秦中強,談燚,張?zhí)m,譚玉林#
蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院1介入科,2肝膽外科,安徽 蚌埠 233000
肝癌發(fā)病率居全球第六位,病死率居第四位,每年新發(fā)肝癌約84.1萬例,病死約78.2萬例[1],給社會和家庭帶來了巨大負擔。手術(shù)切除仍是早期肝癌患者的首選治療方案,但由于各種原因,肝癌切除術(shù)后患者的5年復發(fā)率高達70%[2]。目前,尚沒有明確的輔助療法可供患者預防或減少術(shù)后轉(zhuǎn)移和新發(fā)腫瘤風險,肝癌切除術(shù)后患者的預后仍不理想。此外,肝癌患者在接受手術(shù)切除后,應(yīng)激反應(yīng)和相關(guān)免疫抑制機制被激活,可能導致腫瘤細胞轉(zhuǎn)移[3]。因此,尋找新的藥物延緩肝癌的發(fā)生發(fā)展、減少術(shù)后轉(zhuǎn)移風險是臨床研究的重點。
多酚類黃酮被廣泛認為是天然的、無毒的化學預防劑,這些多酚類物質(zhì)多具有顯著的抗氧化、抗炎和抗腫瘤特性。槲皮素作為這些多酚類黃酮的主要代表,存在于水果、飲料和蔬菜中[4-5],表現(xiàn)出卓越的抗氧化和抗腫瘤潛力[6],從而吸引了相關(guān)研究者的注意。研究顯示,槲皮素在抑制肝癌細胞的氧化應(yīng)激、轉(zhuǎn)移和促進凋亡等過程中發(fā)揮了一定的作用[7-8]。因此,肝癌治療過程中,槲皮素通過哪些具體的通路抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展值得進一步研究。目前,在藥物和疾病間具體通路機制的研究中,網(wǎng)絡(luò)藥理學作為一種新型的研究方法發(fā)揮了重要的作用。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學與分子對接技術(shù),探討槲皮素治療肝癌的核心基因和具體的分子機制,以期為基礎(chǔ)研究、臨床藥物研發(fā)提供新思路,現(xiàn)報道如下。
通過中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology,TCMSP)(http://tcmspw.com/)和 PharmMapper數(shù)據(jù)庫(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/),以“quercetin”為關(guān)鍵詞檢索槲皮素的作用靶點,靶點種類設(shè)定為human protein,其他默認[9-10]。檢索日期截至2021年6月1日。
通過CTD數(shù)據(jù)庫(http://ctdbase.org)和Gene-Cards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/),以“l(fā)iver cancer”為關(guān)鍵詞檢索相關(guān)基因[11-12]。將檢索到的肝癌相關(guān)靶點合并,剔除重復項,獲得肝癌相關(guān)靶點。
將通過篩選的相關(guān)靶點上傳至在線韋恩圖(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/),得到槲皮素與肝癌的交集基因,并將其導入String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/cgi/input.pl)[13],構(gòu)建蛋白質(zhì)之間的PPI網(wǎng)絡(luò)。交集基因?qū)隤ather數(shù)據(jù)庫得到交集靶點功能分類,將PPI網(wǎng)絡(luò)導入Cytoscape3.7.2軟件(http://www.cytoscape.org/)進行調(diào)整,并利用CytoHubba插件得到關(guān)鍵靶點。
為進一步了解交集基因的功能及其在信號通路中作用,使用R語言包對交集基因進行基因本位(gene ontology,GO)分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)分析,同時構(gòu)建槲皮素-主要通路-肝癌核心靶點網(wǎng)絡(luò)。
將已知的肝癌關(guān)鍵靶點與槲皮素進行分子對接,得到對接親和力以反映其穩(wěn)定性。通過蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(Protein Data Bank,PDB)下載肝癌的核心蛋白分子結(jié)構(gòu),PubChem數(shù)據(jù)庫下載槲皮素的結(jié)構(gòu),將蛋白和槲皮素結(jié)構(gòu)導入PyMol 2.4.0和Auto Dock Tools軟件處理后,進行分子對接,采用PyMol 2.4.0軟件進行可視化分析[14-15]。
通過TCMSP、PharmMapper數(shù)據(jù)庫最終得到槲皮素的潛在靶點共380個,將靶點名稱上傳至UniProt數(shù)據(jù)庫并校正靶點名稱,剔除得分較低的靶點,最終得到361個靶點。
通過CTD、GeneCards數(shù)據(jù)庫共篩選出50 459個基因,其中CTD數(shù)據(jù)庫33 725個,GeneCards數(shù)據(jù)庫16 734個,通過篩查剔除CTD和GeneCards中關(guān)聯(lián)得分較小的基因,分別篩選出631、524個關(guān)聯(lián)得分較高的基因,將其合并剔除重復基因,得到995個高分靶點。
將槲皮素潛在靶點信息與肝癌高分靶點取交集,得到槲皮素中與肝癌相關(guān)的127個作用靶點基因,包括TP53、caspase 8、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、轉(zhuǎn)甲狀腺素(transthyretin,TTR)、促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)等。通過Panther數(shù)據(jù)庫將槲皮素治療肝癌的127個相關(guān)靶點分為7類,主要功能包括催化活性(38.5%)、結(jié)合(36.2%)、分子功能調(diào)節(jié)(17.8%)等。
將交集靶點導入String數(shù)據(jù)庫,得到PPI網(wǎng)絡(luò),將其導入Cytoscape進行可視化分析,網(wǎng)絡(luò)中共127個節(jié)點,2512條邊,利用CytoHubba插件得到排名前10的肝癌治療相關(guān)核心靶點分別為TP53、蛋白激酶 1(threonine kinase 1,AKT1)、myc、caspase 3、血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)、AP-1轉(zhuǎn)錄因子亞單位(AP-1 transcription factor subunit,JUN)、白細胞介素(interleukin,IL)-6、MAPK8、EGFR和MAPK1。(圖1)
圖1 槲皮素治療肝癌相關(guān)靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)
槲皮素治療肝癌的GO功能結(jié)果顯示,生物過程主要集中在腺體發(fā)育、凋亡信號通路調(diào)控和脂多糖應(yīng)答等;細胞組成主要集中在膜筏、膜微區(qū)和膜區(qū)等;分子功能主要集中在DNA-轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ-特異性DNA轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合等。(圖2)
圖2 GO功能分析結(jié)果
KEGG通路富集篩選結(jié)果共173個富集項,其中前30個最具有顯著性的通路見圖3,其中脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、磷脂酰肌醇-3-羥激酶(phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase,PI3K)/蛋白激酶 B(protein kinase B,PKB,又稱AKT)信號通路、乙型肝炎、腫瘤中的蛋白多糖和MAPK信號通路等均可能為重要的通路。
圖3 KEGG通路富集分析結(jié)果
將槲皮素與肝癌關(guān)鍵靶點進行分子對接,平均對接親和力為-6.58 kcal/mol,對接親和力絕對值越大結(jié)合越穩(wěn)定,表明槲皮素與肝癌核心靶點有較強的結(jié)合力。(表1)
表1 槲皮素與肝癌治療相關(guān)靶點的對接結(jié)果
肝癌以臟腑氣血虧虛為本,氣、血、濕、熱、瘀、毒互結(jié)為標,蘊結(jié)于肝,漸成癥積,肝失疏泄為基本病機。Hisaka等[16]研究發(fā)現(xiàn),槲皮素具有抑制肝癌細胞增殖的作用。已有研究表明,槲皮素可通過阻斷caspase/Cyto-c通路和阻斷AKT/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)1/2信號通路的表達,抑制肝癌細胞增殖并促進其凋亡[17]。
本研究結(jié)果顯示,槲皮素可能通過127個靶點治療肝癌,通過Panther數(shù)據(jù)庫分析后發(fā)現(xiàn)交集靶點主功能主要集中于催化活性、結(jié)合和分子功能調(diào)節(jié)。經(jīng)過PPI網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn),治療的關(guān)鍵靶點為TP53、AKT1、myc、caspase 3和VEGFA等,其中TP53可根據(jù)生理環(huán)境和細胞類型誘導細胞生長停滯或凋亡。Mao等[18]研究發(fā)現(xiàn),薯蕷皂苷通過調(diào)節(jié)p53基因引導細胞凋亡、自噬和DNA損傷,對體外和體內(nèi)的肝癌表現(xiàn)出強大的作用。AKT1是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶中的一種,主要參與細胞代謝、增殖和凋亡等過程。異常的AKT1在糖尿病、心血管疾病和各種腫瘤中有激活作用[19]。myc可抑制前列腺素E2受體的表達,進一步阻斷EP4R/c-myc通路的表達,從而抑制肝癌細胞的增殖和遷移[20]。caspase 3主要在凋亡早期及凋亡晚期中發(fā)揮作用,國內(nèi)研究發(fā)現(xiàn),靶向藥物聯(lián)合caspase 3可進一步抑制肝癌細胞增殖并促進其凋亡[21]。VEGFA具有促進增殖、遷移并抑制細胞凋亡的作用,抑制VEGFA的表達進一步減少肝癌細胞的侵襲、增殖和遷移[22]。本研究通過分子對接發(fā)現(xiàn),槲皮素與上述肝癌治療關(guān)鍵靶點具有良好的結(jié)合力。
KEGG富集分析發(fā)現(xiàn),槲皮素治療肝癌主要通路集中于脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、PI3K/AKT信號通路、乙型肝炎、腫瘤中的蛋白多糖和MAPK信號通路等。研究發(fā)現(xiàn),miRNA-1271-5p通過靶向蛋白抑制肝癌細胞增殖、遷移和侵襲過程,誘導腫瘤細胞凋亡,體外減輕乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染,并在體內(nèi)抑制腫瘤生長[22]。Rahmani等[23]研究發(fā)現(xiàn),肝癌患者中PI3K/AKT通路的激活與肝癌細胞的生長有關(guān)。汪丹丹等[24]發(fā)現(xiàn),通過藥物激活肝癌細胞中的PI3K/AKT通路,可抑制肝癌細胞的凋亡、遷移和增殖等過程。MAPK信號通路的主要作用為調(diào)節(jié)細胞生長、分化和凋亡[25]。肝癌發(fā)生發(fā)展過程中,MAPK通路主要參與細胞增殖、遷移與凋亡。通過miRNA-127轉(zhuǎn)染肝癌細胞可阻斷MAPK通路的表達,明顯抑制肝癌細胞的體內(nèi)體外增殖、遷移并促進其凋亡。槲皮素參與治療腫瘤的重要通路包括蛋白多糖、MAPK信號通路和PI3K/AKT信號通路。GO分析中,生物過程主要集中在腺體發(fā)育、凋亡信號通路的調(diào)控、對脂多糖應(yīng)答等,與上述通路介導的生物學過程相符合。
綜上所述,槲皮素治療肝癌的核心靶點為TP53、AKT1、myc、caspase 3、VEGFA等。GO 分析生物過程主要集中于腺體發(fā)育、凋亡信號通路的調(diào)控等;KEGG分析主要治療通路集中于脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、PI3K/AKT信號通路、乙型肝炎、腫瘤中的蛋白多糖和MAPK信號通路。分子對接提示,槲皮素與肝癌治療核心靶點均有較好的結(jié)合能。以期為臨床上治療肝癌以及基礎(chǔ)研究提供了新的治療藥物和研究方向。