戴順 沈瑞林 唐晨野 汪家盛 郭曉

丹參酮類化合物又稱總丹參酮，是從唇形科植物丹參干燥后的根和根莖中提取的一大類脂溶性菲醌類化合物。丹參酮是其中一種所含丹參含量最高的一種成分，不僅對(duì)能夠保護(hù)人體心血管與神經(jīng)細(xì)胞、改善血液微循環(huán)、抵抗慢性肝血管纖維化以及能夠誘導(dǎo)體內(nèi)干擾素細(xì)胞功能發(fā)生良性分化等均具有重要的保護(hù)作用［1］，還具有良好的抗腫瘤活性［2］。前期臨床研究顯示，丹參酮ⅡA 在體外免疫作用中可以有效抑制人體惡性膀胱癌J82細(xì)胞的體外增殖，促進(jìn)其細(xì)胞凋亡，且同時(shí)降低體外侵襲及細(xì)胞遷移時(shí)的性能，具有多方面的抗膀胱癌作用［3］。本研究初步探討丹參酮ⅡA抗膀胱癌作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和主要材料 （1）膀胱癌細(xì)胞株來源：人膀胱癌J82細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫）。（2）主要材料：培養(yǎng)基（DMEM）（貨號(hào)SH30022.01B，美國(guó)Hyclone公司），F(xiàn)BS（貨號(hào)S601S-500，德國(guó)Sera & Pro公司），丹參酮ⅡA（貨號(hào)T4952-5MG，美國(guó)Sigma公司），0.25%Trypsin-EDTA細(xì)胞消化液（貨號(hào)0457，美國(guó)Amresco公司），青霉素-鏈霉素雙抗混懸液（貨號(hào)15140-122，美國(guó)Gibco公司），PBS緩沖液（美國(guó)Sigma公司），牛血清蛋白（BSA）粉劑（美國(guó)Abcam公司），丙烯酰胺40%溶液、SDS、TEMED（美國(guó)Thermo Fisher公司），甘氨酸、Tris base（美國(guó)Amresco公司），SDS（美國(guó)VWR公司），PNPP（美國(guó)Biolab 公司），APS（美國(guó)VWR公司），細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）、Annexin V-FITC/碘化丙錠（PI）（日本同仁化學(xué)研究所），聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（美國(guó)Millipore公司）。（3）主要抗體：β-actin抗體（武漢賽維爾生物科技有限公司），caspase 3抗體、caspase 9抗體（美國(guó)CST）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 （1）細(xì)胞培養(yǎng)：將人膀胱癌J82細(xì)胞體外培養(yǎng)，均使用含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM（高糖）培養(yǎng)基，將其置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（2）丹參酮ⅡA對(duì)J82細(xì)胞半數(shù)抑制率（IC50）的測(cè)定：①將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期J82細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化，配制成細(xì)胞懸液，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)方式，按2,000～4,000個(gè)細(xì)胞每孔接種于96孔板，每孔加150μL，設(shè)置藥物濃度分別為1、2、3、5、8 μmol/L的實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。將96孔板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（過夜貼壁），邊緣孔用無菌PBS填充。②細(xì)胞培養(yǎng)1 d后，細(xì)胞貼壁完全且穩(wěn)定生長(zhǎng)后對(duì)其進(jìn)行加藥處理。在實(shí)驗(yàn)組中每孔加入相應(yīng)濃度藥物10μL，陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組每孔加入10μL DMEM培基。③置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，每孔加入10μL CCK-8試劑，混勻后再孵育2 h。使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm光吸收值（OD值）。增殖抑制率=1-（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值）/（陰性對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值）×100%。采用Graphpad Prism軟件計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）并繪圖。（2）CCK-8法檢測(cè)丹參酮ⅡA對(duì)細(xì)胞增殖的影響：①將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期J82細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化，配制成細(xì)胞懸液，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)方式，按2,000～4,000個(gè)細(xì)胞每孔接種于96孔板，每孔加150μL。設(shè)置不加藥物的空白組和加IC50范圍濃度的丹參酮ⅡA藥物處理組，每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，同時(shí)鋪孔5天，邊緣孔以及天數(shù)間用無菌PBS填充。②將96孔板搖晃混勻，置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天同一時(shí)間加入10μL CCK-8試劑，混勻后再孵育2 h。使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm光吸收值（OD值）。（3）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期情況：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期J82細(xì)胞，分別用不同濃度（1、3μmol/L）的丹參酮ⅡA藥作用于細(xì)胞，另設(shè)一組對(duì)照組，更換不含藥物的培養(yǎng)基，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)是否良好，將各組細(xì)胞通過無菌PBS清洗、0.25%胰蛋白酶消化、收集細(xì)胞離心制成細(xì)胞懸液，經(jīng)甲醇固定過夜，PBS清洗3次加入適量的Annexin V-FITC溶液與PI染色液共孵育30 min，混勻后轉(zhuǎn)移至上樣管，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡與周期情況。（4）免疫印跡法（Western blotting）檢測(cè)細(xì)胞周期、凋亡相關(guān)蛋白及p65蛋白的表達(dá)情況：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期J82細(xì)胞分別用含1、3μmol/L藥物及不含藥物的培養(yǎng)基（對(duì)照組）處理培養(yǎng)48 h，吸盡舊液，用細(xì)胞刮子將細(xì)胞刮下來，加入細(xì)胞裂解液（100 μL RIPA、1μL PMSF）提取總蛋白（冰上操作，以防蛋白降解），用BCA蛋白定量法測(cè)定總蛋白濃度并計(jì)算上樣量，保持內(nèi)參一致。經(jīng)SDS-PAGE電泳，濃縮膠80 V，至分離膠時(shí)改電壓為120 V，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為300 mA，70 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后5%脫脂奶粉封閉1 h。加入一抗稀釋液，4℃孵育過夜，次日TBST洗滌5min×3次，再加二抗稀釋液，室溫避光孵育1 h，TBST避光洗滌5min×3次。進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光曝光、顯影。對(duì)感光膠片條帶進(jìn)行灰度值分析，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SAS 8.1統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布計(jì)量資料以（±s）表示。組間整體比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，兩兩比較采用Bonfferoni校正法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 丹參酮ⅡA抑制J82細(xì)胞增殖 OD值可反映細(xì)胞增殖活力 丹參酮ⅡA處理J82細(xì)胞48 h后，各組450 nm OD值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=346.35，P＜0.001），1μmol/L組與陰性對(duì)照組比較的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），其余不同濃度兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。丹參酮ⅡA作用J82細(xì)胞48 h的IC50為4.16μmol/L。各藥物處理組增殖抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=293.68，P＜0.001），且任意兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1、圖1。確定IC50值后，設(shè)置空白對(duì)照組和藥物處理組，分別作用于J82細(xì)胞，CCK-8法測(cè)定其1、2、3、4、5 d的增值情況，根據(jù)受測(cè)細(xì)胞的吸光度值，繪制成細(xì)胞增殖曲線。見圖2。藥物處理組細(xì)胞增殖速率明顯低于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖2 丹參酮ⅡA的濃度對(duì)J82細(xì)胞增殖的影響

表1 不同濃度組間450 nm OD值及細(xì)胞增殖抑制率的比較（±s）

表1 不同濃度組間450 nm OD值及細(xì)胞增殖抑制率的比較（±s）

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圖1 丹參酮ⅡA的J82細(xì)胞增殖半數(shù)抑制率的測(cè)定

2.2 丹參酮ⅡA阻滯J82細(xì)胞周期 對(duì)照組、1μmol/L組、3μmol/L組 的G1期 細(xì) 胞 百 分 比 值分 別 為（42.22%±0.48%）、（47.98%±1.49%）、（54.94%±3.39%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=41.15，P＜0.05），且任意兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；S期細(xì)胞百分比分別為（46.32%±2.14%）、（39.72%±2.88%）、（33.19%±4.17%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=9.21，P＜0.05），但差異主要存在于3μmol/L組與對(duì)照組（P＜0.05）；G2期細(xì)胞百分比分別為（14.46%±2.17%）、（13.21%±2.83%）、（9.87%±0.95%），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.71，P＞0.05）。見圖3～4。

圖3 三組J82細(xì)胞周期流式檢測(cè)結(jié)果

圖4 丹參酮ⅡA對(duì)J82細(xì)胞周期的影響

2.3 丹參酮ⅡA誘導(dǎo)J82細(xì)胞凋亡 對(duì)照組、1μmol/L組、3μmol/L組、5μmol/L組的細(xì)胞數(shù)分別為7,787、10,106、9,502、14,941個(gè)；總凋亡率分別為3.36%、12.23%、14.74%、18.40%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1,028.98，P＜0.001）。進(jìn)一步兩兩比較顯示，3個(gè)藥物處理組的總凋亡率均高于對(duì)照組（χ2=452.65、638.49、1,006.78，P＜0.05），3μmol/L組、5μmol/L組的總凋亡率均高于1μmol/L組（χ2=25.59、161.46，P＜0.05），5μmol/L組的總凋亡率高于3μmol/L組（χ2=55.14，P＜0.05）。見圖5。

圖5 不同濃度丹參酮ⅡA誘導(dǎo)J82細(xì)胞凋亡的流式檢測(cè)結(jié)果（Q1：機(jī)械損傷；Q2：晚期凋亡；Q3：正常細(xì)胞；Q4：早期凋亡；總凋亡=Q4+Q2）

2.4 丹參酮ⅡA促進(jìn)J82細(xì)胞中caspase 3、caspase 9蛋白的表達(dá) 對(duì)照組、1μmol/L組、3μmol/L組caspase 3蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.26±0.02、0.39±0.02、0.52±0.03，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=113.10，P＜0.001），且任意兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；caspase 9蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.02±0.02、0.17±0.03、0.34±0.12，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=15.83，P＜0.05），且任意兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對(duì)照組、1μmol/L組、3μmol/L組的 cyclin D1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.21±0.02、0.12±0.03、0.05±0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=113.10，P＜0.001），且任意兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對(duì)照組、1μmol/L組、3μmol/L組Bcl-x蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.56±0.04、0.23±0.02、0.08±0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=211.10，P＜0.001），且任意兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對(duì)照組、1μmol/L組、3μmol/L組P56蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.23±0.02、0.10±0.02、0.04±0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=143.20，P＜0.001），且任意兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖6～7。

圖6 cyclin D1、Bcl-xL、caspase3、caspase9、P65蛋白在三組J82細(xì)胞中表達(dá)的Western blotting檢測(cè)結(jié)果

圖7 丹參酮ⅡA對(duì)J82細(xì)胞cyclin D1、Bcl-xL、caspase3、caspase9、P65蛋白表達(dá)的影響

3 討論

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)發(fā)病率最高的惡性腫瘤，根據(jù)病理學(xué)分期可分為非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌（non-muscleinvasive bladder cancer，NMIBC）和肌層浸潤(rùn)性膀胱癌（muscle-invasive bladder cancer，MIBC），新發(fā)病例絕大多數(shù)為NMIBC，占70%以上。目前在膀胱癌的治療以手術(shù)為主的綜合療法已得到公認(rèn)和普及，但并未給患者的預(yù)后帶來突破性改善。NMIBC經(jīng)手術(shù)治療后聯(lián)合膀胱灌注治療，復(fù)發(fā)率仍達(dá)50%～70%，約10%～15%的患者會(huì)進(jìn)展為MIBC［4］。MIBC的治療，盡管積極采取根治性膀胱切除術(shù)及全身化療，仍有至少50%的患者在5年內(nèi)死于腫瘤轉(zhuǎn)移，其中位生存期僅為12～15個(gè)月［5］。因此，開發(fā)新藥物或?qū)ふ夷承┚哂辛己玫目鼓[瘤活性的天然藥物，應(yīng)用于膀胱癌以減少?gòu)?fù)發(fā)，具有十分重要的意義。

研究表明，丹參酮類化合物丹參酮ⅡA對(duì)骨肉瘤、卵巢癌、肝細(xì)胞癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、食管癌、胃癌、肺癌等多種腫瘤細(xì)胞均具有良好的抗腫瘤活性［6-13］，其抗腫瘤作用表現(xiàn)在抑制腫瘤細(xì)胞增殖、調(diào)控細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞分化、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡及抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移等諸多方面［14］。丹參酮類化合物也可提高化療后機(jī)體的免疫功能，對(duì)機(jī)體的免疫臟器也有一定的保護(hù)作［15］。該化合物來源于中國(guó)傳統(tǒng)中藥丹參，毒副作用較低，是一種具有潛在臨床應(yīng)用前景的抗腫瘤天然藥物，近年來越來越受到關(guān)注。

本研究結(jié)果顯示，丹參酮ⅡA可明顯抑制J82細(xì)胞的增殖，且抑制率隨著藥物劑量的增加而增加。這與CHIU等［16］的研究有類似的結(jié)果，其發(fā)現(xiàn)經(jīng)丹參酮ⅡA處理后5637、BFTC、T24及TCCSUP四種膀胱癌細(xì)胞的存活率均以藥物劑量和作用時(shí)間依賴的方式顯著降低。故丹參酮ⅡA對(duì)膀胱癌細(xì)胞的增殖抑制作用確切。本研究顯示，丹參酮ⅡA可使J82細(xì)胞發(fā)生G1/S期阻滯，這可能是丹參酮ⅡA抑制J82細(xì)胞增殖的機(jī)制之一，其中相關(guān)的分子機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。本研究還顯示，丹參酮ⅡA可誘導(dǎo)J82細(xì)胞凋亡，并隨著劑量的增加而凋亡率升高。以往有研究顯示，丹參酮ⅡA可通過線粒體途徑誘導(dǎo)結(jié)腸癌、肺癌、前列腺癌等腫瘤細(xì)胞凋亡［17-19］，也可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑、死亡受體途徑誘導(dǎo)卵巢癌、肝細(xì)胞癌凋亡［8，20］。本研究結(jié)果顯示，凋亡抑制因子cyclin D1、Bcl-xL，P65蛋白表達(dá)隨藥物濃度升高而降低，提升丹參酮ⅡA可抑制凋亡。丹參酮ⅡA可明顯增加J82細(xì)胞中caspase 3和caspase 9兩種蛋白的表達(dá)，且藥物劑量越高，蛋白表達(dá)越多，而caspase 8蛋白的表達(dá)則不受藥物影響。當(dāng)線粒體損傷時(shí)，線粒體完整性被破壞可導(dǎo)致多種促凋亡因子包括細(xì)胞色素C的釋放，細(xì)胞色素C與胞質(zhì)中的細(xì)胞凋亡蛋白酶活化因子1結(jié)合，直接激活caspase9等［21］，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，這表明丹參酮ⅡA很可能通過線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑來誘導(dǎo)J82細(xì)胞凋亡。下一步需要檢測(cè)該通路上下游的信號(hào)分子來進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，丹參酮ⅡA在體外可抑制J82細(xì)胞增殖，G1/S期阻滯可能是其中的機(jī)制之一，同時(shí)丹參酮ⅡA可能通過線粒體途徑誘導(dǎo)J82細(xì)胞凋亡。本研究為丹參酮ⅡA在膀胱癌藥物治療中的應(yīng)用提供了初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但僅為體外實(shí)驗(yàn)，研究結(jié)果的科學(xué)價(jià)值有待進(jìn)一步開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)來驗(yàn)證。