王文婷 胡楊志 張芡 胡志立 劉力 鄧祖亮

(湘南學(xué)院附屬醫(yī)院，湖南 郴州 423000)

在世界范圍常見腫瘤中胃癌患病率排名第四位，致死率排名第二[1-2]。研究[3]顯示，胃癌的5年生存率很低，轉(zhuǎn)移是胃癌預(yù)后不良的主要原因之一。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenclymal transformation，EMT)是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟。EMT在胃癌的發(fā)生和發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用。二甲雙胍，也稱為1，1-二甲基雙胍鹽酸鹽，是FDA批準(zhǔn)臨床治療2型糖尿病的藥物；且二甲雙胍能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝，與腫瘤的發(fā)病率和死亡率降低相關(guān)[4-5]。研究[6-7]顯示，在乳腺癌患者中輔助化療聯(lián)合二甲雙胍可以提高治療的完全病理反應(yīng)率。因此，本研究旨在探討二甲雙胍在胃癌過程中的生物學(xué)功能，并試圖探討其是否參與調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與二甲雙胍溶液配制 實驗細(xì)胞選用胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS細(xì)胞，購自美國ATCC。細(xì)胞培基為含有10%胎牛血清及1%青鏈霉素混合液的高糖DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件：37℃，5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱。試驗中處理細(xì)胞所用的二甲雙胍購自中國碧云天生物，在操作臺上用PBS溶解成400 mmol/L保存液，用無菌注射式過濾器過濾，分裝-20℃保存。用不同濃度(0、10、20、40 mmol/L)的二甲雙胍處理胃癌細(xì)胞，將細(xì)胞分為對照組、二甲雙胍處理組(10、20、40 mmol/L)。

1.2 細(xì)胞形態(tài)及增殖評估 取生長狀態(tài)良好的胃癌細(xì)胞按每孔1×106個接種至6孔板中，用不同濃度二甲雙胍(0、10、20、40 mmol/L)處理24 h，棄去培養(yǎng)基用PBS清洗2～3次。用結(jié)晶紫染色液對胃癌細(xì)胞進(jìn)行染色，處理30 min棄去染色液，用PBS清洗2～3次后置于倒置顯微鏡下進(jìn)行拍照，觀察細(xì)胞在不同濃度二甲雙胍處理下的細(xì)胞密度和狀態(tài)。用CCK-8試劑盒(碧云天生物，中國)檢測胃癌細(xì)胞增殖活性。取生長狀態(tài)良好的胃癌細(xì)胞，按1×103/孔的密度接種于96孔板，在37℃下培養(yǎng)24 h后進(jìn)行二甲雙胍(10、20、40 mmol/L)處理。處理24 h后，將CCK-8試劑加入每個含有孔的細(xì)胞中，培養(yǎng)2 h，然后在450 nm處測量吸光度。實驗重復(fù)三次。

1.3 細(xì)胞遷移評估 采用劃痕實驗評價胃癌細(xì)胞遷移能力。收集二甲雙胍(0、10、20、40 mmol/L)處理后的胃癌細(xì)胞并重新植入6孔板中。讓細(xì)胞在37℃下生長，直到100%融合，然后用移液管在細(xì)胞層上小心地劃出一道劃痕。在劃痕后0、24 h分別對細(xì)胞生長狀況進(jìn)行顯微鏡拍照。

1.4 Western blot檢測蛋白水平 不同濃度二甲雙胍(10、20、40 mmol/L)處理后的胃癌細(xì)胞PBS清洗2～3次，冰上用RIPA進(jìn)行裂解得到總蛋白。處理后的胃癌細(xì)胞在RIPA緩沖液中裂解后得到總蛋白。用蛋白濃度監(jiān)測儀imagequantlas Q5000(美國夸威爾)測定提取總蛋白的濃度。將相同量的蛋白質(zhì)煮沸，用SDS-PAGE方法溶解，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1 h，然后用TBST清洗3次，用一級抗體(1:1000)在4℃下培養(yǎng)過夜。在我們的研究中，免疫印跡用以下抗體進(jìn)行：E-cadherin(英國abcam，1:1000)、vimentin(英國abcam，1:1000)、GAPDH(abcam，英國，1:1000)。然后用TBST清洗PVDF膜3次，共30 min，辣根過氧化物酶結(jié)合的二級抗體(1:2000)孵育1 h。用TBST清洗三次，每次10 min。用imagequantlas500(美國通用電氣公司)對薄膜進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測，并用NIH-Image-J軟件測量其條帶密度。

2 結(jié)果

2.1 二甲雙胍抑制胃癌細(xì)胞增殖活性 倒置顯微鏡拍照顯示，二甲雙胍可以抑制胃癌細(xì)胞的密度逐漸降低，且呈濃度依賴性(P<0.0001)，見圖1、表1。CCK8檢測細(xì)胞增殖活性結(jié)果顯示，與對照組比較，二甲雙胍處理組隨濃度增加增殖水平顯著降低，呈濃度依賴(F=27.22，P<0.0001)，見圖2。

圖2 不同濃度二甲雙胍對胃癌細(xì)胞增殖的影響Figure 2 The effect of different concentrations of metformin on proliferation in gastric cancer cells注：與對照組相比，①P<0.05

表1 二甲雙胍對胃癌細(xì)胞增殖的影響Table 1 Effect of metformin on proliferation of gastric cancer cells

圖1 不同濃度二甲雙胍對胃癌細(xì)胞增殖的影響Figure 1 The effect of different concentrations of metformin on proliferation in gastric cancer cells

2.2 二甲雙胍抑制胃癌細(xì)胞的遷移 使用不同濃度(10、20、40 mmol/L)的二甲雙胍溶液處理胃癌細(xì)胞，結(jié)果顯示：二甲雙胍處理的胃癌細(xì)胞的遷移顯著減慢，且呈濃度依賴性，濃度越大胃癌細(xì)胞的遷移越慢(P<0.0001)，見圖3。

圖3 不同濃度二甲雙胍對胃癌細(xì)胞遷移的影響Figure 3 The effect of different concentrations of metformin on the migration of gastric cancer cells注：與對照組相比，①P<0.05

2.3 二甲雙胍抑制胃癌細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換 檢測不同濃度二甲雙胍處理胃癌細(xì)胞時，胃癌細(xì)胞的E-cadherin和vimentin蛋白表達(dá)情況結(jié)果顯示，二甲雙胍處理胃癌細(xì)胞，顯著降低vimentin蛋白水平，增加E-cadherin蛋白的表達(dá)水平，均呈濃度依賴性(均P<0.01)，見圖4。提示二甲雙胍可以抑制胃癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換，對胃癌的進(jìn)程可能有一定的抑制作用。

圖4 不同濃度二甲雙胍對胃癌細(xì)胞E-cadherin和vimentin蛋白表達(dá)的影響 Figure 4 The effect of different concentrations of metformin on the expression of E-cadherin and vimentin proteins in gastric cancer cells注：與對照組相比，①P<0.05

3 討論

在全世界范圍內(nèi)胃癌是一種致命的疾病，生存率很低，每年新診斷的胃癌主要發(fā)生在亞洲和南美國家[8]。在美國，至2020年有27000個新病例出現(xiàn)[9]。在發(fā)展中國家，胃癌對人口的影響要嚴(yán)重得多。然而，進(jìn)展期和轉(zhuǎn)移性胃癌的生存率非常低，攻克這項疾病還很困難。

二甲雙胍作為2型糖尿病的降糖藥物已經(jīng)使用了很長時間，可以作為單一療法或與其他降糖尿藥物聯(lián)合使用[10]。1995年英國進(jìn)行的一項具有里程碑意義的前瞻性糖尿病研究(UKPDS)證實了二甲雙胍對心血管系統(tǒng)的長期益處[11]。近期，二甲雙胍已用于各個方面的實驗性研究，如生殖醫(yī)學(xué)、腫瘤化療、代謝性疾病和神經(jīng)退行性疾病。評估二甲雙胍在腫瘤治療中的相關(guān)性研究，關(guān)于其抗腫瘤作用，人們提出了不同的機(jī)制，包括激活單磷酸腺苷激酶、調(diào)節(jié)腺苷A1受體、減少胰島素/胰島素生長因子，以及二甲雙胍在抑制內(nèi)源性活性氧中的作用，此外其對DNA分子的損傷是另一個重要的抗腫瘤機(jī)制。關(guān)于鹽酸二甲雙胍抗腫瘤的研究[12]表明，二甲雙胍一定程度上能夠抑制肺癌、乳腺癌及消化系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。本研究證實二甲雙胍可能降低胃癌中胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力。

上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)在包括胃癌在內(nèi)的腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。在EMT過程中，上皮細(xì)胞的各種生化變化會導(dǎo)致細(xì)胞極性和遷移能力的喪失，從而導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)的改變，促使靜止的上皮細(xì)胞向運(yùn)動的間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，最終加強(qiáng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[13]。據(jù)報道，EMT可導(dǎo)致多種腫瘤的病理遷移和侵襲，其誘發(fā)的癌變是胃癌、頸部鱗狀細(xì)胞癌和卵巢癌等惡性腫瘤的常見原因[14]。EMT是胚胎發(fā)育和器官發(fā)生過程中細(xì)胞重塑的關(guān)鍵過程，參與了腫瘤的發(fā)生，并通過增強(qiáng)侵襲性和移動性賦予癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移特性[15-16]。研究[17]發(fā)現(xiàn)，促進(jìn)EMT過程的分子機(jī)制包括調(diào)節(jié)特定細(xì)胞表面蛋白水平、細(xì)胞外基質(zhì)降解酶和改變某些轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。我們檢測了與EMT密切相關(guān)的生物標(biāo)記物E-cadherin和vimentin的表達(dá)水平，結(jié)果顯示二甲雙胍可以顯著降低胃癌細(xì)胞中E-cadherin和vimentin蛋白水平，且呈濃度依賴性。近年來，有研究[18]表明大蒜素與IL-33均能抑制胃癌細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞的侵襲與遷移?；谝陨辖Y(jié)果，我們認(rèn)為二甲雙胍可能通過誘導(dǎo)EMT促進(jìn)胃癌的侵襲和遷移。

研究[19]發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)能降解上皮細(xì)胞重要標(biāo)志物E-cadherin。EMT的延長與MMP-2活性和MMP-9分泌水平有關(guān)，MMPs能夠通過PI3K/AKT通路影響E-cadherin表達(dá)調(diào)節(jié)在包括胃癌在內(nèi)的多種腫瘤中對EMT的作用[20]。此外，據(jù)報道，Wnt/β-catenin信號通路在EMT中起著重要作用。在EMT過程中，E-cadherin的丟失可能會異常激活Wnt/β-catenin信號通路，然后抑制β-catenin的降解，進(jìn)入細(xì)胞核促進(jìn)Myc等下游靶基因的表達(dá)，最終促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移[21]。這與我們的研究結(jié)果一致，E-cadherin和vimentin的表達(dá)抑制影響了胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

4 結(jié)論

本研究表明，二甲雙胍能夠抑制GC細(xì)胞增殖、遷移，其在胃癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮抑制作用，可能與抑制EMT相關(guān)，具體的作用通路還需進(jìn)一步探索。