張石豐，陳艷樂，余耀華，楚玉潔

鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，鄭州 450000

肺癌是常見的惡性腫瘤之一，根據(jù)組織類型分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），其中，NSCLC占所有肺癌類型的80%以上。早期NSCLC患者可無明顯癥狀，與肺部感染等疾病的癥狀相似，容易被誤診從而延誤治療時機[1]。NSCLC的轉(zhuǎn)移以直接擴散、血行轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為主，一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，臨床治療難度將明顯增高，生存率明顯降低[2]。隨著細胞與生物分子學(xué)研究的發(fā)展，NSCLC發(fā)生及轉(zhuǎn)移的分子機制與腫瘤治療的新靶點逐漸被關(guān)注?？扇苄訠7-H4蛋白（soluble B7-H4 protein，sB7-H4）是 B7家族新成員，在卵巢癌、乳腺癌等腫瘤中表達明顯上調(diào)，具有減弱腫瘤免疫應(yīng)答作用[3]。溴結(jié)構(gòu)域蛋白4（bromodomain-containing protein 4，BRD4）是布羅莫結(jié)構(gòu)蛋白BET家族成員，與多種惡性腫瘤患者的預(yù)后密切相關(guān)，其與NSCLC的關(guān)系一直是臨床研究的熱點[4]。此外，S100鈣結(jié)合蛋白A4（S100 calcium binding protein A4，S100A4）與多種細胞內(nèi)活動有關(guān)，與腫瘤關(guān)系的研究也越來越多[5]。本研究探討sB7-H4、BRD4及S100A4蛋白在NSCLC中的表達及與患者預(yù)后的關(guān)系，旨在為臨床NSCLC的治療提供參考，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年2月至2018年8月鄭州市中心醫(yī)院收治的NSCLC患者。納入標準：①經(jīng)病理學(xué)檢查確診為NSCLC；②臨床資料完整且真實；③接受的治療方案相同。排除標準：①合并血液系統(tǒng)疾?。虎诤喜乐鼐窦膊』虬V呆；③合并其他原發(fā)性惡性腫瘤。依據(jù)納入和排除標準，本研究共納入98例NSCLC患者，其中男52例，女46例；年齡25～70歲，平均（56.71±8.82）歲。同期選取50例肺良性病變患者，其中男26例，女24例；年齡25～72歲，平均（56.75±8.79）歲。兩組患者性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準通過，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 免疫組化法檢測sB 7-H 4、BRD 4及 S100 A 4蛋白的表達情況

取98例NSCLC患者的腫瘤組織及50例肺良性病變患者的正常肺組織，石蠟包埋，2 μm切片，烘烤60℃，二甲苯脫蠟，浸泡3次。抗原修復(fù)切片在離子水中浸泡3次，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）沖洗3次。滴加內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，室溫孵育15 min，沖洗。觀察組滴加一抗（G-蛋白偶聯(lián)受體124多克隆抗體，稀釋濃度為1∶100），室溫孵育1 h，沖洗；滴加辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠或羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）聚合物，室溫孵育30 min。對照組以PBS代替一抗；滴加山羊抗兔二抗（eBioscience）室溫孵育30 min。二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，樹膠封片。

根據(jù)陽性細胞所占比例及染色強度進行結(jié)果判定[6]：無陽性細胞計0分，陽性細胞所占比例＜25%計1分，陽性細胞所占比例為26%～50%計2分，陽性細胞所占比例＞50%計3分；無著色計0分，黃色染色計1分（弱陽性），淺棕色染色計2分（中等陽性），棕褐色染色計3分（強陽性）。將陽性細胞所占比例及染色強度評分相加，0～3分為無表達或低表達，4～6分為高表達。

1.3 隨訪方法

所有患者治療結(jié)束后采用門診復(fù)查或微信、電話方法進行為期2年的隨訪，隨訪時間截至2020年8月30日，記錄兩組患者的預(yù)后情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；NSCLC患者預(yù)后的影響因素采用多因素Logistic回歸分析；繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，計算曲線下面積（area under the curve，AUC），評估sB7-H4、BRD4、S100A4單獨及聯(lián)合檢測對NSCLC患者預(yù)后的預(yù)測價值；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 sB 7-H 4、BRD 4及 S100 A 4蛋白表達情況的比較

腫瘤組織中sB7-H4、BRD4及S100A4蛋白高表達率均明顯高于正常肺組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。（表1）

表1 肺癌組織與正常肺組織中sB 7-H 4、BRD 4及 S100 A 4蛋白表達情況的比較

2.2 不同預(yù)后情況NSCLC患者腫瘤組織中sB 7-H 4、BRD 4及 S100 A 4蛋白表達情況的比較

隨訪2年，98例NSCLC患者生存73例，死亡25例。死亡NSCLC患者腫瘤組織中sB7-H4、BRD4及S100A4蛋白高表達率均高于生存患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（表2）

表2 不同預(yù)后情況NSCLC患者腫瘤組織中sB 7-H 4、BRD 4及 S100 A 4蛋白表達情況的比較

2.3 NSCLC患者預(yù)后生存影響因素的單因素和多因素分析

單因素分析結(jié)果顯示，NSCLC患者的生存可能與病理類型、遠處轉(zhuǎn)移情況、分化程度、腫瘤直徑、TNM分期、sB7-H4蛋白表達情況、BRD4蛋白表達情況、S100A4蛋白表達情況有關(guān)（P＜0.05），與年齡可能無關(guān)（P＞0.05）。多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，有遠處轉(zhuǎn)移、分化程度為低中分化、TNM分期為Ⅲ+Ⅳ期、sB7-H4蛋白高表達、BRD4蛋白高表達、S100A4蛋白高表達均是NSCLC患者預(yù)后生存的獨立危險因素（P＜0.01）。（表3）

表3 NSCLC患者預(yù)后生存影響因素的單因素和多因素分析

2.4 sB 7-H 4、BRD 4及 S100 A 4單獨及聯(lián)合檢測對NSCLC患者死亡的預(yù)測價值

ROC曲線顯示，sB7-H4+BRD4+S100A4聯(lián)合檢測預(yù)測NSCLC患者死亡的AUC為0.890（95%CI：0.751～1.000），高于三者單獨檢測的0.809、0.850、0.764。（表4、圖1）

表4 sB 7-H 4、BRD 4及 S100 A 4單獨及聯(lián)合檢測對NSCLC患者死亡的預(yù)測價值

圖1 sB 7-H 4、BRD 4及 S100 A 4單獨及聯(lián)合檢測預(yù)測NSCLC患者預(yù)后死亡的ROC曲線

3 討論

肺癌是發(fā)病率最高的惡性腫瘤，也是全球范圍內(nèi)最常見的腫瘤相關(guān)死亡原因，中國每年新發(fā)肺癌約75萬例[7]。超過80%的肺癌類型為NSCLC，其中30%為鱗狀細胞癌，約50%的患者確診時就已經(jīng)處于晚期[8]。免疫治療是近年來肺癌治療領(lǐng)域的新突破，使NSCLC的治療方法明顯進步，但部分患者的治療效果仍不理想，預(yù)后較差。因此，早診斷、有效治療對NSCLC患者的預(yù)后至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC的發(fā)生發(fā)展是多種基因、細胞因子共同作用的結(jié)果，因此，開發(fā)NSCLC早期診斷的標志物及分子治療新靶點成為臨床治療的新方向[9]。

sB7-H4屬于免疫球蛋白超家族成員，其通過抑制CD4+T細胞的表達，促進細胞周期，刺激白細胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）對T細胞發(fā)揮負性調(diào)節(jié)作用，產(chǎn)生免疫應(yīng)答，參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[10]。目前，sB7-H4已經(jīng)被證明具有抗腫瘤作用，但主要集中于sB7-H4作為腫瘤抑制基因抑制卵巢癌進展方面，關(guān)于其對NSCLC的研究報道甚少[11]。本研究結(jié)果顯示，sB7-H4在NSCLC患者中高表達，且其高表達是NSCLC患者預(yù)后生存的獨立危險因素，提示sB7-H4蛋白對NSCLC患者的預(yù)后有重要的預(yù)測價值。

BRD4由4個α螺旋及2個螺旋莖環(huán)構(gòu)成，屬于布羅莫結(jié)構(gòu)蛋白BET家族成員。BRD4通過布羅莫結(jié)構(gòu)域與核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的RelA亞基結(jié)合，共同刺激NF-κB的轉(zhuǎn)錄激活，對感染的免疫反應(yīng)有重要作用[12]。既往文獻認為，BRD4高表達可抑制機體的免疫反應(yīng)、促進腫瘤細胞生長、侵犯脈管形成癌栓，從而導(dǎo)致腫瘤細胞轉(zhuǎn)移，使疾病進展更快[13]。本研究結(jié)果顯示，觀察組患者的BRD4蛋白高表達率明顯高于對照組（P＜0.01），且BRD4高表達患者的預(yù)后更差，與既往報道結(jié)果相一致。表明BRD4表達與NSCLC患者的預(yù)后密切相關(guān)，可作為評估患者預(yù)后的有效指標及新的治療靶點。同時，本研究結(jié)果顯示，有遠處轉(zhuǎn)移、分化程度為低中分化、TNM分期為Ⅲ+Ⅳ期、sB7-H4蛋白高表達、BRD4蛋白高表達均是NSCLC患者預(yù)后生存的獨立危險因素。分析其原因可能為：BRD4能夠上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子的表達及微血管密度，并可啟動細胞凋亡控制程序，而突變型BRD4則會減少細胞凋亡，促進腫瘤細胞的表型轉(zhuǎn)化和增殖，增強腫瘤的侵襲行為，因此，BRD4高表達可能導(dǎo)致高TNM分期及轉(zhuǎn)移[14]。

S100A4蛋白是鈣結(jié)合蛋白家族成員，一方面可激活纖溶酶原，誘導(dǎo)血管生成；另一方面可使腫瘤細胞與成纖維細胞、平滑肌細胞、內(nèi)皮細胞、炎細胞及神經(jīng)細胞等細胞間質(zhì)發(fā)生互換，促進腫瘤血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移。有研究結(jié)果顯示，腫瘤細胞體外培養(yǎng)中，檢測到了S100A4的存在，其與致癌基因發(fā)揮了協(xié)同促腫瘤作用[15]。同時，S100A4蛋白在乳腺癌細胞間質(zhì)中的表達高于正常乳腺組織[16]。本研究結(jié)果顯示，觀察組患者的S100A4蛋白高表達率明顯高于對照組，且其高表達是NSCLC患者預(yù)后生存的獨立危險因素，有力證明了S100A4蛋白與NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系，可作為預(yù)后評估的有效指標。本研究ROC曲線顯示，sB7-H4、BRD4及S100A4蛋白聯(lián)合檢測對NSCLC患者死亡的預(yù)測價值最佳，表明聯(lián)合檢測可作為預(yù)測患者死亡的有效手段。

綜上所述，sB7-H4、BRD4及S100A4蛋白在NSCLC患者中高表達，且高表達是影響NSCLC患者預(yù)后生存的獨立危險因素，三指標聯(lián)合檢測對患者的預(yù)后評估有重要價值。