李心如,張福順,2,邳 植,3

(1.黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080； 2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部甜菜品質(zhì)監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心，哈爾濱 150080；3.黑龍江省普通高校甜菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080)

0 引 言

甜菜(Beta vulgaris L.)具有耐寒、耐干旱、耐鹽堿等特點(diǎn)，具有抗逆性強(qiáng)、適應(yīng)性廣的特性。甜菜是甘蔗以外的一個(gè)主要糖來源，屬于我國主要的糖料作物。除此之外，甜菜還可以生產(chǎn)出具有較高綜合利用價(jià)值副產(chǎn)物。通過對甜菜的特殊處理可以生產(chǎn)甲醇、乙醇、甘油等，也是制作金霉素等許多醫(yī)藥與輕工業(yè)產(chǎn)品的原料，也可以生產(chǎn)肥料、飼料等[1]。甜菜屬于兩年生作物，傳統(tǒng)的育種自交系的方法具有耗時(shí)長、成本高、易受環(huán)境氣候影響的弱點(diǎn)。可以采用生物技術(shù)手段來培育自交系，如花藥培養(yǎng)和花粉培養(yǎng)、未授粉胚株培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)與融合、離體篩選和誘變育種。其中原生質(zhì)體培養(yǎng)和細(xì)胞融合是細(xì)胞工程的重要內(nèi)容。原生質(zhì)體是除去細(xì)胞壁的植物細(xì)胞和細(xì)菌細(xì)胞，仍有正常細(xì)胞的全部功能。原生質(zhì)體可以用來研究無性雜交、亞細(xì)胞定位、目的基因的瞬時(shí)表達(dá)、遺傳轉(zhuǎn)化和突變體的選擇。植物的原生質(zhì)體可以為植物遺傳改良、研究生理過程現(xiàn)象提供理想材料。由于原生質(zhì)體沒有細(xì)胞壁的阻隔，可以通過原生質(zhì)體的融合進(jìn)行的體細(xì)胞雜交，可以克服雜交不親和的問題，為雜交育種提供了新的手段。

原生質(zhì)體的首次提取是Klercker[2]在1892年通過機(jī)械法在水劍葉葉片中獲取的。原生質(zhì)體的制備研究真正開始于1960年，由Cocking[3]通過酶解法在番茄的根尖中獲取的大量的高質(zhì)量原生質(zhì)體。1972年Rona[4]利用酶解法建立了歐亞槭的原生質(zhì)體再生體系，進(jìn)而為木本植物的原生質(zhì)體的培養(yǎng)提供了開端。目前在擬南芥(Arabidopsis thaliana)、 煙草(Nicotiana tabacum L.)、水稻(Oryza sativa L.) 、棉花(Gossypium spp.) 、小麥(Triticum aestivum L.) 等植物中，已經(jīng)建立了非常高效的原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系，并應(yīng)用于各項(xiàng)基礎(chǔ)研究中。

甜菜原生質(zhì)體成功提取在1976年，由Li成功分離出甜菜原生質(zhì)體；1981年，前蘇聯(lián)學(xué)者M(jìn)molenSkays分離培養(yǎng)出來甜菜原生質(zhì)體并獲得了細(xì)胞團(tuán)；1985年，Szobados 和Bhat 獲得了甜菜原生質(zhì)體產(chǎn)生的愈傷組織；國內(nèi)首次獲得甜菜原生質(zhì)體愈傷組織在1986年，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所邵明文等人獲??；在1988年和1990年荷蘭學(xué)者Krens 及其同事兩次報(bào)道了成功離體培養(yǎng)了甜菜原生質(zhì)體，并由此培育出再生植株；此后，1992年李永峰等[5]、1993年的郭九峰[6]及馬有會(huì)等[7]相繼報(bào)道了由甜菜原生質(zhì)體培養(yǎng)獲得愈傷組織以及體細(xì)胞胚，但是沒有得到再生植株；在1994年郭九峰等[8]初步報(bào)道了從甜菜未授粉胚珠或胚的愈傷組織中獲得了原生質(zhì)體，并得到再生植株，但是沒有重現(xiàn)性。目前，甜菜原生質(zhì)體的大規(guī)模分離還不夠成功，存在原生質(zhì)體分離困難、活力較低、完整性較差等問題。本文根據(jù)原生質(zhì)體的制備體系流程，講述影響原生質(zhì)體提取的因素，并介紹其研究進(jìn)展，為了進(jìn)一步完善甜菜原生質(zhì)體制備體系，對甜菜原生質(zhì)體的應(yīng)用進(jìn)行研究。

1 原生質(zhì)體的分離

1.1 制備材料的選擇

選擇制備材料時(shí)需要考慮到材料的品種、組織類型以及生理狀態(tài)等因素的影響。原生質(zhì)體分離的原始材料可以從植物的葉片、根、莖、果實(shí)、花等器官中分離獲取，也可以從愈傷組織、胚性愈傷組織、腫瘤組織、懸浮細(xì)胞、雌雄配子體等中分離制備。通過大量研究發(fā)現(xiàn)，采用懸浮細(xì)胞分離原生質(zhì)體，在實(shí)驗(yàn)過程中存在操作難的問題，并且懸浮細(xì)胞處于未分化的階段，由此得到的原生質(zhì)體不適合進(jìn)行下一步的研究。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，要十分注意保持材料的培養(yǎng)條件的相對穩(wěn)定性。

目前以報(bào)道的甜菜原生質(zhì)體制備主要以愈傷組織、子葉、懸浮細(xì)胞、保衛(wèi)細(xì)胞等材料，并且通常選擇生長數(shù)周的幼嫩子葉的切段作為實(shí)驗(yàn)材料。如1993年馬友會(huì)等[7]初次報(bào)道成功分離甜菜原生質(zhì)體采用是甜菜子葉的切段。

1.2 材料的預(yù)處理

很多研究表明，酶解過程對于原生質(zhì)體來說是有害的。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前對材料進(jìn)行預(yù)處理，可以改變細(xì)胞核、細(xì)胞壁的生理狀態(tài)，避免損傷細(xì)胞膜，既可以提高酶解效率，同時(shí)又能減少破壞原生質(zhì)體，提高原生質(zhì)體的產(chǎn)量，增強(qiáng)原生質(zhì)體的活力以及保持原生質(zhì)體的完整性[9]。對材料的預(yù)處理可以采用暗處理、冷處理、物理破壞組織、真空滲透處理、預(yù)先質(zhì)壁分離處理等方式。郭九峰等[6]在酶解前將愈傷組織經(jīng)過一定時(shí)間的低溫處理。馬有會(huì)等[7]在酶解前將子葉置于黑暗、4℃的條件下24 h，并且將子葉切條后放入CPW11M高滲溶液中先預(yù)質(zhì)壁分離6h。劉巧紅等[10]在酶解前先將子葉切條，然后放入CPW12M高滲溶液進(jìn)行4 h的預(yù)質(zhì)壁分離。除此之外，在實(shí)驗(yàn)中通常會(huì)將子葉切成1mm寬的小條，在進(jìn)行酶解，這樣增加了實(shí)驗(yàn)材料與酶溶液的接觸面積，可以提高酶解的效率。

1.3 原生質(zhì)體分離方法

分離植物原生質(zhì)體的方法主要是機(jī)械分離法和酶解分離法，目前在使用中酶解分離法更為常用。

1.3.1 機(jī)械分離法

機(jī)械分離法是將植物細(xì)胞放在高滲糖溶液中使材料發(fā)生質(zhì)壁分離，待原生質(zhì)體收縮成球后，與細(xì)胞壁進(jìn)行脫離，之后使用剪刀等器具破壞細(xì)胞壁，將完整的原生質(zhì)體從傷口釋放出來。機(jī)械法可以避免酶制劑對原生質(zhì)體的破壞作用，有利于開展生理生化研究。一般只有在薄壁組織排列松散、細(xì)胞間接觸點(diǎn)很少時(shí)，用機(jī)械法分離葉肉細(xì)胞才能取得成功，如洋蔥球莖鱗片、蘿卜根、甜菜根組織等。但是機(jī)械法具有操作困難、產(chǎn)量不高、活性較低的缺點(diǎn)，只是在用酶解法酶解細(xì)胞壁時(shí)有很多副作用時(shí)，可采用此法。同時(shí)分生組織和液泡化程度不高的細(xì)胞不適合使用機(jī)械法。因此，現(xiàn)在很少人使用機(jī)械法對植物細(xì)胞進(jìn)行分離。

1.3.2 酶解分離法

現(xiàn)在對于分離原生質(zhì)體最常用的方法是酶解分離法。酶解法是指將材料放入能夠降解細(xì)胞壁的混合等滲酶液中保溫一定時(shí)間，在酶液的作用下，細(xì)胞壁被降解，從而獲得大量有活力的原生質(zhì)體的方法。酶解法首次使用是Cocking[3]在1960年利用纖維素酶粗制劑從番茄的根尖中分離出大量的高質(zhì)量原生質(zhì)體。酶解法分為振蕩酶解和靜置酶解。振蕩酶解是將材料放在振蕩器或者搖床進(jìn)行酶解；靜置酶解是在合適的溫度下，將酶液處于靜止?fàn)顟B(tài)對細(xì)胞進(jìn)行酶解。采用的酶主要有纖維素酶、離析酶、果膠酶、半纖維素酶和崩潰酶等。植物細(xì)胞的細(xì)胞壁主要成分為纖維素和果膠，因此在分離植物原生質(zhì)體時(shí)，纖維素酶和果膠酶最為必要。纖維素酶主要起到去除植物細(xì)胞壁的纖維素的作用；果膠酶可以加快細(xì)胞間隙的果膠質(zhì)的分解，促使細(xì)胞相互分離；離析酶可以消化細(xì)胞骨架的果膠質(zhì)成分，可以分離粘連在一起的植物細(xì)胞。其中果膠酶對于植物原生質(zhì)體的傷害較大，因此可以選擇屬于果膠酶類的離析酶來代替果膠酶進(jìn)行試驗(yàn)。馬有會(huì)等[7]在對甜菜雙豐10號子葉分離原生質(zhì)體時(shí)采用的是2%的纖維素酶R-10、1%的離析酶R-10和0.5%的崩潰酶。由于不同研究中使用的酶的種類和濃度不同，實(shí)驗(yàn)中酶制劑的選擇要根據(jù)材料的不同而定。

酶解法中，除了酶液的組成、濃度以外，酶液的pH值、酶解時(shí)的溫度和時(shí)間、酶解滲透壓以及轉(zhuǎn)速都會(huì)影響著原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力。其中酶液的pH值影響著酶的活性和質(zhì)膜的穩(wěn)定性，過高或者過低的pH值會(huì)改變細(xì)胞結(jié)構(gòu)，破壞原生質(zhì)體的形態(tài)。酶解液pH值一般和植物最適生長pH值相符，一般在5.4～5.8之間，甜菜原生質(zhì)體分離實(shí)驗(yàn)中pH值一般為5.7或5.8。同時(shí)在酶液中可以添加適量的MES，可以維持酶解期間的pH值穩(wěn)定性。酶解時(shí)的溫度對原生質(zhì)體的分離產(chǎn)生多樣的影響，溫度升高會(huì)加快酶解反應(yīng)的速度，但溫度過高會(huì)導(dǎo)致酶失去活性。因此，在酶解時(shí)要注意選擇適宜的溫度。酶解溫度一般控制在25～30℃的范圍內(nèi)，甜菜原生質(zhì)體分離實(shí)驗(yàn)中酶解時(shí)溫度一般控制在25～27℃范圍內(nèi)。酶解時(shí)間在不同植物種類、材料中是不同的，一般在4～24 h之間，酶解的時(shí)間過長會(huì)影響原生質(zhì)體的活性，酶解時(shí)間過短會(huì)導(dǎo)致分離出的原生質(zhì)體數(shù)量太少。甜菜葉片的酶解時(shí)間一般在10～14 h之間。

在酶解液中一般會(huì)添加入一定濃度的質(zhì)膜穩(wěn)定劑和滲透壓穩(wěn)定劑，可以有效防止游離出來的原生質(zhì)體發(fā)生破裂。經(jīng)常用的滲透穩(wěn)定劑主要分為鹽溶液(如KCl、KH2PO4)和糖溶液(如甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖)[11]。其中最常用的滲透壓調(diào)節(jié)劑是甘露醇，甘露醇為代謝惰性，不被植物細(xì)胞吸收利用[12]，濃度一般在0.4～0.6 mol/L，可以保持原生質(zhì)體較高的活性。在酶解過程中可以通過搖床加速原生質(zhì)體的分離，轉(zhuǎn)速通?？刂圃?0～50 rad/min，可以有效防止原生質(zhì)體機(jī)械損傷。此外，在進(jìn)行酶解時(shí)，光照可能會(huì)損傷細(xì)胞質(zhì)膜，導(dǎo)致原生質(zhì)體活力下降，因此在原生質(zhì)體酶解實(shí)驗(yàn)時(shí)一般選擇黑暗或者弱光的環(huán)境。

2 原生質(zhì)體的純化與活力檢測

2.1 原生質(zhì)體的純化

經(jīng)過酶解的處理之后，還需要進(jìn)一步的對原生質(zhì)體提純，以此來獲得高活力的高純度的原生質(zhì)體。純化原生質(zhì)體是很有必要的，因?yàn)槊附夂蟮玫降氖呛性|(zhì)體、未分解的細(xì)胞、細(xì)胞碎片、原生質(zhì)體碎片等復(fù)雜成分的溶液，里面的雜質(zhì)會(huì)污染后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。原生質(zhì)體純化的方法主要有離心沉降法、漂浮法和界面離心法[13]。最常用到的是離心沉降法，原理是因原生質(zhì)體性質(zhì)較大，通過離心可將原生質(zhì)體沉于底部，便于進(jìn)一步的收集，這種方法操作方便，損失也少，但是純度不高[14]；通過漂浮法純化的原生質(zhì)體純度高，但是收率較低[15]；通過界面離心法得到的原生質(zhì)體大小均勻，但是收率比較低[16]。馬有會(huì)等[7]在對甜菜原生質(zhì)體的提純中采用了離心沉降法，將濾液放入500 rpm速率下的離心機(jī)進(jìn)行3～5 min的離心，然后去除上層的雜質(zhì)，采集底部的原生質(zhì)體。

2.2 原生質(zhì)體活力的檢測

檢測原生質(zhì)體活性常用的方法有熒光素二乙酸(FDA)染色法，酚藏花紅染色法、臺(tái)盼蘭染色法、熒光增白劑染色法等[17]。熒光素二乙酸(FDA)染色法是檢測原生質(zhì)體活性最常用的方法，F(xiàn)DA本身是沒有熒光的，是可以穿過細(xì)胞膜自由出入細(xì)胞的，在活細(xì)胞中FDA 經(jīng)酯酶可以分解為熒光素，在鏡檢時(shí)顯示黃/綠色熒光，死細(xì)胞顯示紅色熒光或者是不發(fā)熒光的[18]。劉巧紅等[10]采用2.0%Evans blue 染色測定原生質(zhì)體活力。

3 當(dāng)前存在的問題

近年來，關(guān)于植物原生質(zhì)體研究得到了快速的發(fā)展，有更多的植物種類通過原生質(zhì)體得到了再生植株，有一些的植物建立了比較完善原生質(zhì)體制備體系。但是甜菜原生質(zhì)體分離的報(bào)道較少，還處在不斷探索的階段。在甜菜原生質(zhì)體分離中還存在著原生質(zhì)體分離困難、原生質(zhì)體活力不高、效率低等問題。

對于分離材料而言，在現(xiàn)有對于原生質(zhì)體分離的研究中，每次研究往往只選取一個(gè)品種來探索原生質(zhì)體分離條件，且材料單一，導(dǎo)致具有一定的局限性。在目前對于甜菜原生質(zhì)體分離材料中主要是選擇愈傷組織或者子葉。一些報(bào)道選擇甜菜子葉為分離材料時(shí)，原生質(zhì)體分離的難度較小，但是葉片表面蠟質(zhì)層相對較厚，導(dǎo)致分離出的原生質(zhì)體較少。選擇胚性懸浮細(xì)胞或愈傷組織作為甜菜原生質(zhì)體分離實(shí)驗(yàn)材料時(shí)，原生質(zhì)體的產(chǎn)量較高、活力較強(qiáng)，分離出的原生質(zhì)體也有易培養(yǎng)、易分化的優(yōu)點(diǎn)，但是培養(yǎng)懸浮細(xì)胞系周期較長。

對于酶解條件而言，已有的報(bào)道中主要采用的纖維素酶、離析酶和果膠酶對甜菜原生質(zhì)體進(jìn)行分離實(shí)驗(yàn)，但是不同報(bào)道中酶解液的成分和比例是不同的，所用的材料也是不同的。因此，得到的最適組合是不同的，需要綜合考慮酶液的pH值、酶解時(shí)的溫度和時(shí)間、酶解滲透壓以及轉(zhuǎn)速等多種因素的影響。在對于酶解時(shí)間的選擇上，馬有會(huì)等[7]認(rèn)為酶解10 h得到的效果更好，而劉巧紅等[10]認(rèn)為酶解12 h得到的效果更好，說明不同的實(shí)驗(yàn)條件下，實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化要具有針對性。

對于原生質(zhì)體應(yīng)用而言，現(xiàn)有的甜菜原生質(zhì)體制備中，實(shí)驗(yàn)要經(jīng)過一系列的操作才能分離出原生質(zhì)體，在實(shí)驗(yàn)中原生質(zhì)體容易受到化學(xué)損傷和機(jī)械損傷，降低原生質(zhì)體活力，加大了原生質(zhì)體培養(yǎng)的難度，致使成活率低，阻礙了原生質(zhì)體的應(yīng)用。因此，需要建立一種簡便高效的甜菜原生質(zhì)體制備體系，便于研究無性雜交、亞細(xì)胞定位、目的基因的瞬時(shí)表達(dá)、遺傳轉(zhuǎn)化和突變體的選擇等。

4 研究展望

甜菜原生質(zhì)體高效分離體系尚未完善，近年來，對于甜菜原生質(zhì)體制備的研究較少。甜菜原生質(zhì)體研究應(yīng)用的基礎(chǔ)是可以輕易得到大量活力高的原生質(zhì)體。根據(jù)已有研究表明，原生質(zhì)體制備的第一步是選擇合適的分離材料。再者是酶解時(shí)選擇合適的酶液種類、濃度、酶液的pH值、酶解時(shí)的溫度和時(shí)間、酶解滲透壓以及轉(zhuǎn)速，以此獲得的原生質(zhì)體產(chǎn)量更大、活力更高。影響原生質(zhì)體分離效率的因素很多，可以通過正交實(shí)驗(yàn)對不同品種不同類型的材料進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，從而明確單個(gè)因素對結(jié)果的影響水平，進(jìn)而優(yōu)化實(shí)驗(yàn)參數(shù)，確定甜菜原生質(zhì)體制備所需的最佳條件，構(gòu)建甜菜原生質(zhì)體分離體系。鄒彰毅等[19]通過單因素試驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)菌齡、溶壁酶濃度、酶解時(shí)間、酶解溫度、pH5個(gè)因素對姬松茸原生質(zhì)體制備及再生的影響，進(jìn)而建立了姬松茸原生質(zhì)體分離體系，以提高姬松茸原生質(zhì)體產(chǎn)量和再生率；楊成蘭等[20]以青稞幼葉為材料設(shè)計(jì)4因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)，包括甘露醇濃度、酶解時(shí)間、離心速度和不同苗齡因素，對青稞原生質(zhì)體制備進(jìn)行優(yōu)化。

甜菜原生質(zhì)體制備還存在一定的困難，甜菜原生質(zhì)體的成功制備可以更好的研究甜菜在體細(xì)胞雜交、亞細(xì)胞定位、無性雜交、基因轉(zhuǎn)化和誘導(dǎo)突變體等，可以進(jìn)一步的加快有關(guān)甜菜遺傳學(xué)、生理生化等實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，對于甜菜的遺傳育種具有重要意義。