盛吉蒞 諸劍芳 黃元安 金肖青

圍絕經(jīng)期是女性卵巢功能及生育能力逐步走向衰退的時(shí)期，除潮熱、盜汗、睡眠障礙等癥狀外，大部分女性還會(huì)出現(xiàn)超重、肥胖以及胰島素抵抗的現(xiàn)象，進(jìn)而增加2型糖尿病、高血壓等心血管和代謝性疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)［1］。近年來(lái)，較多研究［2-3］發(fā)現(xiàn)腸道菌群與肥胖、胰島素抵抗關(guān)系密切，糾正失調(diào)的腸道細(xì)菌可能成為治療和預(yù)防肥胖的靶點(diǎn)。本文探討圍絕經(jīng)期女性體重增加與相關(guān)血液指標(biāo)和腸道菌群的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年12月至2019年12月本院圍絕經(jīng)期患者72例。本項(xiàng)目通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署書面知情同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)［4］：①年齡＞40周歲，且＜60周歲；②出現(xiàn)月經(jīng)周期不規(guī)則、經(jīng)期時(shí)間延長(zhǎng)、經(jīng)量增多或減少，或月經(jīng)停止1年內(nèi)病史者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①長(zhǎng)期便秘或腹瀉；②存在胃腸道疾病，需長(zhǎng)期服用胃腸動(dòng)力藥物；③入組前3個(gè)月內(nèi)曾服用益生菌或抗生素等藥物。體重指數(shù)（BMI）＜24.0為體重正常組（正常組，NC），24.0≤BMI＜28.0則為體重超重組（超重組，OB）。

1.2 方法 （1）形體指標(biāo)：體重采用拜斯倍斯身高體重分析儀（型號(hào)：BSM370）于同一時(shí)間段進(jìn)行測(cè)量；腰圍采用世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦的測(cè)量腰圍的方法［5］，雙腳分開25～30 cm，測(cè)量位置在水平髂前上嵴和第12肋下緣連線的中點(diǎn)，反復(fù)測(cè)量3次，取平均數(shù)；臀圍測(cè)量時(shí)兩腿并攏直立，測(cè)量位置在恥骨聯(lián)合和背后臀大肌最凸處。腰臀比（WHR）=腰圍（cm）/臀圍（cm）；腰圍身高比（WHtR）=腰圍（cm）/身高（cm）。（2）血液指標(biāo)：抽取肘靜脈血，檢測(cè)患者血液中甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）、空腹胰島素（FINS）及空腹血糖（FPG），并計(jì)算（胰島素抵抗指數(shù)）HOMA-IR。（HOMA-IR）= 空腹血糖（FPG）×空腹胰島素（FINS）/22.5。（3）腸道菌群檢測(cè)方法：①樣品采集：用一次性采樣勺采集新鮮排出的糞便≥2 g，裝入無(wú)菌糞盒中，并將樣本凍存于-80℃冰箱中。②預(yù)處理：1 g糞便樣品用30 mL無(wú)菌的0.1 mmol/L磷酸鈉緩沖液（SPB）懸浮，渦旋約30 min，200 g離心5 min，離心3次，去除粗顆粒，收集上清液；9,000 g離心3 min，收集沉淀，30 mL SPB洗4次，最后重懸于10 mL的SPB中，平均分裝成5份，置于-70℃保存，用于后續(xù)DNA提取。③DNA提取、純化及檢測(cè)：依據(jù)糞便腸道菌群DNA 提取試劑盒QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit（QIAGEN）操作說(shuō)明書進(jìn)行樣本DNA 提取。操作步驟如下：用紫外分光光度計(jì)（NanoDrop）檢測(cè)DNA濃度及純度，1% 瓊脂糖凝膠電泳跑膠觀察DNA完整性。選取OD260 /OD280值在1.8～2.0之間、條帶完整的DNA樣本進(jìn)行后續(xù)分析。④PCR擴(kuò)增、建庫(kù)及測(cè)序：采用細(xì)V3-V4區(qū)通用引物對(duì)16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所用引物為341F（5’-CCTAYGGGRBGCASCAG-3’）和806R（5’-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’）。使用Thermofisher公司的Ion PlusFragment Library Kit 48 rxns建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)的構(gòu)建，構(gòu)建好的庫(kù)經(jīng)過(guò)Qubit定量和文庫(kù)檢測(cè)合栺后，使用IonS5TMXL測(cè)序儀上機(jī)測(cè)序。⑤數(shù)據(jù)分析：使用Cutadapt進(jìn)行剪切、拆分和處理得到原始序列（Rawreads），并利用UCHIME Algorithm與物種注釋數(shù)據(jù)庫(kù)迚行比對(duì)檢測(cè)，得到最終的有效數(shù)據(jù)（Clean Reads）。采用Uparse軟件對(duì)所有樣品的全部Clean Reads進(jìn)行聚類，默認(rèn)以97%的一致性（identity）將序列聚類成為操作分類單元（operational taxonomic Units，OUT），同時(shí)選取OTU數(shù)目的代表性進(jìn)行物種注釋。使用Qiime軟件計(jì)算Chao1，Shannon和Simpson指數(shù)，使用R軟件進(jìn)行組間差異分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布計(jì)量資料以（±s）表示，用t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布，用秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)表示。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較 見表1。

表1 兩組一般資料比較（±s）

表1 兩組一般資料比較（±s）

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2.2 血液指標(biāo)比較 與正常組比較，超重組的空腹胰島素和HOMA-IR水平高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表2。

表2 兩組血液指標(biāo)比較（±s）

表2 兩組血液指標(biāo)比較（±s）

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2.3 兩組腸道微生物多樣性比較 兩組Observedotus，Chao1，Shannon，Simpson，ACE指數(shù)，比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 兩組腸道微生物多樣性比較（±s）

表3 兩組腸道微生物多樣性比較（±s）

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2.4 兩組腸道菌群相對(duì)豐度比較 在門水平上，正常組菌群相對(duì)豐度較高的依次為厚壁菌門（Firmicutes）84.5%，擬桿菌門（Bacteroidetes）11.71%，放線菌門（Actinobacteria）3.62%，變形菌門（Proteobacteria）1.07%，梭桿菌門（Fusobacteria）0.01%，超重組的菌群相對(duì)豐度較高的依次為厚壁菌門（Firmicutes）79.61%，擬桿菌門（Bacteroidetes）11.73%，變形菌門（Proteobacteria）4.22%，放線菌門（Actinobacteria）3.65%，梭桿菌門（Fusobacteria）0.54%。超重組菌群相對(duì)豐度與正常組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)（P＞0.05），見圖1。

圖1 兩組腸道菌群相對(duì)豐度比較

2.5 兩組腸道菌群差異物種分析 超重組的δ變形菌綱（deltaproteobacteria）、脫硫弧菌目和脫硫弧菌科（desulfovibrionaceae）與正常組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖2～4。

圖2 T-test檢測(cè)方法在綱水平上兩組腸道菌群的差異

圖3 T-test檢測(cè)方法在目水平上兩組腸道菌群的差異

圖4 T-test檢測(cè)方法在科水平上兩組腸道菌群的差異

3 討論

腸道菌群作為人體最大的微生態(tài)系統(tǒng)，是近來(lái)與肥胖相關(guān)的多種疾病防治研究的熱點(diǎn)之一。腸道菌群的改變可引發(fā)慢性炎癥反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致肥胖、胰島素抵抗等代謝失調(diào)。本資料顯示，超重組女性腸道菌群豐度及多樣性結(jié)果與正常組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但超重組菌群豐度及多樣性呈下降趨勢(shì)。在腸道菌群組成結(jié)構(gòu)方面，兩組菌群結(jié)構(gòu)大體相當(dāng)，在門水平中，兩組均以厚壁菌門和擬桿菌門為優(yōu)勢(shì)菌群，這與相關(guān)研究［6］結(jié)果一致。

本資料中，超重組甘油三酯、總膽固醇、LDL水平總體較高，HDL和空腹血糖水平較低與正常組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而空腹胰島素水平、HOMA-IR以及腸道菌群中δ-變形菌和脫硫弧菌數(shù)量增高（P＜0.01），表明圍絕經(jīng)期女性體重增加過(guò)程中，胰島素抵抗出現(xiàn)早于糖脂代謝紊亂，且該過(guò)程可能與腸道菌群中δ-變形菌和脫硫弧菌的數(shù)量改變有關(guān)。變形菌門是腸道微生物中最大的一門，包括α-變形菌、β-變形菌、γ-變形菌、δ-變形菌和ε-變形菌等五類，其中有較多致病菌，如大腸桿菌、沙門氏菌、霍亂弧菌和幽門螺桿菌等，會(huì)導(dǎo)致胃腸道感染、傷寒、霍亂、急慢性胃炎等疾病，變形菌門比例增高被認(rèn)為是腸道菌群失調(diào)的微生物標(biāo)志之一［7-9］。

目前關(guān)于肥胖的病理生理機(jī)制尚不清楚，但近年來(lái)研究［10］揭示，肥胖與慢性低度炎癥有關(guān)，且慢性低度炎癥被認(rèn)為是促使肥胖患者胰島素抵抗進(jìn)一步發(fā)展的使動(dòng)因素之一。脫硫弧菌屬于δ-變形菌綱中最主要的一種可以產(chǎn)生硫化氫的細(xì)菌，其能夠促進(jìn)腸道IL-6和IL-8的分泌，誘發(fā)腸道慢性炎癥［11-12］，進(jìn)而促進(jìn)體重增加及胰島素抵抗的發(fā)展。另外，腹部脂肪增加也是胰島素抵抗的一個(gè)重要原因。本資料結(jié)果顯示，圍絕經(jīng)期女性體重增加的同時(shí)腰圍、WHtR也增大（P＜0.01）。有研究表明［13-15］腹部脂肪增加會(huì)導(dǎo)致脂肪細(xì)胞分泌的游離脂肪酸（FFA）、瘦素（Leptin）、腫瘤壞死因子（TNF-α）、抵抗素（Resistin）、脂聯(lián)素（Adiponectin）、過(guò)氧化物酶體增殖體激活物受體γ（PPAR-γ）等物質(zhì)也相應(yīng)增加，使局部組織對(duì)胰島素的敏感性下降，從而影響胰島素的效應(yīng)發(fā)揮，導(dǎo)致胰島素抵抗的產(chǎn)生。

綜上所述，圍絕經(jīng)期女性超重及胰島素抵抗的發(fā)展可能與腸道菌群的結(jié)構(gòu)改變存在一定關(guān)系。但本研究也有一定的局限性，比如未納入肥胖的圍絕經(jīng)期女性，且腸道菌群結(jié)構(gòu)受飲食習(xí)慣、地域等多方面影響，結(jié)果難免產(chǎn)生一定的偏倚，期待后續(xù)研究能將以上因素納入考慮，進(jìn)一步探索圍絕經(jīng)期女性體重增加與腸道菌群的相互關(guān)系。