李棟 朱海宏 陳敏 楊效

(1.成都京東方醫(yī)院，四川 成都 610200；2.青海省人民醫(yī)院，青海 西寧 810000)

泡型肝包蟲病是一種慢性的寄生蟲感染性肝臟疾病，大多數(shù)患者分布于西北牧區(qū)，主要是因?yàn)槭秤蒙扯鴮?dǎo)致多房棘球蚴感染[1-3]，在我國其發(fā)病率受地域影響較重。在臨床工作中可見部分患者病灶周邊肝臟發(fā)生纖維化，影響肝臟術(shù)后代償功能，降低預(yù)后效果。目前國內(nèi)外對肝纖維化的研究主要集中在炎性刺激因子[4-6]如腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素等，其中轉(zhuǎn)化生長因子β1(Transforming growth factor β1，TGF-β1)的致肝纖維化作用也基本達(dá)成共識(shí)，其可啟動(dòng)肝星狀細(xì)胞的活化，促使肝星狀細(xì)胞轉(zhuǎn)化成為成纖維細(xì)胞，進(jìn)而分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)，細(xì)胞外基質(zhì)的病態(tài)積累引發(fā)肝纖維化形成[7-8]。有相關(guān)研究[9-11]顯示，在乙肝病毒、酒精性肝炎導(dǎo)致的肝纖維化中，絲裂原活化蛋白激酶所屬的p38MAPK信號(hào)通路發(fā)揮了明顯的促肝纖維化功效，其可將真核細(xì)胞胞外分子信號(hào)轉(zhuǎn)至胞內(nèi)引起細(xì)胞反應(yīng)，在細(xì)胞生長、增殖、分化和凋亡等細(xì)胞反應(yīng)的傳導(dǎo)中起重要作用，另外可通過傳遞TGF-β1的生物學(xué)信號(hào)而發(fā)揮功能。人骨形態(tài)發(fā)生蛋白7(Bone morphogenetic protein-7，BMP-7)屬轉(zhuǎn)化因子超家族成員，其有較強(qiáng)的成骨作用外[12]。有研究[13-15]顯示BMP-7在心肌及腎臟纖維化中發(fā)揮了重要的抗纖維化作用，其可影響TGF-β1的致纖維化作用。因此本課題組將目標(biāo)鎖定在p38MAPK、TGF-β1、BMP-7的研究上，通過完善基礎(chǔ)機(jī)制研究進(jìn)一步反饋臨床應(yīng)用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入2017年9月～2018年11月在青海省人民醫(yī)院診療的40位患有泡型肝包蟲病患者。病例均為病檢明確診斷患者，排除其他理化因素導(dǎo)致的肝臟纖維化患者及不同類型肝炎患者。收集術(shù)后切除下的肝臟標(biāo)本。標(biāo)本厚度一般超過0.5 cm，一份行經(jīng)行染色，另一份液氮中迅速冷凍后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱予以保存。樣本采集經(jīng)過患者知情同意，并經(jīng)過醫(yī)院倫理委會(huì)員批準(zhǔn)。

1.2 儀器 臺(tái)式常溫/低溫離心機(jī)、移液槍、超凈工作臺(tái)、-80℃低溫冰箱(美國Thermo Forma公司)，快速混勻器、液氮罐10 L、高壓滅菌鍋、研磨碗/研磨杵(常州申光儀器有限公司)，恒溫箱(華電公司)，PCR儀、Nanodrop2000濃度檢測儀、熱循環(huán)儀(Roche公司)，超純凈水器、切片機(jī)、顯微鏡、載玻片。

1.3 試劑 液氮(西寧液氮公司)，細(xì)胞裂解液Trizo、DEPC水、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、無水乙醇、4%甲醛、石蠟、氯仿、異丙醇、二甲苯、PCR引物(生信)，HE及Masson染色劑盒(萊寶生物公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組 根據(jù)采集部位分為病灶組(病灶邊緣)、距病灶邊緣≤2 cm組(距病灶邊緣≤2 cm)和距病灶邊緣>2 cm組(距病灶邊緣>2 cm)。按照HE及Masson染色結(jié)果，對上述三組標(biāo)本進(jìn)行纖維化分級(jí)，分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)knodell[16](表1)。將纖維化分級(jí)標(biāo)本進(jìn)一步分為S0纖維化組、S1纖維化組、S2纖維化組、S3纖維化組。其中S0組既無明顯纖維化組設(shè)為實(shí)驗(yàn)對照組，S1、S2、S3三組分別設(shè)為目標(biāo)組。

表1 knodell分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)Table1 Knodell grading standard

1.5 HE染色及Masson染色 根據(jù)HE染色及Masson染色試劑盒說明書操作步驟，按照順序逐步完成染色，隨后顯微鏡觀察各組標(biāo)本染色情況。

1.6 qRT-PCR檢測mRNA表達(dá)水平 將在液氮中冷凍標(biāo)本研磨成細(xì)粉狀后，加入細(xì)胞裂解液然后放置10 min；在4℃低溫環(huán)境下經(jīng)12000轉(zhuǎn)離心10 min，將上清轉(zhuǎn)移到無酶離心管中，在離心管中加入200 μL氯仿，密封完畢后，混合均勻，室溫靜置5 min，再次12000 r，15 min，4℃離心處理，離心完畢后，目標(biāo)RNA大部分溶解在水相層中，小心吸取500 uL無色水相層移入1.5 mL無酶離心管，加入相同體積異丙醇，放置20 min，再次離心處理，棄除上清夜，保留沉淀，加入75%乙醇，洗滌雜質(zhì)。RNA質(zhì)量及濃度檢測：利用分光光度計(jì)檢驗(yàn)RNA濃度及純度是否合格。總體積：20 μL(RNA6.0 μL、5×Fastking-RT SuperMix 4.0 μL、ddH2O 10.0 μL)。42℃ 15 min 去除基因組及反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)、95℃ 3 min酶滅活。擴(kuò)增反應(yīng)及條件：2×SuperReal Color PreMix 10.0 μL、正向引物0.6 μL、反向引物0.6 μL、cDNA模板 1.0 uL、ddH2O 7.8 μL。引物序列(TGF-β1：正向5′-ttggcctgccaaacgacttcgg-3′，反向r5′-cgcggcgggatagcgctcct-3′；P38：正向5′-tccaaaggctactccgaatc-3′、反向5′-tgtttcaggtaaaggtgagc-3′；BMP-7：正向5′-GTGGTCAACCCTCGGCACA-3′、反向5′-GGCGTCTTGGAGCGATTCTG-3′ )miRNA擴(kuò)增(預(yù)變性，95℃ 15 min ；變性，95℃，10 s：退火 62℃ 30 s)。相對表達(dá)量用2-ΔΔCt表示。

2 結(jié)果

2.1 HE染色及Masson染色結(jié)果 根據(jù) HE染色及Masson染色結(jié)果，病灶邊緣大部分為S2度纖維化，距病灶邊緣<2 cm范圍內(nèi)大部分為S1度纖維化，距病灶邊緣>2 cm肝組織主要為S0度纖維化既無明顯纖維化的正常肝組織，見圖1、表2。

圖1 HE染色及Masson染色結(jié)果(40×)Figure 1 HE staining and Masson staining results

2.2 距病灶邊緣不同距離肝組織纖維化分級(jí) 根據(jù)HE染色及Masson染色結(jié)果，將各部位肝組織按照knodell標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行肝纖維化分級(jí)，病灶邊緣大部分為S2度纖維化，距病灶邊緣<2 cm范圍內(nèi)大部分為S1度纖維化，距病灶邊緣>2 cm肝組織主要為S0度纖維化既無明顯纖維化的正常肝組織，見表2。

表2 不同部位肝組織纖維化分級(jí)(n)Table 2 Fibrosis grading of liver tissue at different distances from the edge of lesion

2.3 在泡型肝包蟲病纖維化肝組織中TGF-β1、p38、BMP-7的相對表達(dá)情況 與S0纖維化組，S1、S2及S3纖維化組肝組織中TGF-β1的相對表達(dá)量表達(dá)升高，隨著纖維化的不斷加重，表達(dá)量逐漸顯著，在S3纖維化組中表達(dá)最高，各組間表達(dá)水平比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。p38在S1、S2及S3纖維化組的異常表達(dá)傾向，與TGF-β1在泡肝纖維化中的走勢高度相似，均較S0組表達(dá)明顯，纖維化程度越重表達(dá)量越高，在S3纖維化組中表達(dá)最高，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在S1、S2和S3纖維化組中BMP-7的相對表達(dá)走向與p38及TGF-β1明顯不同，表達(dá)最高為S2纖維化組，在S3纖維化組中的表達(dá)有下降趨勢，各組間異常表達(dá)情況具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 TGF-β1、p38、BMP-7的相對表達(dá)情況Table 3 Relative expression of TGF-β1，p38 and BMP-7

2.4 TGF-β1與p38及BMP-7相對表達(dá)量的相關(guān)分析 通過綜合分析TGF-β1、P38、BMP-7在各組中相對表達(dá)量的潛在關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)TGF-β1與p38在的異常表達(dá)情況呈正性相關(guān)(r=0.566P<0.01)，見圖2。通過綜合三組實(shí)驗(yàn)組中 TGF-β1與BMP-7的相對表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)TGF-β1與BMP-7的異常表達(dá)量呈負(fù)性相關(guān)(r=-0.349，P<0.01)，見圖3。在泡肝纖維化中，p38與BMP-7的相對表達(dá)無相關(guān)性(r=-0.17，P>0.05)，見圖4。

TGF-β1相對表達(dá)量圖2 TGF-β1與p38相關(guān)性分析Figure 2 Correlation analysis between TGF-β1 and p38

TGF-β1相對表達(dá)量圖3 TGF-β1與BMP-7相關(guān)性分析Figure 3 Correlation analysis between TGF-β1 and BMP-7

p38相對表達(dá)量圖4 p38與BMP-7相關(guān)性分析Figure 4 Correlation analysis between p38 and BMP-7

3 討論

目前，關(guān)于肝泡型包蟲病的研究表明病灶周圍肝組織存在不同程度的纖維化，有研究學(xué)者采用HE染色證實(shí)，在泡肝所致的纖維化中，距病灶5 cm范圍內(nèi)大部分染色結(jié)果為S2度纖維化，超過5 cm范圍外的染色結(jié)果基本均為S0度纖維化[17]。本課題進(jìn)一步通過HE染色結(jié)合Masson染色證實(shí)發(fā)現(xiàn)纖維化的顯著程度與病灶距離有明顯的相關(guān)性，在2 cm范圍內(nèi)肝組織纖維化比較明顯，大多為S2度纖維化。研究結(jié)果與大部分其他學(xué)者泡肝纖維化的研究類似。

本課題進(jìn)一步通過檢測BMP-7、p38、TGF-β1在不同纖維化級(jí)別中的異常表達(dá)趨勢，發(fā)現(xiàn)其中p38與TGF-β1的表達(dá)走向較為類似，在各級(jí)纖維化組中均異常表達(dá)，在S3纖維化組中表達(dá)最為活躍，其次為S2、S1度纖維化組，從表達(dá)曲線上可發(fā)現(xiàn)，p38與TGF-β1的表達(dá)活躍度與纖維化嚴(yán)重程度呈正相關(guān)性。另通過進(jìn)一步處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，p38與TGF-β1的相對表達(dá)情況成中度正相關(guān)性。通過上述實(shí)驗(yàn)及其他學(xué)者研究結(jié)果可推測，p38與TGF-β1在泡肝纖維化的演變中發(fā)揮了重要的促纖維化效力，TGF-β1生物信號(hào)的傳遞與p38MAPK介導(dǎo)通路息息相關(guān)[18-19]。但進(jìn)一步查找相關(guān)研究報(bào)道顯示，泡球蚴分泌的囊液未展現(xiàn)出足夠的生物效應(yīng)可促進(jìn)激肝星狀細(xì)胞增加TGF-β1的表達(dá)及活化[20]，從而進(jìn)一步推測，泡肝纖維化可能與其他類型肝纖維化有類似的發(fā)展機(jī)制，主要還是因長期理化刺激破壞肝細(xì)胞所致。BMP-7在泡肝纖維化中較其他兩個(gè)細(xì)胞因子具有明顯的特征，其并非一味地隨著纖維化的加重而大量表達(dá)，反而在S2度級(jí)纖維中表達(dá)最為突出，在S3及纖維化中有表達(dá)水平降低的趨勢。另綜合分析BMP-7與TGF-β1的異常表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二者間有一定程度的負(fù)相關(guān)，二者之間可能存在互相拮抗效應(yīng)，BMP-7與TGF-β1之間可能存在某種相互作用的機(jī)制，一旦某種外來因素導(dǎo)致TGF-β1的表達(dá)占優(yōu)時(shí)，打破二者間的平衡變化，參與泡肝纖維化的演化。本實(shí)驗(yàn)通過分子維度探索泡型肝包蟲纖維化的演化機(jī)制，為后續(xù)研究提供了一定潛在方向與思路。BMP-7的生物潛力還需進(jìn)一步激發(fā)探索，為肝纖維化的逆轉(zhuǎn)提供可能。

4 結(jié)論

本研究顯示，TGF-β1的促肝纖維化信號(hào)可通過p38MAPK介導(dǎo)通路可轉(zhuǎn)導(dǎo)TGF-β1生物信號(hào)而發(fā)揮促纖維化生物效應(yīng)；BMP-7在泡型肝包蟲纖維化肝組織中異常表達(dá)與TGF-β1之間可能存在某種動(dòng)態(tài)平衡關(guān)系，表達(dá)失衡可能加劇泡肝纖維化的演化發(fā)展。