劉永昌，聶祝運(yùn)，張 斌，袁志輝，何春蘭

(湖南科技學(xué)院, 化學(xué)與生物工程學(xué)院/湖南省銀杏工程技術(shù)研究中心，湖南永州 425199)

新生多肽結(jié)合復(fù)合體(nascent polypeptide-associated complex，NAC)是由α(NACA)和β(NACB/BTF) 2個(gè)亞基組成的異源二聚體，能夠保護(hù)新生多肽，并引導(dǎo)新生多肽正確定位。結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，2個(gè)亞基的NAC結(jié)構(gòu)域均存在于N端，且三維結(jié)構(gòu)比較相似，但只有NACA的C端存在UBA (ubiquitin-associated) 結(jié)構(gòu)域。另外，某些物種的NACB含有入核信號(hào)，而在NACA中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)[1]。

目前，已經(jīng)在丹參、玉米和水稻等植物中相繼克隆出NACB/BTF3基因，并對(duì)其功能進(jìn)行了研究。在煙草和小麥中，BTF3基因影響了葉綠體和線粒體的發(fā)育，導(dǎo)致植株葉片顏色變黃，葉扭曲[2-4]。在水稻中，過(guò)量表達(dá)BTF3的轉(zhuǎn)基因株系在葉綠素含量、葉綠體數(shù)量、光合速率、葉片大小、株高、節(jié)間長(zhǎng)等方面顯著增加或增強(qiáng)，而 RNAi株系的指標(biāo)則明顯降低或減弱[5]。另外，沉默水稻BTF3使水稻花粉活力明顯降低，種子數(shù)量減少[6]。除了生長(zhǎng)發(fā)育，NACB影響植物對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)。在擬南芥中過(guò)量表達(dá)互花米草NACB后，轉(zhuǎn)基因擬南芥葉綠素含量、脯氨酸含量增加，并且離子動(dòng)態(tài)平衡加強(qiáng)，對(duì)鹽害和干旱有比較強(qiáng)的抵抗力[7]。在小麥中，沉默BTF3降低了植物對(duì)凍害和干旱的抵御能力[8]。沉默辣椒BTF3可以導(dǎo)致超敏反應(yīng)引起的壞死細(xì)胞數(shù)量減少，同時(shí)超敏反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)量下降，煙草花葉病毒的外殼蛋白量增加[9]。過(guò)量表達(dá)水稻BTF3的轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)高鹽和低溫脅迫抗性顯著增強(qiáng)，但抗旱性下降，而 RNAi轉(zhuǎn)基因株系的抗性則減弱[10]。綜上所述，NACB/BTF3不僅調(diào)控了植物的生長(zhǎng)發(fā)育，而且在植物響應(yīng)各種脅迫的過(guò)程中也發(fā)揮了重要作用。

雖然NACA和NACB可以形成異源二聚體，但是二者在細(xì)胞內(nèi)的生物學(xué)功能并不相同。NACA可以直接或間接對(duì)靶基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控，從而影響細(xì)胞分化、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫、細(xì)胞凋亡等生物學(xué)過(guò)程[11-12]。作為新合成的多肽運(yùn)出核糖體的通道組分，NACA可以結(jié)合到新生多肽鏈上，調(diào)節(jié)信號(hào)識(shí)別顆粒與新生多肽的結(jié)合，影響新生多肽轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)[13]。在植物中，關(guān)于NACA功能的研究鮮有報(bào)道。有研究表明，煙草灰霉病PebC1與NACA同源。PebC1的誘導(dǎo)可以加快小麥的苗期生長(zhǎng)速度，并且提高小麥的抗旱性。在番茄中，PebC1的誘導(dǎo)不僅可以提高植株對(duì)番茄灰霉病的抵抗能力，并且在PebC1處理后，植株中與抗病調(diào)節(jié)相關(guān)的苯丙氨酸解氨酶、過(guò)氧化物酶、多酚氧化酶的活性都有不同程度的增加[14]。蛋白組分析表明，水稻受到鹽和低溫脅迫時(shí)，NACA表達(dá)水平下調(diào)，但其具體生物學(xué)功能及作用機(jī)制仍然不清楚[15-16]。以上結(jié)果暗示，NACA可能在植物響應(yīng)非生物脅迫的過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。本研究從水稻中鑒定到5個(gè)編碼NACA蛋白的基因，并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和表達(dá)模式的研究。同時(shí)，利用轉(zhuǎn)基因擬南芥初步研究了NACA2在植物抗旱過(guò)程中的功能，為進(jìn)一步研究NACA基因在水稻抗逆過(guò)程中的生物學(xué)功能及作用機(jī)制提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理

試驗(yàn)材料擬南芥(Arabidopsisthaliana)為哥倫比亞野生型，水稻為粳稻品種‘日本晴’(Oryzasalivasubsp keng)，農(nóng)桿菌菌株EHA105、大腸桿菌菌株XL1-blue均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

選取飽滿無(wú)霉的水稻種子，去殼，然后用75%酒精消毒1～2 min，再用次氯酸鈉溶液消毒45 min，用無(wú)菌水沖洗4～5次，將其播種到MS培養(yǎng)基上，置于培養(yǎng)箱中(濕度為28 ℃，光照強(qiáng)度為6 000～8 000 Lx，12 h光照/12h黑暗)培養(yǎng)15 d。將水稻幼苗轉(zhuǎn)移至液體MS培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)2 d，然后用含有100 μmol/L JA、100 μmol/L SA、100 μmol/L ABA、300 mmol/L甘露醇和250 mmol/L NaCl的液體MS培養(yǎng)基及4 ℃低溫，分別處理0、1、3、6、12和24 h后取樣，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 NACA蛋白的鑒定及生物信息學(xué)分析利用擬南芥NACA蛋白序列做探針序列，對(duì)Phytozome(https://phytozome-next.jgi.doe.gov/)中的水稻蛋白組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，獲取基因號(hào)、基因組序列、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物序列、氨基酸序列。在SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)和NCBI保守結(jié)構(gòu)域(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)預(yù)測(cè)NACA蛋白結(jié)構(gòu)域，進(jìn)一步確定氨基酸序列中是否包含NAC和UBA結(jié)構(gòu)域。利用ExPASy(https://web.expasy.org/protparam/)在線預(yù)測(cè)NACA蛋白的等電點(diǎn)、分子量和不穩(wěn)定系數(shù)。利用PSORT(HTTP://www.genscript.com/psort.html)預(yù)測(cè)NACA蛋白的亞細(xì)胞定位。利用GSDS(http://gsds.gao-lab.org/)在線分析水稻NACA基因外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。通過(guò)MEME(https://meme-suite.org/meme/)在線分析氨基酸序列中的保守基序，最短基序?yàn)?，最長(zhǎng)的基序?yàn)?0，共顯示10個(gè)保守基序。利用ClustalW(https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw)對(duì)水稻NACA氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，保存為MSF格式，然后利用GeneDoc對(duì)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行編輯。從Phytozome及NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取臍形紫菜(Porphyraumbilicalis)、大豆 (Glycinemax)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)等物種NACA同源蛋白序列，用MEGA6.0軟件采用鄰接法(Boot strap=1 000)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，分析不同物種NACA的進(jìn)化關(guān)系。

1.2.2NACA的表達(dá)模式分析利用MSU-RGAP(http://rice.uga.edu/index.shtml)數(shù)據(jù)庫(kù)獲取5個(gè)NACA基因在不同組織中的表達(dá)數(shù)據(jù)，利用HemI 1.0繪制表達(dá)量熱圖。

利用RNA提取試劑盒提取不同脅迫處理后水稻樣品的總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(聚合美)合成cDNA，保存到-80 ℃?zhèn)溆?。?shí)時(shí)熒光定量PCR在美國(guó)伯樂(lè)CFX Connect上進(jìn)行，利用NACA基因特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以Actin基因做內(nèi)參(表1)。反應(yīng)體系為10 μL，分別包括1 μL cDNA，上下游引物各0.4 μL，SYBRgreen Mix 5 μL, ddH2O 3.2 μL；反應(yīng)參數(shù)為94 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃變性15 s，55 ℃退火20 s, 72 ℃延伸30 s, 45個(gè)循環(huán)。每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，采用2-ΔΔCt法分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)分析、繪圖。

1.2.3 NACA2的亞細(xì)胞定位利用基因特異引物 (表1)克隆NACA2全長(zhǎng)的CDS (coding sequences)，用同源重組方法克隆到pBWA(V)HS。再利用35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)NACA2-GFP在水稻原生質(zhì)體中表達(dá)融合蛋白，以空載體作為對(duì)照。將構(gòu)建好的載體pBWA(V)HS-NACA2-GFP及核定位信號(hào)(nucleus localization signal, NLS)融合紅色熒光蛋白mkate的載體共同轉(zhuǎn)化水稻原生質(zhì)體，利用熒光共聚焦顯微鏡觀察熒光信號(hào)，進(jìn)行NACA2亞細(xì)胞定位。

表1 引物序列

1.2.4NACA2轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)擬南芥種子通過(guò)10% NaClO消毒15 min，用無(wú)菌水清洗4～5次。將消毒后的種子鋪在1/2 MS培養(yǎng)基中，4 ℃處理3 d，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)室中(濕度為22 ℃，光照強(qiáng)度為6 000～8 000 Lx，12 h光照/12 h黑暗)。將萌發(fā)5 d后幼苗移至1/2 MS及含有150 mmol/L 甘露醇的1/2 MS培養(yǎng)基上，豎直培養(yǎng)，5～7 d后測(cè)量主根長(zhǎng)。將萌發(fā)14 d后幼苗種植到營(yíng)養(yǎng)土中，1周后開(kāi)始停止?jié)菜?，進(jìn)行干旱處理。出現(xiàn)干旱表型后開(kāi)始拍照，復(fù)水，稱(chēng)量不同株系地上部分重量。在土壤中生長(zhǎng)2周后，剪取不同株系相同位置的葉片放置到稱(chēng)量紙上，每個(gè)重復(fù)3個(gè)葉片，每隔3 h稱(chēng)量1次，計(jì)算失水速率。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel處理，每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻NACA基因的鑒定與生物信息分析

通過(guò)序列比對(duì)和結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，水稻中共有5個(gè)NACA家族成員，命名為NACA1～NACA5，其中NACA1具有2個(gè)轉(zhuǎn)錄本。理化性質(zhì)分析結(jié)果表明，NACA基因長(zhǎng)度在578～2 759 bp之間，編碼蛋白分子量為12 943.14～57 239.89 Da，編碼的氨基酸長(zhǎng)度為122～516 aa。NACA蛋白的等電點(diǎn)為4.28～8.63，其中NACA4的等電點(diǎn)為8.63，與其他蛋白差異較大。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，NACA蛋白亞細(xì)胞定位均為細(xì)胞核、線粒體和細(xì)胞質(zhì)，但是定位在細(xì)胞核的可能性最大。蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為48.73～71.82，其中NACA4為71.82，說(shuō)明NACA蛋白均為不穩(wěn)定蛋白，容易被降解(表2)。

表2 水稻NACA基因家族成員信息

進(jìn)化和結(jié)構(gòu)分析表明，NACA1和NACA3親緣關(guān)系最近，NACA2、NACA4和NACA5有較近的進(jìn)化關(guān)系 (圖1和圖3)。親緣關(guān)系較近的蛋白也含有相似保守基序，基序分布也相似。NACA1和NACA3含有motif1、motif2、motif3、motif7，但不含有motif4。NACA2、NACA4和NACA5中都含有motif1、motif4、motif7 和 motif10 (圖1)。為了進(jìn)一步研究NACA蛋白的結(jié)構(gòu)，對(duì)水稻NACA蛋白序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果表明，NACA中含有3個(gè)保守區(qū)域，位于N端的富含天冬氨酸(D)結(jié)構(gòu)域、位于中間的NAC結(jié)構(gòu)域及位于C端的UBA結(jié)構(gòu)域，其中NACA5與NACA4序列相似度很高，但缺少部分NAC結(jié)構(gòu)域和UBA結(jié)構(gòu)域 (圖2)。為了研究NACA蛋白的進(jìn)化關(guān)系，將藻類(lèi)、苔蘚、蕨類(lèi)和種子植物中一些物種的NACA和水稻NACB構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果表明，水稻3個(gè)NACB與進(jìn)化樹(shù)中所有的NACA分化明顯，單獨(dú)分成一支，說(shuō)明NACA與NACB的差別不僅在于是否存在UBA結(jié)構(gòu)域，其蛋白序列也存在明顯的不同。不同物種中的NACA的分化與物種的進(jìn)化關(guān)系相一致，親緣關(guān)系由遠(yuǎn)到近分別為藻類(lèi) > 苔蘚> 蕨類(lèi)> 種子植物。種子植物中的NACA分為2個(gè)亞家族，且每個(gè)亞家族中單子葉植物與雙子葉植物分化明顯 (圖3)。

A. NACA基因的基因結(jié)構(gòu)；B. NACA蛋白保守基序分析

黑框內(nèi)為富含天冬氨酸結(jié)構(gòu)域；紅框內(nèi)為NAC結(jié)構(gòu)域，藍(lán)框內(nèi)為UBA結(jié)構(gòu)域

Pu. 臍形紫菜; Bb. 布朗葡萄藻; Cp. 角齒蘚; Mp. 傘地錢(qián); Sm. 江南卷柏; Gm. 大豆; At. 擬南芥; Os. 水稻；Sb. 高粱

2.2 NACA基因的組織表達(dá)及誘導(dǎo)表達(dá)分析

基于MSU-RGAP數(shù)據(jù)庫(kù)的組織表達(dá)模式分析表明，NACA在水稻多種組織均有表達(dá)，且表達(dá)有明顯差異。NACA1和NACA3基因在水稻各組織中表達(dá)水平較高，在花序中的表達(dá)量最高，但在葉片、花藥、胚乳和授粉后10 d的種子中表達(dá)量較低。NACA2基因在水稻葉片、花和莖中有較高的表達(dá)量，在莖中的表達(dá)量最高，但在其他組織中表達(dá)水平較低。NACA4和NACA5基因在多數(shù)水稻組織中表達(dá)較低，但在莖和幼苗中表達(dá)量相對(duì)較高 (圖4)。

右側(cè)顏色標(biāo)尺從藍(lán)到紅表示基因表達(dá)量從低到高。 1-13代表不同類(lèi)型的水稻組織，分別為20 d的葉片(1)、抽穗后的花(2)、抽穗前的花(3)、愈傷(4)、雌蕊(5)、授粉后25 d A的胚(6)、授粉后5 d的種子(7)、授粉后10 d的種子(8)、圓錐花序(9)、授粉后25 d的胚乳(10)、幼苗(11)、花絲(12)和莖(13)

為了研究NACA基因?qū)Ψ巧锩{迫的響應(yīng)，通過(guò)qRT-PCR技術(shù)分析了5個(gè)NACA基因在JA、SA、低溫、ABA、NaCl和甘露醇處理后的表達(dá)模式。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在JA誘導(dǎo)后，NACA1、NACA2和NACA5的表達(dá)量先降低，后期略有升高，而NACA3和NACA4表達(dá)量變化不大 (圖5, A)。在SA誘導(dǎo)后，NACA1的表達(dá)水平隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，NACA2的表達(dá)量隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，NACA4表現(xiàn)出降升降的表達(dá)趨勢(shì)，而NACA3和NACA5的表達(dá)水平則先升高再降低，分別在處理12 h和1 h達(dá)到最高值 (圖5, B)。在低溫處理后，NACA5表現(xiàn)出升降升降的表達(dá)模式，在處理后1和12 h出現(xiàn)高峰，其他基因變化不大 (圖5, C)。ABA處理后，NACA1和NACA4基因的表達(dá)量持續(xù)降低，而NACA1、NACA3和NACA5基因雖然在ABA處理后表達(dá)水平持續(xù)降低，但在處理24 h時(shí)表達(dá)量又增加 (圖5, D)。NaCl和甘露醇處理后，NACA基因的表達(dá)模式與ABA處理類(lèi)似，都表現(xiàn)出先下降再上升的趨勢(shì)。NaCl處理后，NACA5的表達(dá)量表現(xiàn)為升降升的趨勢(shì)，處理1 h達(dá)到峰值，處理3 h達(dá)到最低值，然后升高 (圖5, E和F)。

A. 100 μmol/L JA；B. 100 μmol/L SA；C. 4 ℃；D. 100 μmol/L ABA；E. 250 mmol/L NaCl；F. 300 mmol/L 甘露醇。不同小寫(xiě)字母表示不同基因同一時(shí)間差異顯著(P≤0.05)

2.3 NACA2的亞細(xì)胞定位分析

為研究NACA蛋白的亞細(xì)胞定位，構(gòu)建NACA2-GFP融合蛋白表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化水稻原生質(zhì)體，利用共聚焦顯微鏡觀察熒光信號(hào)。結(jié)果顯示，GFP熒光信號(hào)分布在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，NACA2-GFP融合蛋白的綠色熒光信號(hào)也分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，與對(duì)照相似(圖6, A)。為了進(jìn)一步明確NACA2是否定位在細(xì)胞核內(nèi)，在水稻原生質(zhì)體中共表達(dá)NACA2-GFP與核定位的NLS-mkate融合蛋白，進(jìn)行共定位。結(jié)果表明，NLS-mkate具有明顯的核定位，二者在細(xì)胞核的部位能夠很好的重疊(圖 6, B)。由此表明，NACA2蛋白定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。

A.NACA2在水稻原生質(zhì)體中的亞細(xì)胞定位；B.NACA2與NLS-mkate在水稻原生質(zhì)體中的共定位

2.4 過(guò)表達(dá)NACA2轉(zhuǎn)基因擬南芥抗旱性分析

為了研究NACA2的生物學(xué)功能，將其在擬南芥中過(guò)量表達(dá)，并通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因擬南芥中NACA2的表達(dá)水平。結(jié)果表明，野生型擬南芥中檢測(cè)不到NACA2的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，但其在轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)量很高 (圖7，A)。

為了進(jìn)一步研究NACA2對(duì)植物抗旱性的影響，將純合的轉(zhuǎn)基因株系和野生型進(jìn)行干旱處理。干旱處理23 d后，野生型和轉(zhuǎn)基因株系都出現(xiàn)了明顯的萎蔫現(xiàn)象。相對(duì)于野生型，轉(zhuǎn)基因株系萎蔫程度較輕，顏色比較綠。復(fù)水處理后，擬南芥均開(kāi)始恢復(fù)，葉片開(kāi)始展開(kāi)。與野生型相比，轉(zhuǎn)基因株系復(fù)水速度明顯更快，復(fù)水時(shí)間越長(zhǎng)差異越明顯 (圖7, B)。復(fù)水后，轉(zhuǎn)基因株系地上部生物量均比野生型大，野生型為1.63 g，而轉(zhuǎn)基因株系分別為2.59和1.97 g (圖5, C)。葉片失水實(shí)驗(yàn)表明，NACA2轉(zhuǎn)基因擬南芥的失水速率均比野生型慢。失水12 h后，株系9#的重量下降到原始重量的73.78%，而野生型為 55.57% (圖7, D)。另外，在含有甘露醇的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)1周后，NACA2過(guò)表達(dá)擬南芥的主根明顯長(zhǎng)于野生型，說(shuō)明NACA2過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了擬南芥對(duì)滲透脅迫的抗性 (圖7, E和F)。

A.NACA2表達(dá)分析；B.抗旱實(shí)驗(yàn): 處理23 d(左)和復(fù)水5 h(右)；C.復(fù)水實(shí)驗(yàn)；D.失水速率分析，不同小寫(xiě)字母表示不同株系同一時(shí)間差異顯著(P≤0.05)；E、F.甘露醇抗性分析；不同小寫(xiě)字母表示處理間差異顯著(P≤0.05)

3 討 論

相比于NACB，NACA在酵母和動(dòng)物細(xì)胞中研究較多，在植物中的研究非常少，其生物學(xué)功能還不清楚。前人從水稻中鑒定了3個(gè)NACA基因，即NACA1、NACA2和NACA3，但本研究中還鑒定出了NACA4和NACA5。NACA4和NACA5編碼的蛋白序列的相似性較高，但NACA5蛋白序列較短，缺少部分NAC結(jié)構(gòu)域和UBA結(jié)構(gòu)域，可能是基因在復(fù)制的過(guò)程中出現(xiàn)了缺失。研究發(fā)現(xiàn)，NACA和NACB蛋白相似性不高，但他們的三維結(jié)構(gòu)非常類(lèi)似[17]。相比DNA，NACA同源二聚體的NAC結(jié)構(gòu)域會(huì)更強(qiáng)烈地結(jié)合RNA，因此NACA被認(rèn)為是RNA結(jié)合蛋白，可能在轉(zhuǎn)錄因子與染色質(zhì)結(jié)合中發(fā)揮作用[18]。那么，水稻中的NACA能否獨(dú)立作為轉(zhuǎn)錄因子或輔助因子調(diào)控下游基因表達(dá)？NACA獨(dú)有的UBA結(jié)構(gòu)域是一個(gè)廣泛存在于與泛素-蛋白酶體降解系統(tǒng)相關(guān)蛋白上的結(jié)構(gòu)域。UBA不參與二聚體的形成，但是可以使二聚體更加穩(wěn)定[19]。不穩(wěn)定系數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，水稻NACA的不穩(wěn)定系數(shù)較高，在48.73～71.82之間，屬于不穩(wěn)定蛋白。有研究表明，許多包含UBA結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)能特異地與泛素相互作用，依靠26S蛋白酶體調(diào)節(jié)蛋白的降解。因此，帶有UBA結(jié)構(gòu)域的NACA可能具有獨(dú)特的生物學(xué)功能，如調(diào)控了NAC復(fù)合體或NACB的穩(wěn)定性及定位。在水稻中，突變UBA結(jié)構(gòu)域是否會(huì)影響NACA自身或NAC復(fù)合體的穩(wěn)定性，最終改變水稻生長(zhǎng)發(fā)育或響應(yīng)脅迫的生物學(xué)過(guò)程？除了NAC和UBA結(jié)構(gòu)域以外，水稻NACA蛋白的N端還存在一段富含天冬氨酸的肽段，但其具體功能還不清楚。SPARC (secreted protein, acidic and rich in cysteine) 是富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白，其N(xiāo)端為高度酸性區(qū)的結(jié)構(gòu)域，富含天冬氨酸和谷氨酸，能夠以較低的親和力與Ca2+結(jié)合[20]。擬南芥細(xì)胞分裂素響應(yīng)調(diào)節(jié)因子ARRS (Arabidopsisresponse regulators) 的N端也存在一個(gè)富含天冬氨酸的信號(hào)接收結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包括順式作用元件，也可以被磷酸化，從而調(diào)控其穩(wěn)定性[21]。多效的轉(zhuǎn)錄因子PURα(purine-rich element binding protein alpha) 的C端具有富含谷氨酸和天冬氨酸的結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域?qū)τ赑URα與其他蛋白相互作用非常重要[22]。由此可見(jiàn)，富含天冬氨酸的結(jié)構(gòu)域可能結(jié)合金屬離子、磷酸基團(tuán)或與其他蛋白相互作用。因此，通過(guò)突變、刪除和編輯等手段系統(tǒng)研究NAC、UBA和富含天冬氨酸結(jié)構(gòu)域的功能對(duì)于解釋NACA蛋白發(fā)揮作用的分子機(jī)理具有重要的意義。

NAC是一個(gè)具有多種功能的蛋白復(fù)合體, 包括保護(hù)新生肽鏈、調(diào)控新生肽轉(zhuǎn)位進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體等。酵母和動(dòng)物細(xì)胞中的研究表明，NACA在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起作用，能與輔激活類(lèi)蛋白相互作用、激活骨鈣素基因、正向調(diào)控人紅細(xì)胞分化、調(diào)節(jié)肌發(fā)生等。有研究表明，煙草灰霉病NACA的同源基因PebC1可以加快小麥的苗期生長(zhǎng)速度，并且提高其干旱抗性。在番茄中，PebC1蛋白的誘導(dǎo)不僅可以提高植株對(duì)番茄灰霉病的抵抗能力，并且在處理后，番茄植株中和植物抗病調(diào)節(jié)相關(guān)的苯丙氨酸解氨酶、過(guò)氧化物酶、多酚氧化酶的活性都有不同程度的增加[14]，暗示NACA可能參與細(xì)胞應(yīng)對(duì)外界環(huán)境脅迫的過(guò)程。水稻中，NACA2和NACA5受到高鹽、甘露醇、低溫、SA、JA處理的顯著調(diào)控，其中NACA2最為明顯。過(guò)表達(dá)NACA2減慢了擬南芥葉片的失水速率，增強(qiáng)擬南芥對(duì)干旱和滲透脅迫的抗性，但NACA基因在水稻響應(yīng)外界脅迫過(guò)程中是否發(fā)揮了作用？另外，5個(gè)NACA基因具有明顯的組織表達(dá)特異性，尤其是NACA1、NACA2和NACA3在花、花序、種子和胚乳中的表達(dá)量較高。最近研究表明，擬南芥NACA5負(fù)調(diào)控了花粉管的伸長(zhǎng)[18]。在水稻中，編碼β亞基的Osj10gBTF3影響葉綠體蛋白的輸入，從而調(diào)控了花粉的發(fā)育[23]。以上結(jié)果暗示，NACA基因可能在調(diào)控水稻生殖生長(zhǎng)的過(guò)程中起作用。本研究對(duì)水稻NACA基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)不同的基因具有明顯的組織和誘導(dǎo)表達(dá)模式，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)NACA2基因調(diào)控了擬南芥對(duì)干旱和滲透脅迫的抗性。在后續(xù)研究中，通過(guò)過(guò)表達(dá)、抑制表達(dá)和基因編輯等手段深入研究NACA基因在水稻生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆過(guò)程中的生物學(xué)功能和作用機(jī)制，可以為豐富水稻抗逆的分子機(jī)制及抗逆育種提供了參考。