陳景森，熊志毅，李 歡，張文夏，王恩禮

南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳婦幼保健院乳腺科，廣東深圳 518017

乳腺癌是威脅女性健康的主要惡性腫瘤，且大多為激素敏感型。RNA結(jié)合蛋白(RBP)為重要基因調(diào)控蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，RBP在乳腺癌細(xì)胞增殖等生物學(xué)活動(dòng)中發(fā)揮重要作用[1]。不含POU結(jié)構(gòu)域的八聚體核苷酸結(jié)合蛋白(NONO)為近年新發(fā)現(xiàn)的多功能RBP[2]。但NONO在乳腺癌中的確切作用尚未完全明確。S期激酶相關(guān)蛋白2(SKP2)和E2F轉(zhuǎn)錄因子8(E2F8)為與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因[3-4]。其中SKP2還可通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑，參與調(diào)控細(xì)胞周期[5]。本研究旨在探討三者在乳腺癌中的表達(dá)，以及沉默NONO是否可通過(guò)影響SKP2和E2F8的表達(dá)調(diào)控乳腺癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年6月至2020年6月于本院接受根治術(shù)治療乳腺癌患者的乳腺癌組織及癌旁組織石蠟塊各43例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)手術(shù)病理證實(shí)為浸潤(rùn)性非特殊乳腺癌[6]；(2)性別為女性；(3)年齡18～80歲；(4)組織學(xué)分級(jí)為Ⅰ～Ⅲ級(jí)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)前接受過(guò)放、化療等其他抗腫瘤治療；(2)合并嚴(yán)重肝腎功能不全，或存在其他系統(tǒng)惡性腫瘤等。

1.2試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)基、F12培養(yǎng)基均購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司；PBS緩沖液、胰蛋白酶、RIPA液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、TBST溶液、EDTA溶液、DAB顯色試劑盒、蘇木素、總RNA提取試劑盒、通用反轉(zhuǎn)錄試劑盒、CCK-8試劑盒均購(gòu)自北京索萊寶生物技術(shù)有限公司；兔抗人NONO/p54nrb抗體、兔抗人SKP2抗體、兔抗人E2F8抗體、兔抗人β-actin抗體、HRP標(biāo)記二抗均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；熒光定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾公司；碘化丙啶染色試劑盒(貨號(hào)KGA214)購(gòu)自上海元象醫(yī)療器械有限公司。實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀(美國(guó)賽默飛世爾公司，QuantStudio3型)、酶標(biāo)儀(美國(guó)賽默飛世爾公司，Multiskan FC型)、流式細(xì)胞分析儀(美國(guó)賽默飛世爾公司，Invitrogen Attune NxT型)。

1.3方法

1.3.1免疫組化SP染色 取石蠟切片，依次進(jìn)行脫蠟、水化處理，滴加EDTA溶液進(jìn)行抗原修復(fù)，血清封閉，加入一抗4 ℃過(guò)夜，加入二抗室溫孵育2 h，DAB顯色，滴加蘇木素復(fù)染，依次進(jìn)行脫水、透明處理，中性樹(shù)膠封片，全自動(dòng)免疫組化染色儀分析染色結(jié)果。NONO、SKP2和E2F8蛋白陽(yáng)性信號(hào)為棕黃色或棕褐色顆粒，主要定位于細(xì)胞核；根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比和染色強(qiáng)度乘積進(jìn)行半定量分析，在顯微鏡下每張切片選擇5個(gè)視野(400倍)，每個(gè)視野納入100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算平均陽(yáng)性率和染色強(qiáng)度。陽(yáng)性率：0～5%計(jì)0分；>5%～25%計(jì)1分；>25%～50%計(jì)2分；>50%～100%計(jì)3分。染色強(qiáng)度：未著色0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。然后將陽(yáng)性率積分與染色強(qiáng)度積分乘積的分值作為蛋白表達(dá)積分，蛋白表達(dá)積分≥3分為陽(yáng)性。

1.3.2細(xì)胞培養(yǎng) 選用MCF-7細(xì)胞(購(gòu)自北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司)置于含10%胎牛血清的新鮮DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)2～3 d，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2。隨后吸出原培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基，PBS緩沖液潤(rùn)洗細(xì)胞2次，滴加0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，顯微鏡下觀察消化情況，待貼壁松動(dòng)、細(xì)胞變圓后加入完全培養(yǎng)基終止反應(yīng)，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.3.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 sh-NONO序列正義鏈5′-GGCGAAGUCUUCAUCCAUAGG-3′，sh-NC序列正義鏈5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUUUC-3′，由上海吉?jiǎng)P基因技術(shù)公司合成。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，分為MCF-7組(無(wú)特殊處理)、sh-NC-MCF-7組(加入攜帶sh-NC序列正義鏈的慢病毒LV3液)和sh-NONO-MCF-7組(加入攜帶sh-NONO序列正義鏈的慢病毒LV3液)，培養(yǎng)24 h后棄去舊培養(yǎng)液，加入含嘌呤霉素和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基與F12培養(yǎng)基混合液(1∶1)后繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.4Western blot檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于6孔板內(nèi)，待融合度達(dá)80%時(shí)，RIPA液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法定量分析；配置聚丙烯酰胺凝膠電泳液，電泳結(jié)束后將樣品轉(zhuǎn)移至PVDF膜，滴加含5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉1 h，PBS緩沖液沖洗(3×5 min)，分別滴加1∶1 000稀釋的兔抗人NONO/p54nrb抗體、兔抗人SKP2抗體、兔抗人E2F8抗體，以兔抗人β-actin抗體為內(nèi)參，4 ℃孵育過(guò)夜；PBS緩沖液沖洗(3×5 min)，滴加HRP標(biāo)記二抗，室溫孵育1 h，Image ProPlus軟件對(duì)條帶進(jìn)行定量分析，每組重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.3.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，后反轉(zhuǎn)錄為cDNA。設(shè)計(jì)引物序列：SKP2上游引物5′-ATTGTCCGCAGCGTAAGCTA-3′，下游引物5′-TGCCATAGAGACTCATCAGAGCG-3′；E2F8上游引物5′-CCAACCCTGCTCGGAATA-3′，下游引物5′-TTTCTGGCTCATTACCT-3′；β-actin為內(nèi)參，上游引物5′-AATCGTGCGTGACTAATTGGAG-3′，下游引物5′-ACTGTGTTGGCGTACAGGTCTT-3′。按照熒光定量試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，采用qPCR儀檢測(cè)目的基因Ct值，以2-ΔΔCt法計(jì)算各基因相對(duì)表達(dá)量，每組重復(fù)3次檢測(cè)。

1.3.6細(xì)胞增殖檢測(cè) 采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖水平。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于96孔板內(nèi)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×103個(gè)/孔，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)450 nm處光吸光度(A)，A值越大表明細(xì)胞數(shù)量越多，增殖能力越強(qiáng)，每組重復(fù)3次。

1.3.7細(xì)胞周期檢測(cè) 采用碘化丙啶染色法檢測(cè)細(xì)胞周期。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，胰蛋白酶消化細(xì)胞后，3 000 r/min離心收集細(xì)胞，PBS緩沖液沖洗(3×5 min)，棄上清，70%乙醇重懸細(xì)胞，4 ℃過(guò)夜；PBS緩沖液沖洗(3×5 min)；按照碘化丙啶染色試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

2 結(jié) 果

2.1乳腺癌組織及癌旁組織中NONO、SKP2和E2F8表達(dá) 乳腺癌組織中NONO、SKP2和E2F8陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于癌旁組織(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 乳腺癌組織及癌旁組織中NONO、SKP2和E2F8的表達(dá)情況[n(%)]

2.2NONO沉默效率檢測(cè) MCF-7組、sh-NC-MCF-7組和sh-NONO-MCF-7組細(xì)胞NONO蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.71±0.22、0.72±0.21、0.12±0.04。與MCF-7和sh-NC-MCF-7組比較，sh-NONO-MC-7組細(xì)胞NONO蛋白相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.05)，提示成功構(gòu)建NONO沉默MCF-7細(xì)胞株。見(jiàn)圖1。

圖1 NONO沉默效果檢測(cè)

2.3沉默NONO對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖能力的影響 與MCF-7和sh-NC-MCF-7組細(xì)胞比較，sh-NONO-MCF-7組細(xì)胞增殖能力降低(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

圖2 沉默NONO對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖能力的影響(CCK-8法)

2.4沉默NONO對(duì)乳腺癌細(xì)胞周期的影響 與MCF-7和sh-NC-MCF-7組細(xì)胞比較，sh-NONO-MCF-7組G0/G1期細(xì)胞比例顯著增加，S期和G2/M期細(xì)胞比例顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

圖3 沉默NONO對(duì)乳腺癌細(xì)胞周期的影響

2.5沉默NONO對(duì)乳腺癌細(xì)胞SKP2和E2F8表達(dá)的影響 Western blot檢測(cè)顯示，與MCF-7和sh-NC-MCF-7組比較，sh-NONO-MCF-7組SKP2和E2F8蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)；qPCR檢測(cè)顯示，與MCF-7和sh-NC-MCF-7組比較，sh-NONO-MCF-7組SKP2和E2F8 mRNA相對(duì)表達(dá)水平降低(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

注：A圖中的1為MCF-7組，2為sh-NC-MCF-7組，3為sh-NONO-MCF-7組；A為Western blot檢測(cè)圖；B為qPCR檢測(cè)結(jié)果。

3 討 論

近年乳腺癌總生存率和無(wú)病生存率均呈現(xiàn)出顯著上升趨勢(shì)，但仍有一部分患者預(yù)后較差[7]。惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中存在RNA動(dòng)態(tài)失衡[8]。RBP是一類(lèi)RNA代謝過(guò)程中的重要調(diào)控蛋白質(zhì)分子。既往研究表明，癌組織中RBP相對(duì)于癌旁組織異常表達(dá)，且與預(yù)后密切相關(guān)[9]。NONO是RBP重要成員之一。HU等[10]研究發(fā)現(xiàn)，NONO水平在肝細(xì)胞癌患者中異常上調(diào)，并與不良預(yù)后有關(guān)，基因敲除NONO后，肝癌細(xì)胞增殖、遷移受到顯著抑制。另有研究發(fā)現(xiàn)，NONO可參與非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞泛素化，進(jìn)而影響細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[11]。因此，猜測(cè)NONO有可能通過(guò)泛素化等途徑影響乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)活動(dòng)。SKP2為近年發(fā)現(xiàn)的可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)展和細(xì)胞增殖的癌蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)SKP2可誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，同時(shí)有效抑制乳腺癌細(xì)胞增殖[12]。E2F8為E2F家族重要成員。研究發(fā)現(xiàn)，E2F8在乳腺癌組織中的表達(dá)顯著上調(diào)，其水平升高與患者總體生存率和無(wú)復(fù)發(fā)生存率顯著相關(guān)[13]。邢振義等[14]研究發(fā)現(xiàn)，E2F8在膠質(zhì)瘤中存在顯著高表達(dá)現(xiàn)象，可促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖。

本研究中，乳腺癌組織中NONO、SKP2和E2F8陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于癌旁組織，符合以往研究結(jié)果[12，15]，表明NONO、SKP2和E2F8表達(dá)上調(diào)可能參與了乳腺癌發(fā)生或發(fā)展。轉(zhuǎn)染sh-NONO至MCF-7細(xì)胞后，細(xì)胞NONO蛋白表達(dá)量顯著降低，提示成功構(gòu)建NONO沉默MCF-7細(xì)胞株。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染sh-NONO后細(xì)胞增殖能力顯著降低，G0/G1期細(xì)胞比例顯著增加，S期和G2/M期細(xì)胞比例顯著降低，提示NONO基因敲除可顯著抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，NONO有可能成為乳腺癌治療的新靶點(diǎn)。為闡明其作用機(jī)制，本研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是蛋白還是mRNA，轉(zhuǎn)染sh-NONO后細(xì)胞SKP2和E2F8表達(dá)均顯著降低，表明沉默NONO可能是通過(guò)下調(diào)SKP2和E2F8達(dá)到以上抗腫瘤作用的。

綜上所述，沉默NONO表達(dá)可通過(guò)下調(diào)SKP2和E2F8表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，從而抑制乳腺癌細(xì)胞增殖。