楊影影，易開放，張俊鍇，羅行煒，劉佩儀，韓榮嘉，胡功政

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450002）

豬鏈球菌（Streptococcus suis）是引起豬感染的一種重要的革蘭氏陽性致病菌，多數(shù)為兼性厭氧、少數(shù)為專性厭氧[1-2]。豬鏈球菌不僅可以引起豬關(guān)節(jié)炎、敗血癥、腦膜炎、心內(nèi)膜炎、流產(chǎn)和猝死等疾病，而且可導(dǎo)致人發(fā)病，引起敗血癥型休克，嚴(yán)重時可導(dǎo)致患者死亡[3]。豬鏈球菌的流行給世界公共衛(wèi)生安全帶來了巨大的威脅。青霉素類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類及氟喹諾酮類等是治療豬鏈球菌感染的首選藥物。隨著抗菌藥物的不規(guī)范使用，豬鏈球菌臨床分離株的耐藥問題日益嚴(yán)重。此外，豬鏈球菌對四環(huán)素類藥物（高達(dá)90%）和大環(huán)內(nèi)酯類藥物（高達(dá)70%）的高耐藥現(xiàn)狀在世界各地均有報道[4]。

利奈唑胺（Linezolid）是第一代惡唑烷酮類抗菌藥物，對革蘭氏陽性致病菌，特別是多重耐藥的革蘭氏陽性致病菌，具有較強(qiáng)的抗菌活性[5-6]，包括耐青霉素的肺炎鏈球菌（PRSP）、耐甲氧西林的葡萄球菌（MRSA）和耐萬古霉素的腸球菌（VRE）等，也被稱為治療由多重耐藥革蘭氏陽性致病菌感染的最后一道防線。利奈唑胺可通過與細(xì)菌50S核糖體的肽基轉(zhuǎn)移酶中心（PTC）結(jié)合，抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，從而發(fā)揮抗菌作用[7]。但利奈唑胺在被獲準(zhǔn)用于臨床后不久，便有報道分離出了耐利奈唑胺的金黃色葡萄球菌（MRSA）。利奈唑胺未用于食品生產(chǎn)動物，但已有報道動物源的利奈唑胺耐藥菌株的出現(xiàn)[8]。前人研究發(fā)現(xiàn)，利奈唑胺耐藥機(jī)制主要為突變介導(dǎo)的耐藥（23S rRNA V 區(qū)突變和核糖體蛋白L3、L4 突變等）和耐藥基因（cfr、optrA和poxtA等）介導(dǎo)的耐藥[9-12]。HUANG 等[13]關(guān)于從江蘇省收集的107 株豬鏈球菌分離菌株對利奈唑胺耐藥性的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在2013—2016 年，豬鏈球菌對利奈唑胺的耐藥率在逐漸增加（0～38.3%）。同時還發(fā)現(xiàn)，利奈唑胺耐藥菌株100%攜帶optrA基因。有研究發(fā)現(xiàn)，optrA基因位于豬鏈球菌所攜帶的可轉(zhuǎn)移的遺傳元件上（質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子等），具有水平轉(zhuǎn)移利奈唑胺抗性的風(fēng)險[5]。值得注意的是，optrA基因在國內(nèi)呈現(xiàn)廣泛流行的趨勢。利奈唑胺耐藥菌株的出現(xiàn)將會導(dǎo)致利奈唑胺在臨床治療中的失敗，尤其是利奈唑胺耐藥基因的出現(xiàn)和快速傳播，將嚴(yán)重危害人類健康和畜禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，應(yīng)該引起人類的高度重視。

為此，對從河南及周邊等7 個省份分離的豬鏈球菌臨床菌株進(jìn)行相關(guān)研究，調(diào)查分析這7 個省份豬鏈球菌對利奈唑胺的耐藥情況，以及其相關(guān)耐藥機(jī)制，旨在為豬鏈球菌中利奈唑胺耐藥性的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 2016—2019 年，分別從河南、江西、湖南、湖北、安徽、山西及陜西7個省份收集得到178株豬鏈球菌[14]。

質(zhì)控菌株：肺炎鏈球菌ATCC 49619，大腸桿菌ATCC 25922。

1.1.2 試劑 心腦浸出液（BHI）培養(yǎng)基購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；胎牛血清（四季青）購自杭州四季青有限公司；2×PCRTaqMaster Mix、DSTM 2000 DNA Marker 購自康為世紀(jì)（北京）生物科技有限公司；蛋白酶K、溶菌酶均購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。水系微孔濾膜（0.22 μm）購自鄭州久是生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.1.3 藥物 阿米卡星（含量80%）、慶大霉素（62.3%）、阿奇霉素（80%）、氟苯尼考（85%）、桿菌肽（60 U/mg）、多西環(huán)素（98%）均購于河南牧翔藥業(yè)有限公司；紅霉素（80%）、克林霉素（100%）、氯霉素（98%）均購于索萊寶生物科技有限公司；利奈唑胺（98%）購于上海麥克林生化科技有限公司。以上藥物均在有效期內(nèi)。

1.2 方法

1.2.1 利奈唑胺抗性菌株的初篩 用接種環(huán)將178株豬鏈球菌接種于BHI 固體培養(yǎng)基（含10%的胎牛血清），于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h，然后用一次性接種環(huán)挑取單個菌落于5 mL 的BHI 液體培養(yǎng)基（含10%的胎牛血清），180 r/min 搖床培養(yǎng)18～24 h，最后分別吸取100 μL 菌液均勻涂布于含有利奈唑胺（4 mg/L）和10%胎牛血清的BHI固體培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，從而進(jìn)行利奈唑胺耐藥菌株的初篩。

1.2.2 細(xì)菌基因組提取 用一次性接種環(huán)挑取單個菌落于5 mL的BHI液體培養(yǎng)基（含10%的胎牛血清），180 r/min 搖床培養(yǎng)18～24 h 后，使用細(xì)菌基因組提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取全基因組DNA。嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，提取的DNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 耐藥基因PCR 檢測 利奈唑胺耐藥基因optrA、cfr、poxtA、cfr(B）及cfr(C）引物參照相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行設(shè)計[12，15-17]，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR 體系：DNA 模板2 μL，上、下游引物各1 μL，2×PCRTaqMaster Mix 10 μL，加滅菌雙蒸水（ddH2O）補(bǔ)至20 μL。分別以ddH2O、258S 菌株為陰性、陽性對照。取6 μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，然后將PCR 陽性產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，所獲序列提交NCBI網(wǎng)站進(jìn)行目的基因驗證分析。

1.2.4 藥物敏感性試驗 參照美國CLSI 標(biāo)準(zhǔn)[18]，采用微量肉湯稀釋法測定optrA/cfr陽性菌株對利奈唑胺、阿米卡星、慶大霉素、紅霉素、阿奇霉素、桿菌肽、多西環(huán)素、氟苯尼考、氯霉素和克林霉素10種抗菌藥物的敏感性，統(tǒng)計各藥物的最小抑菌濃度（MIC）。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐利奈唑胺的豬鏈球菌分離株篩選結(jié)果

耐利奈唑胺的分離株篩選顯示，178 株豬鏈球菌中有13 株在利奈唑胺抗性平板上呈灰白色不透明的、表面光滑的圓形均勻小菌落，這說明該13株菌對利奈唑胺不敏感，即利奈唑胺對其的MIC 值均大于4 mg/L。

2.2 豬鏈球菌分離菌株利奈唑胺耐藥基因的PCR檢測結(jié)果

PCR 檢測結(jié)果表明，13 株利奈唑胺耐藥菌株均攜帶optrA基因，其中，有2 株菌（1077S 和1113S）同時攜帶optrA和cfr基因。陽性菌株的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳顯示，與目的基因條帶大小一致（圖1），測得的序列與目的基因序列的同源率達(dá)99%以上，符合預(yù)期。

圖1 豬鏈球菌分離菌株optrA和cfr基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of optrA and cfr genes from S.suis

2.3 豬鏈球菌分離菌株藥敏結(jié)果

藥敏試驗結(jié)果表明，13 株optrA/cfr陽性菌株為利奈唑胺耐藥菌株，利奈唑胺的MIC 值在8～16 mg/L（表1）。對于2 株同時攜帶optrA和cfr基因的菌株，利奈唑胺的MIC 值均為16 mg/L，高于僅攜帶optrA菌株的MIC 值（8 mg/L）。此外，該13 株菌對其他類的抗菌藥物表現(xiàn)出不同水平的耐藥，如對多西環(huán)素和克林霉素全部耐藥，MIC值分別分布在2～16 mg/L和4～256 mg/L。然而，存在3 株桿菌肽耐藥菌株。且有12 株菌對紅霉素和阿奇霉素表現(xiàn)為較高程度的耐藥，MIC 值達(dá)到512 mg/L。此外，對阿米卡星耐藥的菌株（10 株）要多于對慶大霉素耐藥的菌株（8株），其中，4 株慶大霉素耐藥菌株，MIC 值在512 mg/L 以上。氟苯尼考和氯霉素耐藥菌株均為10 株，但是對氟苯尼考耐藥的菌株，可能對氯霉素敏感，反之亦然。

表1 豬鏈球菌對藥物的敏感性及MICTab.1 Sensitivity and MIC distribution of S.suis to drugsmg/L

續(xù)表1 豬鏈球菌對藥物的敏感性及MICTab.1（Continued） Sensitivity and MIC distribution of S.suis to drugsmg/L

可見，這13 株菌株至少對3 種藥物表現(xiàn)為耐藥，對4 種藥物耐藥的有2 株，對7 種藥物耐藥的有2 株，對6 種藥物耐藥的有9 株，占比最高。未檢出對所測試藥物均耐藥的菌株（圖2）。

圖2 13株optrA/cfr陽性菌株的多重耐藥情況Fig.2 Multidrug resistance of 13 strains of optrA/cfr positive S.suis

3 結(jié)論與討論

利奈唑胺是美國食品藥品監(jiān)察局（FAD）在2000 年批準(zhǔn)用于人醫(yī)臨床的一種抗菌藥物，用于治療革蘭氏陽性球菌引起的感染。盡管其尚未批準(zhǔn)用于動物治療，但是在許多國家均出現(xiàn)了動物源的利奈唑胺耐藥菌株[19]。KANG 等[19]對于來自韓國2 547 株金黃色葡萄球菌對利奈唑胺的耐藥性進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，有25 株菌對利奈唑胺耐藥，耐藥率為1.0%。CAVACO 等[20]在556 株腸球菌中發(fā)現(xiàn)有3 株利奈唑胺耐藥菌株，耐藥率為0.54%。HUANG 等[13]調(diào)查了來自江蘇省的豬鏈球菌分離株對利奈唑胺的耐藥性，發(fā)現(xiàn)其耐藥率達(dá)38.3%。本研究對7 個省份178株豬鏈球菌臨床分離株的利奈唑胺耐藥性進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果顯示，有7.3%的耐藥菌株；分析相關(guān)耐藥基因發(fā)現(xiàn)，對利奈唑胺耐藥的菌株中，有2株同時攜帶cfr和optrA基因，而未檢出攜帶cfr（B）、cfr（C）和Poxt A基因的菌株。HUANG 等[13]對江蘇省豬鏈球菌利奈唑胺耐藥性進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，所有利奈唑胺耐藥的菌株均攜帶optrA基因，而只有1株菌攜帶cfr基因，這表明optrA基因在介導(dǎo)利奈唑胺抗性中可能發(fā)揮了主要作用。

在13 株optrA/cfr陽性菌株中，利奈唑胺對2 株同時攜帶optrA和cfr菌株的MIC值（16 mg/L）高于僅攜帶optrA菌株的MIC 值（8 mg/L），這可能是由于cfr基因可介導(dǎo)高水平的利奈唑胺抗性[21]。此外，這些陽性菌株不僅對利奈唑胺耐藥，而且對多西環(huán)素、氯霉素、氟苯尼考、紅霉素、阿奇霉素、克林霉素、阿米卡星和慶大霉素耐藥，甚至表現(xiàn)為較高程度的耐藥，這表明optrA/cfr陽性菌株可表達(dá)多重抗性。optrA和cfr基因均為多重耐藥基因，既可介導(dǎo)利奈唑胺耐藥，又可介導(dǎo)對四環(huán)素類和酰氨醇類等抗菌藥物耐藥。尤其當(dāng)optrA或cfr基因在傳播過程中與其他耐藥基因，如erm家族基因［erm(A）、erm(B）和erm(C）］、氨基糖苷類耐藥基因（aadD、aacA-aphD）或四環(huán)素類耐藥基因［tet(A）、tet(B）和tet(O）］共定位時，則會出現(xiàn)多重耐藥性的情況[22]。目前，optrA和cfr基因在豬鏈球菌中不斷被檢出，且具有地域性及跨種屬傳播的趨勢，應(yīng)持續(xù)檢測包括豬鏈球菌在內(nèi)的革蘭陽性菌對利奈唑胺等臨床重要抗菌藥的耐藥性發(fā)展情況。

耐藥豬鏈球菌作為抗生素耐藥基因庫，可水平轉(zhuǎn)移到人致病鏈球菌中，如化膿性鏈球菌、肺炎鏈球菌和無乳鏈球菌，從而導(dǎo)致抗生素耐藥性的廣泛傳播[4]。因此，應(yīng)加強(qiáng)抗菌藥物在養(yǎng)豬業(yè)中的規(guī)范使用，以減緩豬鏈球菌耐藥性的產(chǎn)生。