伍班名 張濤 張秀容 鐘寒迪 王桂林

(宜賓市第二人民醫(yī)院 1.急診科；2.檢驗科；3.胃腸外科，四川 宜賓 644000)

結(jié)腸癌是常見的惡性腫瘤之一，近些年的發(fā)病率和死亡率升高，嚴重威脅人們健康及生命[1]。基因治療作為近年來一種新的腫瘤診療手段引起了廣泛關(guān)注。基因治療是通過向靶組織或細胞導(dǎo)入外源DNA或RNA片段，使致病基因表達水平降低或治療基因表達增強，從而達到治療的目的[2]。因此，尋找影響結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的有效基因并對其功能確認，對于腫瘤治療具有重要意義。近些年，脂筏結(jié)構(gòu)蛋白2(Flotillin-2，F(xiàn)LOT2)基因引起了廣大學(xué)者的關(guān)注。人FLOT2基因定位于17q11-12上，多項研究[3-5]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LOT2的高表達可影響乳腺癌、鼻咽癌、口腔鱗狀細胞癌等腫瘤細胞生長，可能成為抗腫瘤治療靶點。另有研究[6]發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織及細胞FLOT2表達升高，其表達與浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移等有關(guān)，但FLOT2對結(jié)腸癌細胞生物學(xué)特性及機制研究尚未明確。因此，本研究旨在通過將FLOT2 siRNA慢病毒載體轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細胞，觀察細胞增殖、侵襲遷移及凋亡率變化，并進一步研究其機制。

1 材料與方法

1.1 組織樣本 選取2018年10月～2019年5月在我院行住院手術(shù)治療的結(jié)直腸癌患者腫瘤及癌旁組織(距癌變部位大于5 cm)標本，共40對，其中男性16例，女性24例。所有組織切除后即刻送往實驗室沖洗干凈，然后放置在液氮罐中冷凍，在-80℃冰箱保存。所有患者經(jīng)過病理確診，且相關(guān)病歷及治療完整；術(shù)前均未行放化療及靶向藥物治療等干預(yù)措施；患者無其他組織或器官的惡性腫瘤。樣本采集經(jīng)過患者知情同意，簽署知情同意書，并經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 試劑和儀器 胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、胰酶均購自美國Hyclone公司，RNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TAKARA公司，F(xiàn)LOT2、PCNA、cleaved caspase3、E-cadherin和Vimentin抗體均購自美國Abcam，MTT、DMSO均購自美國Sigma公司，Transwell小室購自美國corning公司，細胞凋亡試劑盒購自美國Invitrogen公司，PCR儀購自美國Bio-Rad公司，紫外分光光度計購自美國Perkin Elmar公司，酶標儀購自美國Thermo公司，流式細胞儀購自美國BD。

1.3 細胞及培養(yǎng) 人正常結(jié)腸上皮細胞NCM460及結(jié)腸癌LoVo、SW480及HT29細胞均購自美國ATCC。細胞常規(guī)復(fù)蘇后，置于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱，使用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。實驗為生長至對數(shù)期的細胞。

1.4 qRT-PCR檢測RNA表達水平 根據(jù)RNA抽提試劑盒說明提取組織及細胞總RNA，利用分光光度儀檢測RNA的濃度及純度，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。設(shè)計FLOT2引物：F:5′-GGCTTGTGAGCAGTTTCTGG-3′，R:5′-TCGAAGGCTCGCTTAGAGTC-3′；內(nèi)參GAPDH引物：F:5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，R:5′-TCCACCACCCTGTTGCTGT-3′。PCR反應(yīng)體系：SYBR Green 10 μL，上下游引物：各0.5 μL，cDNA 1 μL，加入ddH2O至20 μL。反應(yīng)條件為95℃ 5 min，接著35個循環(huán)，95℃ 30 s，60℃ 30 s。采用2-△△Ct法計算FLOT2 mRNA相對表達水平。設(shè)置5個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.5 Western blot檢測蛋白水平 細胞中加入適量RIPA裂解液，裂解反應(yīng)結(jié)束后，離心，上清即為提取蛋白。蛋白與上樣緩沖液混勻后在100℃變性5 min，取等量變性蛋白上樣，經(jīng)SDS-PAGE分離，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)PVDF膜。洗膜，5%脫脂奶粉封閉膜，1 h后加一抗工作液，4℃孵育過夜，洗膜，加入HRP標記的二抗，37℃孵育1 h。洗膜，ECL顯色，Bio-Rad掃描分析。以檢測的目的蛋白與內(nèi)參GAPDH灰度值比值作為目的蛋白相對表達量。實驗重復(fù)3次。

1.6 分組及慢病毒轉(zhuǎn)染 以2×105/孔接種生長至對數(shù)期的LoVo細胞和SW480細胞于24孔板，于培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。實驗分為空白組(細胞未感染)、si-NC組(空載體慢病毒感染)和si-FLOT2組(FLOT2 siRNA慢病毒感染)。觀察到細胞達70%生長密度時，將病毒稀釋液(MOI=30)依照分組加入到相應(yīng)的孔內(nèi)，感染5 d，細胞感染效率達到80%時，繼續(xù)孵育48 h。加入4 μg/mL嘌呤霉素以篩選FLOT2表達沉默的細胞株。采用qRT-PCR及Western blot檢測轉(zhuǎn)染后的細胞FLOT2的感染效果。

1.7 MTT實驗檢測細胞增殖能力 取轉(zhuǎn)染后處于生長至對數(shù)期的LoVo細胞和SW480細胞，制備成單細胞懸液，細胞計數(shù)后將濃度調(diào)整為1×104個/mL，96孔板每孔加100 μL細胞懸液，于培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，每組5個復(fù)孔，設(shè)置24、48和72 h三個時間梯度加MTT液，每孔20 μL，培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)2 h，棄掉孔內(nèi)上清，在每孔中加100 μL DMSO，結(jié)晶溶解后，酶標儀測定490 nm波長光密度值(OD)。實驗重復(fù)3次。

1.8 Transwell實驗檢測侵襲、遷移能力 細胞侵襲檢測：首先將Transwell小室底部膜上室面使用Matrigel稀釋液包被，4℃風(fēng)干。吸出殘余在培養(yǎng)板中液體，按照50 μL/孔加無血清培養(yǎng)液，37℃，30 min。將小室放入培養(yǎng)板中，上室中加無血清培養(yǎng)基300 μL，室溫靜置30 min，以使基質(zhì)膠再水化。細胞懸液制備前可饑餓處理細胞12～24 h，以進一步除去血清的影響。胰酶消化細胞，細胞計數(shù)后將密度調(diào)整為1×105個/mL，小室上室中加100 μL細胞懸液，下室中加含血清培養(yǎng)基500 μL，于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。使用棉簽輕輕擦去上室內(nèi)細胞及基質(zhì)膠，取出小室，倒置風(fēng)干后，0.1%結(jié)晶紫染色，37℃ 30 min取出。PBS清洗，顯微鏡下隨機選擇5個視野，照相，計數(shù)。實驗重復(fù)3次。細胞遷移檢測：實驗步驟同細胞侵襲實驗，差異在于Transwell小室底部膜上室面未鋪Matrigel。

1.9 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡實驗 收集慢病毒感染48 h的各組LoVo細胞和SW480細胞，胰酶消化、計數(shù)細胞，使1 mL細胞懸液中至少含1×106個細胞，預(yù)冷PBS洗滌細胞，離心，加入300 μL結(jié)合緩沖液重懸細胞，使其濃度大于1×105/mL，避光環(huán)境分別加入5 μL的AnnexinV-FITC和PI工作液，混勻，室溫避光反應(yīng)15～20 min。上機檢測前補加500 μL結(jié)合緩沖液，1 h內(nèi)通過流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌組織及細胞FLOT2的表達 通過qRT-PCR檢測結(jié)直腸癌組織及人正常結(jié)腸上皮細胞NCM460及結(jié)腸癌LoVo、SW480及HT29細胞FLOT2的表達水平，Western blot檢測結(jié)腸癌細胞FLOT2蛋白水平，與癌旁組織FLOT2水平比較，結(jié)直腸癌組織FLOT2表達水平明顯升高(P<0.05)，與NCM460細胞比較，F(xiàn)LOT2在三個結(jié)腸癌細胞mRNA及蛋白表達水平均明顯升高(P<0.05)，見圖1、表1。

表1 不同結(jié)腸癌細胞FLOT2 mRNA及蛋白相對表達水平Table 1 The relative expression levels of FLOT2 mRNA and protein in different colon cancer cells

圖1 Western blot檢測結(jié)腸癌細胞FLOT2的表達Figure 1 Western blot detection of FLOT2 expression in colon cancer cells

2.2 慢病毒感染后LoVo細胞和SW480細胞FLOT2表達 慢病毒感染LoVo細胞和SW480細胞后，采用qRT-PCR及Western blot檢測各組細胞FLOT2表達水平，結(jié)果顯示，兩株細胞空白組和si-NC組FLOT2表達比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而si-FLOT2組FLOT2 mRNA及蛋白表達水平均明顯低于空白組(均P<0.05)，見圖2、表2。

圖2 慢病毒感染后LoVo細胞和SW480細胞FLOT2表達水平Figure 2 FLOT2 expression levels in LoVo cells and SW480 cells after lentivirus infection注：A.LoVo細胞；B.SW480細胞

表2 LoVo細胞和SW480細胞FLOT2 mRNA及蛋白相對表達水平Table 2 Relative expression levels of FLOT2 mRNA and protein in LoVo cells and SW480 cells

2.3 抑制FLOT2表達對LoVo細胞和SW480細胞增殖活力的影響 MTT法檢測抑制FLOT2后的LoVo細胞和SW480細胞增殖能力，兩株細胞si-NC組與空白組在三個時間點細胞增殖能力比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而si-FLOT2組從48 h起細胞增殖能力明顯低于空白組(P<0.05)，見表3。

表3 各組LoVo細胞和SW480細胞OD值Table 3 OD values of LoVo cells and SW480 cells in each group

2.4 抑制FLOT2表達對LoVo細胞和SW480細胞侵襲遷移能力的影響 Transwell小室檢測FLOT2 siRNA慢病毒感染LoVo細胞和SW480細胞48 h的細胞侵襲遷移能力，結(jié)果顯示，抑制LoVo細胞SW480細胞FLOT2表達后，細胞侵襲和遷移均降低，與空白組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3和表4。

圖3 Transwell檢測細胞遷移和侵襲Figure 3 Transwell detects cell migration and invasion

2.5 抑制FLOT2表達對LoVo細胞和SW480細胞凋亡的影響 采用AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測各組LoVo細胞和SW480細胞凋亡率變化，結(jié)果顯示，抑制LoVo細胞和SW480細胞FLOT2表達，細胞凋亡率升高，與空白組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表4和圖4。

表4 各組LoVo細胞和SW480細胞侵襲數(shù)、遷移數(shù)及凋亡率Table 4 Invasion number，migration number and apoptosis rate of LoVo cells and SW480 cells in each group

圖4 流式細胞術(shù)檢測抑制FLOT2表達對LoVo細胞和SW480細胞凋亡的影響Figure 4 Flow cytometry was used to detect the effect of FLOT2 inhibition on apoptosis of LoVo cells and SW480 cells注：A.LoVo細胞；B.SW480細胞

2.6 抑制FLOT2表達對LoVo細胞和SW480細胞增殖、凋亡、侵襲遷移相關(guān)蛋白表達的影響 采用Western blot檢測各組LoVo細胞和SW480細胞與增殖、凋亡及EMT相關(guān)的PCNA、cleaved caspase3及E-cadherin和Vimentin表達，結(jié)果顯示，抑制LoVo細胞和SW480細胞FLOT2表達后，PCNA和Vimentin表達降低，cleaved caspase3和E-cadherin表達升高，與空白組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖5，表5、6。

圖5 Western blotting檢測LoVo細胞(A)和SW480細胞(B)PCNA、cleaved caspase3、E-cadherin和Vimentin表達Figure 5 Expression of PCNA，Cleaved caspase3，E-cadherin and Vimentin in LoVo cells (A)and SW480 cells (B)were detected by Western blotting注：A.LoVo細胞；B.SW480細胞

表5 LoVo細胞PCNA、cleaved caspase3、E-cadherin和Vimentin蛋白相對表達量Table 5 Relative protein expression levels of PCNA，Cleaved caspase3，E-cadherin and Vimentin in LoVo cells

表6 SW480細胞PCNA、cleaved caspase3、E-cadherin和Vimentin蛋白相對表達量Table 6 Relative expression levels of PCNA，Cleaved caspase3，E-cadherin and Vimentin in SW480 cells

3 討論

腫瘤發(fā)生、發(fā)展是一個多階段、多基因改變、多因素協(xié)同作用的復(fù)雜過程，其中抑癌基因失活、癌基因過度表達是腫瘤發(fā)生的分子基礎(chǔ)，對與腫瘤相關(guān)基因的分子生物學(xué)、調(diào)節(jié)機制及治療方法研究具有重要意義[7-8]。多項研究證實，多種腫瘤中存在FLOT2的過表達，其表達與腫瘤進展有關(guān)，如Cao等[9]研究顯示，胃癌中FLOT2表達升高，下調(diào)其表達可抑制癌細胞增殖、侵襲和遷移能力；李鎮(zhèn)伽等[10]研究顯示，胃癌中FLOT2表達升高，其表達與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度、遠處轉(zhuǎn)移及AJCC分期相關(guān)，低表達FLOT2的胃癌患者5年總體生存率明顯升高。miR-103a-3p、miR-485-5p通過靶向下調(diào)FLOT2表達抑制甲狀腺癌細胞的增殖，促進凋亡[11-12]。既往研究[6]表明，F(xiàn)LOT2在結(jié)腸癌中高表達，但其表達對結(jié)腸癌細胞生長及機制研究尚未明確。因此，本研究檢測不同結(jié)腸癌細胞FLOT2表達情況，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌LoVo細胞FLOT2表達最高，因此選擇作為研究對象。采用慢病毒RNA干擾技術(shù)沉默LoVo細胞和SW480細胞FLOT2表達，探究其生物學(xué)特性改變，結(jié)果顯示，F(xiàn)LOT2表達受到抑制后，LoVo細胞和SW480細胞增殖及侵襲遷移均明顯降低，凋亡率升高。提示FLOT2可能與結(jié)腸癌進展有關(guān)。

PCNA是DNA復(fù)制過程的必需因子，腫瘤中PCNA表達升高，已將其作為腫瘤是否增殖的標志物[13-14]。有研究顯示，乳腺癌中FLOT2表達升高，抑制FLOT2的表達可降低PCNA表達[15]。caspase家族成員是細胞凋亡過程最為重要的蛋白類，而caspase3是caspase家族最為重要的一種，是多種凋亡途徑中共同的下游效應(yīng)部分，其活化后可使凋亡發(fā)生不可逆，因此被稱為“死亡執(zhí)行蛋白酶”[16]。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個包括基質(zhì)降解、血管生成、運動增強、細胞黏性改變等的多步驟、多因子參與的復(fù)雜過程，目前腫瘤轉(zhuǎn)移是在全世界范圍內(nèi)導(dǎo)致腫瘤患者死亡的一個首要原因[17-18]。近年來研究證實，上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，是決定侵襲轉(zhuǎn)移程度的一個關(guān)鍵因素[19]。E-cadherin是EMT發(fā)生的重要標志，其在包括結(jié)腸癌在內(nèi)的腫瘤中表達減少可引起細胞活性增強及細胞間黏附力減弱[20-21]。有研究顯示，食管癌中FLOT2高表達，其表達可促進癌細胞生長和侵襲能力[22]；miR-449a可通過靶向FLOT2抑制TGF-β介導(dǎo)的EMT而抑制胃癌細胞侵襲[23]；FLOT2可通過調(diào)節(jié)細胞周期和誘導(dǎo)肝細胞癌EMT促進腫瘤生長和轉(zhuǎn)移[24]。本研究結(jié)果顯示，LoVo細胞FLOT2表達受到抑制后，PCNA和Vimentin表達明顯降低，cleaved caspase3和E-cadherin表達明顯升高，提示FLOT2可能通過調(diào)節(jié)PCNA、spase3、E-cadherin和Vimentin表達影響結(jié)腸癌細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移。核因子-κB(Nuclear factor-κB，NF-κB)的激活通過促進細胞增殖、血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移，抑制細胞凋亡在結(jié)腸癌進展中起促進作用[25]。有研究[26]報道干擾FLOT2通過抑制NF-κB信號通路可誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡。但FLOT2是否通過調(diào)控NF-κB信號通路調(diào)控結(jié)腸癌細胞生物學(xué)行為進一步研究。

4 結(jié)論

結(jié)腸癌細胞FLOT2表達升高，抑制FLOT2表達可抑制結(jié)腸癌細胞增殖、侵襲和遷移，促進細胞凋亡。FLOT2可能是結(jié)腸癌的潛在診斷標記物和治療靶點，F(xiàn)LOT2在結(jié)腸癌中的具體作用機制需進一步研究。