朱紅波，譚莉明，李彩余，周衛(wèi)華

（1.山東第一醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，山東泰安 271000；2.吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)院護(hù)理教研室，湖南吉首 416000；3.湘西自治州人民醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，湖南吉首 416000）

白血病是常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，在人類惡性腫瘤發(fā)病率中居第六位[1]。與實(shí)體瘤不同，血液系統(tǒng)惡性腫瘤不能通過手術(shù)或放射治療治愈，其他新興療法也難以普及，如干細(xì)胞移植存在匹配困難等問題，只能用于少部分患者[2]。因此，化療仍是白血病的主要治療方法，但其不良反應(yīng)和耐藥性已成為化療的主要障礙。K562細(xì)胞系是費(fèi)城（Ph）染色體陽性的多能前體細(xì)胞，最初來源于急變期末期慢性粒細(xì)胞白血病（chronic myeloid leukemia，CML）患者[3]；該細(xì)胞系是非貼壁的、圓形的、高度未分化的，具有活躍的增殖能力和抑制細(xì)胞凋亡的作用。研究表明，中藥中的活性成分通過誘導(dǎo)細(xì)胞分化和凋亡，在白血病治療中發(fā)揮顯著作用[4-6]。因此，惡性造血細(xì)胞可能對(duì)以凋亡和分化信號(hào)通路為靶向的治療特別敏感。探索新型治療藥物及其分子機(jī)制對(duì)改善CML患者的預(yù)后具有重要意義。

植物來源的化合物相對(duì)于化療、手術(shù)和放射療法具有較高成本效益，且毒性較低，并能通過不同的途徑抑制腫瘤。百合科植物重樓，又名七葉一枝花，作為一種中草藥被用于癌癥治療[7-8]。重樓抗腫瘤的主要成分是甾體皂苷。重樓皂苷Ⅶ（PP7）為重樓抗腫瘤活性物質(zhì)的有效成分之一，具有較強(qiáng)的抗癌活性；研究證實(shí)PP7可以通過線粒體和死亡受體途徑誘導(dǎo)SW-480細(xì)胞凋亡并將SW-480細(xì)胞周期阻滯于G1期[9]。PP7能夠抑制PANC-1細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并可能通過下調(diào)PD-L1表達(dá)誘導(dǎo)PANC-1細(xì)胞凋亡[10]，但重樓皂苷Ⅶ在白血病中的抗腫瘤作用未見報(bào)道。本研究旨在通過PP7作用于K562細(xì)胞來探討PP7對(duì)白血病腫瘤細(xì)胞的抑制作用及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、實(shí)驗(yàn)藥物和試劑 細(xì)胞株K562購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫，傳代培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)。重樓皂苷Ⅶ（上海純優(yōu)生物科技有限公司分子式C51H84O22，純度＞98 %，分子量為1 049.2）；細(xì)胞增殖活性試劑盒（CCK-8）購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，Annexin-Ⅴ-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 CCK-8檢測(cè)PP7對(duì)K562細(xì)胞增殖的影響 將呈指數(shù)生長(zhǎng)的K562（1.3×105/mL）接種到96孔板的孔中，分別加入濃度為0.5、1.0、2.0、4.0 μmol/L的PP7，在空白對(duì)照孔中加入等體積的DMEM培養(yǎng)基作空白對(duì)照。每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)重復(fù)，每孔總體積為100 μL。將不含PP7但具有相同濃度(＜0.1%)二甲基亞砜（DMSO）的細(xì)胞用作對(duì)照組(0 μmol/L)。細(xì)胞孵育24 h，然后每孔加入10 μL CCK-8。在CO2培養(yǎng)箱孵育2 h，使用BioRad M450酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm波長(zhǎng)處的光密度(A)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，細(xì)胞增殖抑制率（CVIR）按下式計(jì)算：CVIR=（1－實(shí)驗(yàn)組A450平均值/對(duì)照組A450平均值）×100%，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)選擇最佳PP7濃度。

1.3 熒光素標(biāo)記磷脂酰絲氨酸/碘化丙啶（Annexin-Ⅴ-FITC/PI）試劑盒檢測(cè)PP7對(duì)K562細(xì)胞凋亡的作用 K562細(xì)胞以1.5×105/mL的密度接種于6孔板中，并用不同濃度的PP7處理24 h，使用Annexin-Ⅴ-FITC/PI雙染色通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。將細(xì)胞重懸于100 μL結(jié)合緩沖液中，加入5 μL Annexin-V-FITC和5 μL PI，輕輕混合，將細(xì)胞在室溫下避光孵育15 min，然后加入緩沖液500 μL。在1 h內(nèi)使用BD FACSCantoII流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 免疫印跡法（Western Blot）檢測(cè)Bax、Bcl-2和caspase-9蛋白表達(dá)改變 收取PP7處理過K562細(xì)胞并用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌。通過RIPA裂解緩沖液提取總細(xì)胞蛋白。并使用Bradford試劑測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。根據(jù)蛋白質(zhì)電泳的常規(guī)方法制備凝膠和樣品，并將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上。兔抗人Caspase-9、Bcl-2、Bax和GADPH抗體（上海生工生物工程有限公司），膜孵育過夜。漂洗后，加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（1∶2 000），將膜在振蕩器上孵育2 h。最后，加入化學(xué)發(fā)光試劑用于成像。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以（）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較行Tukey法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PP7對(duì)K562細(xì)胞增殖抑制率的影響 隨著PP7濃度的增加，K562細(xì)胞的生長(zhǎng)逐漸減弱，PP7對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制呈濃度依賴性，見表1。

表1 PP7對(duì)K562細(xì)胞增殖抑制率的影響（）

表1 PP7對(duì)K562細(xì)胞增殖抑制率的影響（）

PP7濃度(μmol/L) 細(xì)胞總抑制(%)0.5 41.32±5.03 1.0 56.03±6.01 2.0 82.36±6.12 4.0 91.34±3.01 8.0 96.73±1.89 F值 125.88 P值 0.002

2.2 PP7對(duì)K562細(xì)胞凋亡的影響 Annexin-V/PI染色法定量檢測(cè)PP7對(duì)K562細(xì)胞引起凋亡的作用。結(jié)果表明，隨著PP7濃度的增加，K562細(xì)胞凋亡的比例逐漸增加，見表2、圖1。

表2 PP7對(duì)K562細(xì)胞凋亡影響（）

表2 PP7對(duì)K562細(xì)胞凋亡影響（）

PP7濃度(μmol/L) 細(xì)胞總抑制(%)空白組 15.74±3.12 0.5 43.16±6.08 1.0 64.32±7.03 2.0 91.74±3.05 F值 357.29 P值 0.007

圖1 不同濃度PP7誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡情況

2.3 Western blot檢測(cè)結(jié)果 通過Westernblot研究PP7處理K562細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，各濃度的PP7都導(dǎo)致Caspase-9裂解的水平顯著增加，見圖2。隨著PP7濃度的增加，抑制Bcl-2表達(dá)的作用越明顯，而凋亡蛋白之一的Bax的表達(dá)顯著增加。

圖2 各濃度PP7對(duì)K562細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響

3 討論

天然產(chǎn)物已被證明是抗腫瘤藥物開發(fā)的可靠來源。PP7是一種天然的皂苷衍生化合物，存在于中草藥重樓的根莖組織中[11]。PP7具有抗炎[12]、止血鎮(zhèn)痛[13]、免疫調(diào)節(jié)[14]等藥理作用，且不良反應(yīng)小，已被廣泛應(yīng)用于臨床。最近有研究顯示，PP7在各種癌細(xì)胞系中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并在體內(nèi)具有抗腫瘤活性，如肺癌和卵巢癌[15]。PP7可通過抑制P-糖蛋白和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來抑制化療耐藥性乳腺癌的生長(zhǎng)并逆轉(zhuǎn)MCF-7/阿霉素耐藥細(xì)胞的多藥耐藥性。PP7降低基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）和MMP-9的活性，提高A549肺癌細(xì)胞中金屬蛋白酶的表達(dá)。PP7可通過p38 MAPK信號(hào)通路抑制MMP-2和MMP-9的產(chǎn)生來抑制遷移和侵襲。PP7可顯著抑制H460細(xì)胞增殖,影響其集落形成，并使細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，抑制細(xì)胞體外的遷移和侵襲能力，并可誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生。這說明PP7具有導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞線粒體功能紊亂的作用，通過調(diào)節(jié)癌細(xì)胞中的幾種信號(hào)通路來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果表明，PP7抑制K562細(xì)胞的生長(zhǎng)，并且該抑制作用與藥物濃度呈正相關(guān)。誘導(dǎo)凋亡可能是PP7抑制K562細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制，通過該機(jī)制可以在K562細(xì)胞中發(fā)揮PP7的抗增殖活性。本研究證明K562細(xì)胞凋亡受PP7處理的影響，0.5～2 μmol/L PP7處理24 h后，K562細(xì)胞凋亡率顯著增加。

線粒體不僅是細(xì)胞內(nèi)能量產(chǎn)生的關(guān)鍵細(xì)胞器，也是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的平臺(tái)，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖、分化、自噬和細(xì)胞免疫中起著至關(guān)重要的作用。線粒體是動(dòng)態(tài)的細(xì)胞器，其分裂和融合的不平衡導(dǎo)致結(jié)構(gòu)變化和功能障礙。細(xì)胞內(nèi)有兩種主要的凋亡途徑：外在（死亡受體途徑）和內(nèi)在（線粒體途徑）。線粒體介導(dǎo)的內(nèi)在凋亡途徑的激活受Bcl-2家族蛋白控制，是抗腫瘤藥物功能中涉及的關(guān)鍵機(jī)制之一。Bcl-2是細(xì)胞凋亡途徑中的上游效應(yīng)分子，已被確定為細(xì)胞凋亡的有效抑制因子[16]。Bax/Bcl-2調(diào)節(jié)細(xì)胞色素C（Cyt C）從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞質(zhì)中的Cyt C啟動(dòng)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)（如Caspase-3/9），導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[17]。PP7處理K562細(xì)胞后，Bcl-2表達(dá)明顯受到抑制，Bax表達(dá)得到促進(jìn)，因此，Bax/Bcl-2顯著增加。半胱天冬酶級(jí)聯(lián)的激活也在線粒體凋亡途徑中起關(guān)鍵作用。Caspase-9是內(nèi)在途徑中Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵起始蛋白，本研究結(jié)果顯示，PP7以濃度依賴性方式顯著增加裂解的Caspase-9的表達(dá)。這提示用PP7處理的K562細(xì)胞是通過線粒體所調(diào)節(jié)的內(nèi)在凋亡途徑而受到抑制。

綜上，本研究為PP7在抗CML細(xì)胞中抗腫瘤活性中的作用提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)，PP7具有成為臨床治療慢性粒細(xì)胞白血病有效藥物的潛力。