和引物序列(5’-3’)

2 結(jié)果

2.1 Clascoterone抑制DHT誘導(dǎo)的SZ95細胞增殖 為了評估Clascoterone對皮脂腺細胞增殖的影響，我們將SZ95細胞用Clascoterone和DHT單獨或共處理24 h、48 h、72 h，CCK8法檢測細胞增殖。24 h后，DHT組相比對照組的細胞數(shù)顯著增加(P<0.05)，DHT和Clascoterone共處理組相比DHT組的細胞數(shù)顯著下調(diào)(P<0.01)。處理48 h、72 h后，組間出現(xiàn)類似更顯著的變化(P<0.0001)(圖1)。

*，P<0.05；**，P<0.01；****，P<0.0001

2.2 Clascoterone抑制SZ95細胞的中性脂質(zhì)合成 為了評估Clascoterone對皮脂腺細胞脂質(zhì)合成的影響，我們觀察Clascoterone、DHT和LA作用下SZ95細胞內(nèi)中性脂質(zhì)變化。結(jié)果顯示，和對照組相比，DHT和LA共作用組顯著增加中性脂質(zhì)合成(P<0.0001)，而DHT、LA和Clascoterone共處理組相比LA和DHT共作用組脂質(zhì)含量顯著降低(P<0.0001)(圖2)。

2.3 Clascoterone下調(diào)DHT誘導(dǎo)的SZ95細胞脂質(zhì)合成相關(guān)基因的表達 為研究Clascoterone抑制雄激素刺激的皮脂腺細胞脂質(zhì)合成作用機制，我們采用蛋白免疫印跡法檢測Clascoterone、DHT單獨或共處理48 h皮脂腺細胞脂質(zhì)合成相關(guān)基因表達的影響。結(jié)果顯示，DHT組PPARγ(P<0.001)、PLIN2(P<0.01)、SCD1(P<0.01)的表達顯著增加。與對照組相比，Clascoterone組PPARγ(P<0.05)、FASN(P<0.01)的表達顯著降低。與DHT組相比，DHT和Clascoterone共處理組下調(diào)了PPARγ(P<0.001)、PLIN2(P<0.0001)、FASN(P<0.01)、SCD1(P<0.05)的表達(圖3)。

*，P<0.05；**，P<0.01；****，P<0.0001

2.4 Clascoterone調(diào)節(jié)SZ95細胞炎癥因子的產(chǎn)生 為研究Clascoterone對皮脂腺細胞炎癥因子產(chǎn)生的影響，RT-qPCR和ELISA法分別檢測炎癥因子轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的變化。處理3 h后，與對照組相比，Clascoterone組IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8 mRNA均顯著降低(均P<0.0001)，DHT組的IL-1α、IL-8 mRNA顯著降低(均P<0.05)、IL-6 mRNA顯著升高(P<0.0001)。與DHT組相比，DHT和Clascoterone共處理組IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8 mRNA均顯著降低(IL-8P<0.01，其余P<0.0001)。各組間TNF-α轉(zhuǎn)錄水平無明顯差異(均P>0.05)(圖4)。此外，我們也檢測了培養(yǎng)液上清中炎癥因子的濃度，處理48 h后，與對照組、DHT組相比，Clascoterone組、共刺激組上清液中IL-1α、IL-6、IL-8的濃度顯著下降(均P<0.0001)。DHT組與對照組相比，上清液中IL-1α、IL-8的濃度小幅下降(均P<0.01)，IL-6升高(P<0.01)(圖5)。

*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001；****，P<0.0001

*，P<0.05；**，P<0.01；****，P<0.0001

**，P<0.01；****，P<0.0001

3 討論

皮脂腺細胞是人體皮膚中雄激素穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)位點[6]。腎上腺和性腺來源的雄激素前體通過血液循環(huán)進入皮脂腺，在皮膚主要是皮脂腺細胞內(nèi)經(jīng)過雄激素相關(guān)代謝酶的作用轉(zhuǎn)化為最具有活性的DHT，進而與AR結(jié)合，引發(fā)信號級聯(lián)反應(yīng)，調(diào)控皮脂腺的生長和分化、毛發(fā)生長、表皮屏障和隨皮脂改變的皮膚微生物組[7,8]。雄激素過多、雄激素受體或者雄激素代謝酶活性增加與皮脂腺增加的活性、皮脂溢出和痤瘡關(guān)系密切。拮抗AR是抗雄激素治療痤瘡的重要靶位。Clascoterone是一種新型局部雄激素受體抑制劑，研究發(fā)現(xiàn)可以通過競爭性結(jié)合AR抑制轉(zhuǎn)錄調(diào)控。本研究體外證實，Clascoterone可抑制雄激素誘導(dǎo)的SZ95人皮脂腺細胞增殖、脂質(zhì)合成并調(diào)節(jié)相關(guān)炎癥因子表達，這可能是其治療痤瘡的潛在機制。

DHT 是最具有活性的雄激素，與AR結(jié)合能力是睪酮5～10倍[9]，我們發(fā)現(xiàn)，DHT顯著誘導(dǎo)皮脂腺細胞增殖，而Clascoterone對DHT誘導(dǎo)的細胞增殖產(chǎn)生時間依賴性的抑制效應(yīng)。相比促增殖作用，雄激素體外單獨促進皮脂腺細胞分化和脂質(zhì)合成的效應(yīng)并不明顯，需要過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)家族的協(xié)同參與，其中PPARδ 激活劑LA誘導(dǎo)分化的作用最強[10]，Barrault等研究也顯示單獨的活性雄激素參與皮脂腺細胞成熟和分化，其作用取決于細胞中功能性 AR 的表達[11]。所以本研究在檢測脂質(zhì)合成上采用LA加入共培養(yǎng)體系放大脂質(zhì)合成效應(yīng)，Clascoterone可以顯著抑制DHT和LA共同作用下的中性脂質(zhì)合成，顯示出明顯的抗脂質(zhì)分泌作用。

皮脂腺細胞的脂質(zhì)合成需要細胞內(nèi)相關(guān)脂質(zhì)基因表達的激活。PPARγ是一種參與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的轉(zhuǎn)錄因子。PPARγ及其靶基因PLIN2、血管生成素樣蛋白4(angiopoietin-like 4，ANGPTL4)在痤瘡皮損中低表達，在非痤瘡皮損的皮脂腺中高表達，對過度的脂質(zhì)積累和炎癥反應(yīng)起到保護作用[12]。它們的激活會增加健康皮脂腺中的脂質(zhì)生成。SREBP 家族調(diào)控脂肪酸、膽固醇生物合成，F(xiàn)ASN、SCD1是SREBP1c的靶基因[13]。SCD1是從飽和脂肪酸前體生物合成單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acid，MUFA)的限速酶，MUFA 在皮脂主要成分甘油三酯、膽固醇酯和蠟酯的形成中作為重要的底物[14]。FASN負責(zé)催化合成長鏈脂肪酸。我們研究發(fā)現(xiàn)Clascoterone能夠下調(diào)DHT和LA誘導(dǎo)的細胞內(nèi)中性脂質(zhì)和脂質(zhì)合成相關(guān)基因的表達，并且在未分化皮脂腺細胞中下調(diào)PPARγ、FASN等部分基因的表達。我們推測Clascoterone抑制脂質(zhì)合成的作用不僅通過拮抗AR，或許也存在獨立于AR的脂質(zhì)調(diào)控途徑，使細胞內(nèi)脂質(zhì)合成處于非亢進的狀態(tài)，從而調(diào)節(jié)尋常痤瘡發(fā)病機制中過度分泌的皮脂及其引起的毛囊皮脂腺微生態(tài)改變。

雄激素在一定程度上參與炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，但在不同條件下可能存在促炎和抗炎兩種作用。Lee等發(fā)現(xiàn)DHT體外上調(diào)了人原代皮脂腺細胞IL-6 和 TNF-α的表達，不排除通過誘導(dǎo)促炎脂質(zhì)而間接參與炎癥因子的產(chǎn)生[15]。Marangoz等發(fā)現(xiàn)DHT會抑制脂多糖誘導(dǎo)的促炎細胞因子而表現(xiàn)出抗炎作用[16]。我們發(fā)現(xiàn)，DHT上調(diào)IL-6的表達，而抑制IL-1α、IL-8的表達。推測可能像在其他疾病模型一樣，雄激素會視細胞所處環(huán)境選擇不同的炎癥調(diào)控方式[17]。另外，我們發(fā)現(xiàn)clascoterone能夠獨立于DHT大幅下調(diào)IL-1α、IL-6、IL-8的表達。人皮脂腺細胞不受病原相關(guān)分子模式刺激的條件下也能表達IL-1α[18]，IL-1α對IL-8有正向調(diào)控作用[19]。Clascoterone可能通過抑制非AR依賴的炎癥信號通路而下調(diào)皮脂腺細胞本底的炎癥介質(zhì)水平。Rosette等發(fā)現(xiàn) clascoterone也下調(diào)了毛囊真皮乳頭細胞促炎介質(zhì)，但不影響促毛囊生長因子的產(chǎn)生，因此針對雄激素性脫發(fā)的治療也具有應(yīng)用前景[20]。

綜上所述，本項研究發(fā)現(xiàn)Clascoterone能夠降低雄激素和亞油酸誘導(dǎo)的皮脂腺細胞內(nèi)中性脂質(zhì)，抑制雄激素誘導(dǎo)的皮脂腺細胞增殖、脂質(zhì)合成相關(guān)基因的表達。另外，Clascoterone能夠抑制皮脂腺細胞本底的炎癥因子產(chǎn)生和分泌。本項研究進一步闡明了Clascoterone治療尋常痤瘡的藥理機制，并且提示存在非依賴AR的作用途徑。