張麗莎 熊挺淋 應(yīng)夢慧 楊燕 張曉剛

(1.南充市中心醫(yī)院·川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院，四川 南充 637000；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院，四川 成都 610000；3.四川馳鼎盛通生物科技有限公司，四川 成都 610041；4.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，重慶 400016)

心肌梗死是一種全球性的高發(fā)病率和死亡率的疾病[1]，心肌梗死期間心肌細(xì)胞的永久丟失有助于進(jìn)行性病理性的左心室重構(gòu)，最終導(dǎo)致心力衰竭。利用胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞及其心臟衍生物的細(xì)胞療法已被提出作為改善心肌梗死后心功能的有效治療方法。胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞是一種多潛能性干細(xì)胞，能夠產(chǎn)生足夠數(shù)量的功能心肌細(xì)胞，以實現(xiàn)“真正的”心臟再生。與胚胎干細(xì)胞不同，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞是由個體自身的體細(xì)胞產(chǎn)生的，因此，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分離具有較少的倫理問題，移植后不存在免疫抑制，且誘導(dǎo)多能干細(xì)胞還可以克服胚胎干細(xì)胞在心臟再生方面的一些局限性。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在體內(nèi)和體外都可以分化為有功能的心肌細(xì)胞[2-3]。一些研究[4-6]報道了使用這些誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來源的心肌細(xì)胞在動物心肌梗死模型中移植后心臟再生的功能益處，移植后分化心肌細(xì)胞能夠與宿主心肌整合，改善左室功能。然而，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化研究仍處于初級階段，這些細(xì)胞改善心臟功能的機(jī)制尚不清楚。本文研究誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞對大鼠心肌梗死模型心肌修復(fù)的效果，希望闡明其改善心功能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與細(xì)胞 SPF級SD大鼠(不分雌雄)由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。綠色熒光蛋白(GFP)轉(zhuǎn)染的小鼠誘導(dǎo)多能干細(xì)胞購自中國科學(xué)院動物研究所北京干細(xì)胞庫。本實驗遵循南充市中心醫(yī)院倫理委員會制定的相關(guān)規(guī)定(倫理審批號:2020年審(148)號)。

1.2 實驗試劑與儀器 DMEM高糖培養(yǎng)基購自Gibco公司，β-巰基乙醇、L-谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、10%胎牛血清、胰蛋白酶和水合氯醛均購自Hyclone公司，DAPI、牛血清白蛋白、多聚甲醛、Masson三色染色試劑盒均購自Sigma公司，多克隆抗血管假性血友病因子抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗、單克隆cTnT抗體及Tritc標(biāo)記的IgG熒光二抗均購自Santa cruz公司，絲裂霉素C和白血病抑制因子(LIF)購自上海欣百諾公司，免疫組化試劑盒購自中杉金橋公司，Gold view和Triton X-100購自Genview公司，簡易呼吸機(jī)由重慶醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)病學(xué)重點實驗室提供，BL-420多導(dǎo)電生理儀及生物機(jī)能實驗系統(tǒng)為成都泰盟科技有限公司生產(chǎn)，超聲心動圖由飛利浦公司提供(CX50)，PowerLab系統(tǒng)由AD Instruments Inc.公司提供，Millar微型壓力導(dǎo)管購自上海玉研科學(xué)儀器有限公司，RNAiso Plus逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司，S1000TmThermal cycler逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)由BIO-RAD公司提供。

1.3 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞培養(yǎng) 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞復(fù)蘇后接種在提前經(jīng)絲裂霉素C處理過的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞上[7]，培養(yǎng)基為DMEM高糖，包含10% FBS、1000 IU/mL LIF、0.1 mmoL/Lβ-巰基乙醇、0.1 mmoL/L L-谷氨酰胺、1%非必需氨基酸，1～2 d換培養(yǎng)基一次；用0.05%胰酶消化傳代，細(xì)胞重懸液接種在新的不含小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)板里，30 min后吸取上清液，并接種到新的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上，傳代后的部分細(xì)胞保存于液氮中備用。細(xì)胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)。

1.4 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞 取對數(shù)生長期的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，0.05%胰酶消化并分別制成單細(xì)胞懸液，心肌細(xì)胞的分化方法參照文獻(xiàn)[1]進(jìn)行，將搏動的擬胚體制成單細(xì)胞懸液，使用差異貼壁法分離心肌細(xì)胞，分化心肌細(xì)胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)。

1.5 大鼠心肌梗死模型建立和細(xì)胞移植 水合氯醛腹腔麻醉成年SD大鼠，氣管插管后通過簡易呼吸機(jī)輔助通氣。胸骨左緣剪斷肋骨，進(jìn)入胸腔，鈍性分離心包并剪開，體式鏡下用結(jié)扎線結(jié)扎左前降支(LAD)10 min，BL-420多導(dǎo)電生理儀及生物機(jī)能實驗系統(tǒng)記錄心電圖。建模成功的心肌梗死SD大鼠隨機(jī)分為心肌梗死組和細(xì)胞移植兩組，對照組行開胸手術(shù)，不結(jié)扎冠狀動脈，每組10只。心肌梗死組和細(xì)胞移植組分別在心肌梗死邊界附近的3個點注射30 μL的生理鹽水和分化心肌細(xì)胞。細(xì)胞移植成功后，逐層縫合胸腔及皮膚，待小鼠恢復(fù)自主呼吸后，扯去簡易呼吸機(jī)，術(shù)后給予實驗大鼠肌肉注射青霉素以預(yù)防感染。

1.6 超聲心電圖評價心功能 在實驗前及細(xì)胞移植后第7、14和28天使用飛利浦CX50超聲儀進(jìn)行超聲心動圖檢查評估左室功能。標(biāo)準(zhǔn)的M型超聲測量LVEDD、LVESD、LVPW和IVS，并用Simpson法計算LVEF。所有心臟超聲檢查由同一名檢查者完成。

1.7 心臟有創(chuàng)血流動力學(xué)評估 有創(chuàng)血流動力學(xué)檢查前按照之前的方法對大鼠進(jìn)行腹腔麻醉和機(jī)械通氣，將1.4F的Millar微型壓力導(dǎo)管經(jīng)股動脈送入左室，并連接壓力傳感器，使用PowerLab系統(tǒng)記錄血流動力學(xué)參數(shù)，包括±dP/dt、LVEDP。

1.8 RT-PCR檢測各組MMP-3、PAI-1和IL-6 mRNA的表達(dá)水平 4周后取出大鼠心臟，使用Trizol提取組織的總RNA，RNAiso Plus逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以及S1000TmThermal cycler逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)用來合成CDNA。PCR過程使用25 μL擴(kuò)增體系，條件：94℃變性30 s、退火30 s、72℃延伸30 s，循環(huán)30次。內(nèi)參(β-actin)及目的基因的引物序列和退火溫度見表1。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖做凝膠電泳分離條帶，然后用Gold view顯色，結(jié)果采用quantity one凝膠電泳儀進(jìn)行圖像分析和數(shù)據(jù)處理。

表1 RT-PCR引物序列Table 1 RT-PCR primer sequence

1.9 梗死面積的檢測 采用Masson三色染色試劑盒染色分析梗死面積的大小，正常心肌組織顯示為紅色，壞死心肌組織顯示為藍(lán)色。28天時取出大鼠心臟，用10%福爾馬林固定，石蠟包埋，然后將石蠟塊切成5 μm切片，石蠟切片脫蠟水化步驟：二甲苯30 min、無水乙醇20 min、95%酒精5 min、90%酒精5 min、80%酒精5 min、70%酒精5 min，PBS沖洗，Masson試劑盒內(nèi)鐵蘇木素染色5 min，PBS沖洗，酸性乙醇分化10 s，PBS沖洗后用Masson返藍(lán)液返藍(lán)3 min，PBS沖洗，Masson麗春紅品紅染色10 min，PBS沖洗，Masson磷鉬酸作用5 min，再用Masson苯胺藍(lán)復(fù)染5 min，1%冰醋酸作用1 min，再次脫水并封片，最后顯微鏡下觀察和圖像采集。

1.10 免疫組化 采用SP法中杉金橋公司免疫組化試劑盒進(jìn)行染色操作。28天時取出大鼠心臟，用10%福爾馬林固定，石蠟包埋，然后切片，石蠟切片脫蠟水化步驟：二甲苯30 min、無水乙醇20 min、95%酒精5 min、90%酒精5 min、80%酒精5 min、70%酒精5 min，PBS沖洗，3%H2O2中孵育10 min，PBS沖洗，0.01 M枸櫞酸緩沖液中95℃煮沸15 min，冷卻后PBS沖洗，血清液封閉20 min后甩去封閉液，加入兔多克隆抗血管假性血友病因子抗體(1:100)，室溫下作用1 h，PBS沖洗后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1:100)，室溫下作用1 h，PBS沖洗，加入鏈霉親和素過氧化物酶，室溫下作用30 min，PBS沖洗，DAB顯色5 min，PBS沖洗10 min，蘇木精復(fù)染2 min，酸性乙醇分化10 s，PBS沖洗，再次脫水并封片，最后顯微鏡下觀察和圖像采集。

1.11 細(xì)胞免疫熒光 培養(yǎng)在載玻片上的細(xì)胞收獲時用PBS洗滌3次，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定30 min，0.1% Triton X-100穿孔10 min，PBS洗3次，然后加入1%的牛血清白蛋白封閉30 min后，甩掉封閉液，用PBS稀釋的單克隆一抗(1:100)，37℃條件下作用2 h，PBS洗3次，再用PBS稀釋的Tritc標(biāo)記的IgG熒光二抗(1:100)，37℃條件下作用2 h，PBS洗3次，最后用DAPI染細(xì)胞核，抗淬滅劑封片以及用熒光顯微鏡照相。

2 結(jié)果

2.1 分化心肌細(xì)胞特征及鑒定 體外自然分化情況下，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞形成搏動的擬胚體，搏動的頻率20～40次/min，分離培養(yǎng)分化心肌細(xì)胞，呈現(xiàn)出多邊形、不規(guī)則形等普通心肌細(xì)胞形態(tài)，見圖1A。細(xì)胞免疫熒光鑒定提示分化心肌細(xì)胞中心肌特異性cTnT表達(dá)陽性(紅色)，細(xì)胞核用DAPI染色(藍(lán)色)，見圖1B。

圖1 分化心肌細(xì)胞鑒定(200×)Figure 1 Identification of differentiated cardiomyocytes注：A.分化心肌細(xì)胞形態(tài)；B.分化心肌細(xì)胞中cTnT表達(dá)陽性(紅色)

2.2 心肌梗死建模成功判定 前降支結(jié)扎后，心肌梗死模型成功的標(biāo)志為結(jié)扎處遠(yuǎn)端心肌組織變蒼白，體表心電圖提示ST段抬高大于0.05 mV，見圖2。心肌梗死組和細(xì)胞移植組大鼠死亡率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，最終每組10只大鼠完成實驗。

圖2 心肌梗死模型心電圖Figure 2 ECG of myocardial infarction model注：A.正常心電圖；B.心肌梗死心電圖

2.3 3組細(xì)胞移植后心功能比較 在細(xì)胞移植后第7、14和28天時通過心臟彩超和有創(chuàng)血流動力檢查測量各組的心臟功能。第28天時，細(xì)胞移植組的LVEF較心肌梗死組明顯升高，LVESD和LVEDD顯著小于心肌梗死組，LVEDP明顯低于心肌梗死組，±dP/dt較心肌梗死組明顯改善，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。在第7和14天時，細(xì)胞移植組和心肌梗死組之間的LVEF、LVESD、LVEDD、LVEDP和±dP/dt差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。3組LVPW和IVS比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖3和表2。

圖3 LVEF比較Figure 3 Comparison of LVEF

表2 28天時各組心功能比較Table 2 Comparison of cardiac function of each group at 28 days

2.4 3組MMP-3、PAI-1和IL-6 mRNA水平比較 RT-PCR結(jié)果顯示，與對照組相比，心肌梗死組大鼠的MMP-3、PAI-1和IL-6 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高(P<0.05)，而細(xì)胞移植組大鼠的以上衰老基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平無明顯改變(P>0.05)。見圖4。

圖4 RT-PCR評估衰老指標(biāo)Figure 4 Assessment of aging indicators by RT-PCR注：與對照組比較，①P<0.05，②P>0.05

2.5 3組梗死面積的染色結(jié)果比較 第28天時，細(xì)胞移植組的梗死面積(2.29±0.38)mm2明顯小于心肌梗死組(1.36±0.21)mm2，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖5。

圖5 梗死面積比較(400×)Figure 5 Comparison of infarct size注：A.對照組；B.細(xì)胞移植組；C.心肌梗死組

2.6 3組梗死邊緣區(qū)毛細(xì)血管密度結(jié)果 28天時，抗血管假性血友病因子免疫組化染色結(jié)果顯示，毛細(xì)血管顯示為深棕色。細(xì)胞移植組梗死邊緣區(qū)的毛細(xì)血管密度(142.70±21.24)/mm2明顯高于心肌梗死組(66.52±11.85)/mm2，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖6。

圖6 免疫組化檢測毛細(xì)血管密度(400×)Figure 6 Detection of capillary density by Immunohistochemical注：A.對照組；B.細(xì)胞移植組；C.心肌梗死組

3 討論

目前主要有兩種類型的干細(xì)胞具有心臟再生的潛力，一種是成體干細(xì)胞，另一種是胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的多潛能干細(xì)胞，但是這兩種干細(xì)胞移植到宿主心臟后都存在畸胎瘤形成和異位分化的風(fēng)險[8-10]。為了解決這個問題，分化細(xì)胞，如干細(xì)胞分化來源的心肌細(xì)胞，是干細(xì)胞移植治療的首選。最近的基礎(chǔ)研究和臨床研究[11-14]表明，人類胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞衍生的心肌細(xì)胞對左室重構(gòu)具有重大治療意義。此外，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞是由自體體細(xì)胞逆分化為干細(xì)胞，而后再產(chǎn)生的自體細(xì)胞，因此與胚胎干細(xì)胞等相比，在移植治療上解決了倫理和免疫排斥問題。然而到目前為止，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞改善心臟功能的機(jī)制尚不清楚。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)分化心肌細(xì)胞移植后通過減小衰老指標(biāo)的表達(dá)以及增加心肌梗死區(qū)域毛細(xì)血管密度等可以改善心肌梗死后大鼠心功能。這種作用與血管生成有關(guān)，并抑制了局部缺血心肌組織中天然心肌細(xì)胞的凋亡，表明心功能改善的機(jī)制是由旁分泌作用介導(dǎo)的，對基于誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的分化心肌細(xì)胞移植療法具有重要的臨床意義[15-16]。

本研究將分化心肌細(xì)胞在心肌梗死后直接注入心肌組織中，細(xì)胞移植4周后，細(xì)胞移植組代表左室心功能的LVEF、LVESD、LVEDD、LVEDP和±dP/dt指標(biāo)較心肌梗死組均得到明顯改善，梗死面積明顯縮小，與之前的報道結(jié)果[17-18]相似。分化心肌細(xì)胞體外搏動頻率僅為20～40次/min，因此移植細(xì)胞不太可能直接促進(jìn)心臟功能的改善。細(xì)胞移植4周后，梗死心臟組織周圍的毛細(xì)血管密度明顯增加，可間接證明移植細(xì)胞通過旁分泌作用促進(jìn)血管生成并維持周圍天然心肌細(xì)胞的存活率，最終促進(jìn)心功能的改善。此外，在整個實驗期間我們無在心臟任何區(qū)域觀察到畸胎瘤。

分化心肌細(xì)胞移植治療改善心臟功能的具體機(jī)制尚不清楚，最初的希望是這些移植細(xì)胞可以直接促進(jìn)心臟功能的恢復(fù)。最近的研究[15，19]表明，改善心臟功能的作用大多是通過間接作用，包括旁分泌、調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞凋亡，這與本研究的結(jié)果非常相似。分化細(xì)胞移植后的低存活率也是需要進(jìn)一步解決的問題[20]。最近一項利用人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的分化心肌細(xì)胞在豬急性心肌梗死模型的移植治療研究[21]中表明，在細(xì)胞移植后8周，熒光原位雜交僅檢測到少量分化心肌細(xì)胞，提示移植細(xì)胞的長期生存率較低。這種分化心肌細(xì)胞的低存活率可能是移植后同種異體免疫排斥的結(jié)果。作為直接細(xì)胞替代的替代方法，來源于誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的分化心肌細(xì)胞釋放的外泌體代表了一種新型的基于誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的心肌再生治療[22]。在直接移植分化心肌細(xì)胞缺乏足夠細(xì)胞存活情況下，間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的外泌體在移植后可以促進(jìn)更長的移植體生存期并增強(qiáng)移植細(xì)胞的治療效果[23]。因此誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的分化心肌細(xì)胞分泌的外泌體在心臟再生中的有益作用是未來值得深入研究的方向。

盡管誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)和細(xì)胞治療領(lǐng)域有著巨大的潛力，但在其臨床應(yīng)用之前仍有幾個主要為問題需要解決。首先，使用病毒載體產(chǎn)生的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞可能導(dǎo)致基因突變或者惡性轉(zhuǎn)化。目前已有研究表明不需要任何基因修飾就能重編程誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法，并獲得高純度的分化心肌細(xì)胞，這些方法包括小分子或者無病毒方法。其次，安全性評估，包括移植后心律失常和腫瘤等的發(fā)生情況是細(xì)胞治療的重要研究方向。目前的研究主要集中在心臟分化上，而對分化心肌細(xì)胞與宿主心肌細(xì)胞表型是否一致，以及分化心肌細(xì)胞成熟度方面研究甚少。分化心肌細(xì)胞的不成熟電表型可能導(dǎo)致心律失常，在以往的胚胎干細(xì)胞分化心肌細(xì)胞中已報道有心律失常的情況出現(xiàn)[11，24]。與成熟的心肌細(xì)胞相比，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞也表現(xiàn)出不成熟的電生理特點[25-26]，然而在受損的心臟組織中移植入誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞后發(fā)生心律失常的風(fēng)險尚未見報道。因此未來的研究需要在體外鑒定分化心肌細(xì)胞的成熟度。

4 結(jié)論與啟示

本研究結(jié)果表明，在大鼠心肌梗死模型中，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞移植治療可以通過旁分泌作用減小梗死面積及增加梗死區(qū)域毛細(xì)血管的密度，從而改善心功能。但如何提高分化心肌細(xì)胞成熟度、如何提高移植效率、移植細(xì)胞長期存活率和移植后對宿主心臟電活動的影響需以后進(jìn)一步研究。