苗佳穎，陸偉

（復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院，上海 201203）

疫苗能為接種后的個體建立較為持久的免疫保護(hù)，它徹底消滅了天花和牛瘟，有效控制了非典型性肺炎、禽流感等死亡率高、又無特效治療藥物的傳染病，并逐漸成為腫瘤、代謝性疾病等慢性病最具潛力的防治手段。疫苗成本較低，適合大規(guī)模接種，為延長人類平均壽命做出了重大貢獻(xiàn)[1]。

傳統(tǒng)疫苗包括減毒疫苗、滅活疫苗以及亞單位疫苗，這類疫苗維持了病原體的性狀和病原體表面蛋白，能有效地誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生，但存在毒力恢復(fù)或滅活不完全的潛在安全問題。隨著疫苗研究的不斷深入，通過DNA重組技術(shù)制成的基因工程疫苗以其易于取材的便捷性和進(jìn)一步提升的安全性、有效性而受到青睞，然而其相對較弱的免疫原性仍是一個有待解決的問題。近年來，合成工藝更為簡單，誘導(dǎo)免疫反應(yīng)更加持久的核酸疫苗逐漸成為研究熱點。DNA 疫苗、RNA疫苗屬于此類疫苗，它們直接將編碼某種抗原的外源基因?qū)塍w內(nèi)，經(jīng)細(xì)胞攝取、合成抗原后誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的產(chǎn)生。其中，信使RNA（mRNA）疫苗表達(dá)機(jī)制更為安全和簡單，沒有類似DNA疫苗整合到宿主基因組的風(fēng)險，可以在生物體內(nèi)自然降解，具有十分廣泛的應(yīng)用前景[2]。

mRNA疫苗以線性質(zhì)粒DNA（pDNA）或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增的DNA為模板，通過體外轉(zhuǎn)錄合成，能夠?qū)崿F(xiàn)精確的抗原表達(dá)，在體內(nèi)能建立良好的耐受性并引起強(qiáng)效的免疫反應(yīng)。mRNA疫苗的生產(chǎn)無需動物基質(zhì)或細(xì)胞培養(yǎng)，更加簡單、快速、低成本[3]。mRNA直接在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行翻譯而不進(jìn)入細(xì)胞核，不會整合進(jìn)宿主基因組。mRNA本身具有佐劑作用，可增強(qiáng)免疫應(yīng)答反應(yīng)。尤其是在新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）大流行的當(dāng)今，mRNA疫苗的研制周期比傳統(tǒng)疫苗和基因工程疫苗更短，且序列更易修改，可以更好地應(yīng)對隨時可能變異的病毒株。目前，多項關(guān)于新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）的mRNA疫苗正在研發(fā)中。然而mRNA疫苗穩(wěn)定性較差，易被血清中的RNA水解酶降解，或被單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)吞噬而無法到達(dá)靶細(xì)胞發(fā)揮作用。mRNA相對分子質(zhì)量較大且?guī)в胸?fù)電荷，難以通過磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)穿過細(xì)胞膜。因此，需要設(shè)計合適的遞送系統(tǒng)，以保證mRNA疫苗能順利進(jìn)入靶細(xì)胞，并有效地釋放到細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行翻譯[4]。

病毒載體遞送mRNA存在固有的免疫原性風(fēng)險，有效荷載包裝能力有限且生產(chǎn)較為困難。相比較之下，非病毒載體能夠有效保護(hù)負(fù)載的mRNA不受外部環(huán)境或核酸酶的影響，其通常免疫原性較低，安全性更高，設(shè)計合成相對便捷且易于生產(chǎn)，可重復(fù)給藥，是用于遞送mRNA的理想載體。目前，已有110項國內(nèi)和248項國外的mRNA疫苗專利技術(shù)被報道或公開。表1列出了目前已進(jìn)入臨床試驗階段的mRNA疫苗。本文將針對應(yīng)用于mRNA疫苗的非病毒載體遞送系統(tǒng)進(jìn)行介紹。

表1 臨床試驗階段的mRNA疫苗Table 1 mRNA vaccines under clinical trials

1 脂質(zhì)載體

磷脂分子的頭部親水、尾部疏水，其成分與細(xì)胞膜類似，具有良好的生物相容性和可延展性。含有陽離子或可電離類脂材料的脂質(zhì)混合物在水中或酸性環(huán)境中形成帶正電荷的封閉囊泡，可將帶負(fù)電荷的mRNA分子包裹其中，保護(hù)mRNA免受核酸酶降解，且包封率較高。載有mRNA的脂質(zhì)載體被細(xì)胞攝取后，進(jìn)入細(xì)胞中酸性膜包裹的囊泡結(jié)構(gòu)（內(nèi)體）。此時，帶正電荷的脂質(zhì)與內(nèi)體膜上帶負(fù)電荷的磷脂結(jié)合，這種結(jié)合擾亂了內(nèi)體膜結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)膜融合和內(nèi)體破壞，從而導(dǎo)致被包載的mRNA逃逸進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)而到核糖體進(jìn)行翻譯[9]。通過對脂質(zhì)載體進(jìn)行修飾，還能增強(qiáng)其穩(wěn)定性，實現(xiàn)靶向遞送。

1.1 陽離子脂質(zhì)體

陽離子脂質(zhì)體是應(yīng)用最早的脂質(zhì)載體。1，2-二油酰基-3-三甲基銨-丙烷（DOTAP）和二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE）是脂質(zhì)體中常含有的成分。由于陽離子脂質(zhì)體存在一定的毒性且循環(huán)半衰期較短，可能會與帶負(fù)電荷的胞內(nèi)或胞外成分非特異性結(jié)合，通常要對其進(jìn)行一定的修飾，以提高mRNA-脂質(zhì)體復(fù)合物的穩(wěn)定性，減輕毒性并延長作用時間。

Zhang等[10]利用具有跨膜結(jié)構(gòu)和免疫佐劑功能的膽固醇修飾陽離子肽DP7，并對DOTAP脂質(zhì)體進(jìn)行修飾，構(gòu)建了mRNA遞送系統(tǒng)DOTAP/DP7-C。該系統(tǒng)能提高向樹突狀細(xì)胞（DC）遞送編碼個體化新抗原的mRNA的效率，并能增強(qiáng)DC的活性，具有載體和免疫佐劑的雙重功能。在動物實驗中，DOTAP/DP7-C/LL2新抗原編碼mRNA復(fù)合物經(jīng)皮下注射能明顯抑制小鼠荷LL2原位腫瘤和皮下腫瘤生長，并刺激抗原特異性淋巴細(xì)胞反應(yīng)的產(chǎn)生。Liu等[11]用甘露糖修飾的脂質(zhì)/磷酸鈣（LCP）納米粒將編碼腫瘤相關(guān)抗原MUC1的mRNA遞送至淋巴結(jié)DC，在三陰性乳腺癌（TNBC）原位模型中評估了攜帶mRNA的納米粒免疫后的治療效果。LCP包含磷酸鈣核心和由DOTAP、膽固醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（DSPE-PEG2000）與DSPE-PEG-甘露糖組成的不對稱脂質(zhì)雙層，mRNA分子被濃縮并包裹在磷酸鈣核心中。亞細(xì)胞分布表明，LCP可以有效地轉(zhuǎn)染淋巴結(jié)DC，并將負(fù)載的mRNA釋放到細(xì)胞質(zhì)中，有利于所遞送的編碼MUC1的mRNA表達(dá)。體內(nèi)研究表明，該疫苗遞送系統(tǒng)可以誘導(dǎo)出針對4T1 TNBC細(xì)胞的強(qiáng)烈的抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）反應(yīng)。

通過結(jié)構(gòu)設(shè)計和優(yōu)化，還能改善陽離子脂質(zhì)體在DC中的抗原表達(dá)或?qū)崿F(xiàn)靶向定位。Wang等[12]以不同相對分子質(zhì)量PEG（PEG100、PEG1000和PEG2000）為連接物，合成甘露糖-膽固醇結(jié)合物（MPn-CHs），用薄膜分散法制備成DC靶向脂質(zhì)體（MPn-LPs），并通過簡單的自組裝制備成攜帶mRNA的MPn-LPX。攝取研究表明，MP1000-LPX可以通過過度表達(dá)DC表面甘露糖受體（CD206）來增強(qiáng)mRNA的表達(dá)，它具有體積小、近球形、在血清中穩(wěn)定性好、細(xì)胞毒性小等特點，有望成為mRNA疫苗的DC靶向遞送系統(tǒng)。

1.2 陽離子納米乳

陽離子納米乳（CNE）將納米乳液與陽離子脂質(zhì)結(jié)合使用，具有保護(hù)和高效遞送核酸的能力。Brito等[13]制成了一種陽離子脂質(zhì)DOTAP和乳劑佐劑MF59乳化而成的陽離子納米乳，由含有緩沖液和吐溫80的水相與含有山梨醇酐三油酸酯（Span 85）、DOTAP和角鯊烯的油相混合而成。該CNE遞送的自擴(kuò)增mRNA通過招募免疫細(xì)胞增強(qiáng)了局部免疫，在肌肉中實現(xiàn)與病毒載體相似的蛋白表達(dá)位置與表達(dá)量，在多種動物模型中具有良好的耐受性和免疫原性。Bogers等[14]用CNE向恒河猴遞送編碼C族包膜糖蛋白的自擴(kuò)增RNA人類免疫缺陷病毒（HIV）疫苗，首次在非人類靈長類動物中證明了用CNE配制的自擴(kuò)增RNA HIV疫苗是安全的，且具有免疫原性，可引起體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。Samsa等[15]使用CNE遞送系統(tǒng)配制了2種委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒（VEEV）自擴(kuò)增RNA疫苗，分別是攜帶TC-83的RNA基因組的Vee SAM減毒活疫苗LAV-CNE和遞送缺少衣殼基因的TC-83基因組的不可逆減毒Vee SAM疫苗IAV-CNE。實驗結(jié)果證明，用LAV-CNE免疫的小鼠可產(chǎn)生與TC-83相似的免疫反應(yīng)，可以100%保護(hù)氣溶膠VEEV攻擊。IAVCNE也具有免疫原性，對VEEV攻擊具有明顯的保護(hù)作用，為開發(fā)以CNE為載體遞送VEEV等病毒的自擴(kuò)增RNA疫苗提供了概念驗證。Luisi等[16]使用CNE制備的自放大mRNA遞送平臺開發(fā)寨卡病毒（ZIKV）候選疫苗，所制備的疫苗在小鼠和非人類靈長類動物中均能誘導(dǎo)出針對ZIKV的中和抗體反應(yīng)，其中一種候選疫苗對非人類靈長類動物的ZIKV感染提供了完全保護(hù)。

1.3 脂質(zhì)納米粒

脂質(zhì)納米粒（LNPs）通常由可電離脂質(zhì)、PEG脂質(zhì)、輔助脂質(zhì)和膽固醇幾個部分組成，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。帶負(fù)電荷的mRNA與酸性pH下帶正電荷的可電離脂質(zhì)結(jié)合，位于整個LNPs結(jié)構(gòu)的核心。PEG脂質(zhì)位于LNPs結(jié)構(gòu)的表面，能夠延長LNPs的循環(huán)半衰期，增強(qiáng)粒子的穩(wěn)定性。輔助脂質(zhì)能夠支持脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)并促進(jìn)粒子與細(xì)胞的結(jié)合。膽固醇則通常填充于脂質(zhì)間隙，起到穩(wěn)定LNPs結(jié)構(gòu)的作用。包載mRNA的LNPs進(jìn)入人體的生理環(huán)境后，可電離脂質(zhì)變成接近中性。當(dāng)LNPs被內(nèi)吞進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)體后，由于內(nèi)體環(huán)境呈酸性，可電離脂質(zhì)重新帶有正電荷，可以與帶負(fù)電荷的內(nèi)體膜融合，促進(jìn)納米粒的內(nèi)體逃逸，將粒子釋放到細(xì)胞質(zhì)中[17]。最后，可電離脂質(zhì)在近中性的胞漿中釋放mRNA，以利于其進(jìn)一步到核糖體進(jìn)行翻譯（見圖2）。LNPs與其他載體相比具有許多優(yōu)勢：合成可控、組成成分容易調(diào)整以提高遞送效率和降低毒性，可以加入佐劑或免疫細(xì)胞靶向配體等免疫增強(qiáng)劑以調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[18]。

圖1 脂質(zhì)納米粒包載mRNA結(jié)構(gòu)示意圖Figure 1 Schematic illustration of the structure of mRNA encapsulated LNP

圖2 脂質(zhì)納米粒遞送mRNA入胞及轉(zhuǎn)染過程示意圖Figure 2 Schematic illustration of the endocytic pathway of mRNA delivered by LNP and the transfection process

Pardi等[19]將螢火蟲熒光素酶mRNA結(jié)合到組成為可電離脂質(zhì)/磷脂酰膽堿/膽固醇/PEG脂質(zhì)物質(zhì)的量比為 50∶10∶38.5∶1.5（mol/mol）的 LNPs中，其中mRNA與總脂質(zhì)質(zhì)量比為小于0.05（wt/wt），得到直徑為小于80 nm的mRNA-LNPs復(fù)合物。將制備成的 mRNA-LNPs以 0.005 ~ 0.250 mg · kg-1的劑量通過6種不同途徑注射到小鼠中，體內(nèi)成像檢測到了高水平的蛋白質(zhì)翻譯，證明了mRNA-LNPs復(fù)合物可以在體內(nèi)不同時間內(nèi)產(chǎn)生大量蛋白質(zhì)。Liang等[20]用可電離脂質(zhì)/飽和磷脂/膽固醇/PEG脂質(zhì)/6，9，12-十八碳三稀酸（GLA）物質(zhì)的量比為50∶9.83∶38.5∶1.5∶0.17（mol/mol）的LNPs包裹了2種修飾的非復(fù)制型流感H10血凝素（HA） mRNA疫苗，肌肉或皮內(nèi)注射恒河猴后，誘導(dǎo)了保護(hù)性的HA抑制滴度和H10特異性的CD4+T細(xì)胞反應(yīng)，證明了LNPs遞送的mRNA疫苗可以產(chǎn)生強(qiáng)有力的特異性免疫應(yīng)答。

用于腫瘤免疫治療的mRNA疫苗遞送研究是腫瘤治療領(lǐng)域的一個熱點。Oberli等[21]報道了一種用于遞送mRNA疫苗的LNPs制劑，以誘導(dǎo)細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞反應(yīng)。使用該疫苗對DC、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)染，并在侵襲性B16F10黑色素瘤模型中測試了該疫苗的有效性。含有編碼腫瘤相關(guān)抗原gp100和trp2的mRNA的LNP單次免疫后，能夠活化CD8+T細(xì)胞，誘導(dǎo)獲得性免疫殺死黑色素瘤細(xì)胞，延長了荷瘤小鼠的總體生存時間，并且該疫苗加入佐劑脂多糖（LPS）可進(jìn)一步增強(qiáng)免疫應(yīng)答。

Miao等[22]開發(fā)了一個可電離類脂材料的組合庫，用以確定能促進(jìn)體內(nèi)mRNA傳遞并提供有效和特異性免疫激活的mRNA遞送載體。通過三維多組分反應(yīng)系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn)，表現(xiàn)最好的脂類均具有共同的結(jié)構(gòu)：不飽和脂尾、二氫咪唑接頭和環(huán)胺頭基。這些制劑并非通過激活Toll樣受體，而是通過激活細(xì)胞內(nèi)干擾素基因刺激物（STING）途徑誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞成熟，從而導(dǎo)致系統(tǒng)細(xì)胞因子的有限表達(dá)和增強(qiáng)抗腫瘤效果。其中，首選的制劑誘導(dǎo)了強(qiáng)大的免疫反應(yīng)，并能夠抑制黑色素瘤和人乳頭狀瘤病毒E7腫瘤模型中的腫瘤生長和延長荷瘤小鼠生存期。

此外，LNPs也被廣泛應(yīng)用于遞送針對流感病毒、狂犬病病毒、HIV、巨細(xì)胞病毒（CMV）等的mRNA疫苗[23]。Lutz等[18]通過實驗證明，單次肌肉注射由LNPs遞送的編碼狂犬病病毒或流感病毒抗原的mRNA疫苗，可以誘導(dǎo)保護(hù)性抗體滴度，在長達(dá)1年的觀察期間，免疫反應(yīng)可得到增強(qiáng)并保持穩(wěn)定。Pardi等[24]用LNPs包裹編碼2013年ZIKV爆發(fā)菌株的前膜和包膜糖蛋白的核苷修飾的mRNA，進(jìn)行單次低劑量皮內(nèi)免疫后，在小鼠和非人靈長類動物中引發(fā)了有效和持久的中和抗體反應(yīng)。其中，LNPs的脂質(zhì)組成為可電離脂質(zhì)/磷脂酰膽堿/膽固醇/PEG脂質(zhì)，其物質(zhì)的量比為50∶10∶38.5∶1.5（mol/mol），mRNA與總脂的質(zhì)量比為0.05（wt/wt）。注射劑量為30 μg時，可在免疫后2周或5個月保護(hù)小鼠免受ZIKV攻擊，50 μg的單次免疫則可在5周內(nèi)保護(hù)非人類靈長類動物，表明了核苷修飾的mRNA-LNPs能誘導(dǎo)快速持久的保護(hù)性免疫反應(yīng)。

SARS-CoV-2的出現(xiàn)使應(yīng)用mRNA疫苗預(yù)防傳染病成為了研究焦點，LNPs-mRNA在其中得到迅速發(fā)展和廣泛的應(yīng)用。2種獲得了美國食品和藥品管理局（FDA）緊急使用授權(quán)的新型冠狀病毒肺炎mRNA疫苗均采用LNPs作為載體。其中，輝瑞生物技術(shù)公司的BNT162b2，其LNPs載體成分包含膽固醇、2-PEG2000-N，N-二十四烷基乙酰胺、[（4-羥基丁基）氮雜二烷基]雙（己烷-6，1-二基）雙（2-己基癸酸酯）、二硬脂酰磷脂酰膽堿（DSPC）。Moderna公司的mRNA-1273，其LNPs載體成分包含膽固醇、鞘磷脂-102（SM-102）、二肉豆蔻酰甘油-PEG2000和DSPC。這2種疫苗在Ⅲ期臨床試驗中的有效率分別高達(dá)95%和94.5%，體現(xiàn)了以LNPs為載體的mRNA疫苗的高效性和在預(yù)防感染性疾病中的巨大潛力[25]。

2 聚合物

與陽離子脂質(zhì)體類似，帶有正電荷的陽離子聚合物也可以與mRNA疫苗通過電荷相互作用形成復(fù)合物。相較于生產(chǎn)過程需要自組裝、擠壓和絡(luò)合的陽離子脂質(zhì)體，陽離子聚合物僅需要與mRNA疫苗進(jìn)行混合，生產(chǎn)工藝較為簡單，具有結(jié)構(gòu)可控，功能多樣的優(yōu)點，且穩(wěn)定性更好[25]。聚乙烯亞胺（PEI） 是早期廣泛用于mRNA疫苗遞送的聚合物，常對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化以提高轉(zhuǎn)染效率。聚酰胺胺（PAMAM）、聚丙烯亞胺（PPI）等樹枝狀大分子也被用于mRNA疫苗遞送。然而，聚合物遞送系統(tǒng)的生物相容性、細(xì)胞毒性和生物降解性問題需要進(jìn)一步解決，以提高其安全性、有效性和體內(nèi)穩(wěn)定性。通過對這些陽離子聚合物進(jìn)行修飾并靶向特定細(xì)胞，可以減輕細(xì)胞毒性，改善體內(nèi)外釋放性能。一些研究也采用聚乳酸（PLA）、聚β-氨基酯（PBAE）、聚乳酸-羥基乙酸（PLGA）等聚酯，或殼聚糖和葡聚糖等天然聚合物衍生物，以獲得更好的生物降解性[26-27]。

Karpenko等[28]以聚葡萄糖素-亞精胺結(jié)合物（PGS）作為載體，遞送編碼SARS-CoV-2刺突蛋白受體結(jié)合域的mRNA（mRNA-RBD），免疫小鼠后產(chǎn)生了具有中和活性的特異性抗體。Chahal等[29]開發(fā)了一種樹枝狀大分子納米顆粒疫苗載體用于遞送含有編碼抗原蛋白的mRNA，該疫苗可由多個表達(dá)抗原的復(fù)制子組成，能夠激發(fā)CD8+T細(xì)胞和抗體反應(yīng)，對包括H1N1流感病毒、弓形蟲和埃博拉病毒在內(nèi)的致命性病原體產(chǎn)生保護(hù)性免疫。Li等[30]將環(huán)糊精（CD）與PEI600或PEI2k偶聯(lián)，制備了不同CD/PEI比的CD-PEI聚合物（CP）。通過評估淋巴結(jié)遷移和免疫應(yīng)答，分析了CP600、CP2k和PEI25k作為鼻腔內(nèi)mRNA疫苗載體的遞送效果，發(fā)現(xiàn)CP2k/mRNA體外轉(zhuǎn)染效率較高，向淋巴結(jié)遷移和刺激DC在體內(nèi)成熟的能力比PEI25k/mRNA更強(qiáng)，并能產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，且其局部和全身毒性低于PEI25k/mRNA，證明了CD-PEI2k/mRNA納米復(fù)合物具有向淋巴結(jié)高效輸送疫苗的潛力。

3 脂質(zhì)/聚合物雜化納米粒

脂質(zhì)/聚合物雜化納米粒（LPHNs）是由脂質(zhì)殼和聚合物內(nèi)芯組成的納米結(jié)構(gòu)，對mRNA的轉(zhuǎn)染效率高達(dá)80%。裝載mRNA疫苗的LPHNs可以通過細(xì)胞屏障，并實現(xiàn)有效的內(nèi)體釋放和高效的蛋白質(zhì)翻譯，具有穩(wěn)定、持久、可生物降解等優(yōu)點[31]。Ayad等[32]用DSPC/DOTAP類脂膜（15 mol/85 mol）包裹聚乳酸（PLA）納米粒，用以遞送mRNA疫苗，在體外轉(zhuǎn)染HeLa和DC2.4細(xì)胞的實驗中獲得了比單純脂質(zhì)體更高的轉(zhuǎn)染效率，說明在脂質(zhì)膜內(nèi)包裹固體聚合物顆粒核心可以使載體與mRNA的結(jié)合更牢固，使它們在遞送過程中不容易丟失mRNA。

Yasar等[33]制備并優(yōu)化了PLGA包覆陽離子脂質(zhì)1，2-雙十八烯氧基-3-甲基銨丙烷的納米粒子（LPN），通過實時細(xì)胞攝取和報告基因表達(dá)的實時細(xì)胞成像，評價了與mRNA復(fù)合的該脂質(zhì)-聚合物雜化系統(tǒng)轉(zhuǎn)染DC的效率。與一種早期開發(fā)的基于聚合物的遞送系統(tǒng)殼聚糖-PLGA納米粒進(jìn)行比較，當(dāng)2種納米粒的細(xì)胞攝取和毒性相當(dāng)時，LPN攜帶的mRNA蛋白質(zhì)表達(dá)效率（約80%）顯著高于殼聚糖-PLGA納米粒（僅為約5%）。Siewert等[34]將不同比例的陽離子脂質(zhì)DOTAP和魚精蛋白組裝起來，制備成雜化納米粒作為mRNA的載體。其中，魚精蛋白含有大量的陽離子L-精氨酸，能結(jié)合mRNA并保護(hù)其免受核酸酶降解，DOTAP是用于mRNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染的脂質(zhì)。與單獨使用脂質(zhì)/mRNA和聚合物/mRNA顆粒相比，使用不同的組裝路線、采用不同的DOTAP/魚精蛋白比例的雜化系統(tǒng)具有更高的轉(zhuǎn)染率。通過熒光素酶活性測定法和小鼠體內(nèi)生物發(fā)光顯像法對制劑的結(jié)構(gòu)特征和生物活性進(jìn)行研究，表明該制劑具有較高的生物活性。Le Moignic等[35]用α-D-三吡喃甘露糖苷（triMN）修飾脂質(zhì)-聚合物-RNA復(fù)合物（LPR），將其在小鼠皮內(nèi)注射2 d后，triMN-LPR誘導(dǎo)了強(qiáng)烈的局部炎癥反應(yīng)，隨后在注射部位周圍的引流淋巴結(jié)中募集和激活了DC。編碼E7抗原的mRNA triMN-LPR免疫小鼠后，可檢測到大量的E7特異性T細(xì)胞，證明了triMN-LPR能引起有效的刺激性免疫反應(yīng)。

4 細(xì)胞穿膜肽

用于核酸遞送的多肽因包含賴氨酸和精氨酸殘基而帶正電荷，稱為陽離子細(xì)胞穿膜肽（CPPs），能與帶負(fù)電荷的mRNA通過靜電作用結(jié)合形成納米復(fù)合物，并有效被細(xì)胞攝取。該納米復(fù)合物被細(xì)胞攝取的可能機(jī)制為CPPs促進(jìn)細(xì)胞表面帶負(fù)電荷的糖胺聚糖的聚集，并觸發(fā)微吞胞作用。CPPs具有較低的電荷密度和優(yōu)異的穿越細(xì)胞膜能力，已被廣泛用于遞送藥物、蛋白質(zhì)、pDNA和siRNA，在遞送mRNA方面也有許多探索性研究被報道。但目前只有少數(shù)多肽有效，需要開發(fā)新的有效化合物以擴(kuò)大肽遞送系統(tǒng)的材料庫[36-37]。

Bell等[38]報道了截斷魚精蛋白與名為Xentry的短CPP融合后，可以將編碼報告基因的mRNAs轉(zhuǎn)染到人類細(xì)胞中。Udhayakumar等[37]利用一種含有兩親性RALA基序的細(xì)胞穿透肽將抗原編碼mRNA遞送至免疫細(xì)胞。RALA一端帶正電的精氨酸殘基，另一端帶中性亮氨酸殘基，可以將mRNA濃縮成納米復(fù)合物，并顯示酸性pH依賴的膜破壞特性。RALA-mRNA納米復(fù)合物可使mRNA從內(nèi)體逃逸，進(jìn)而在DC胞漿內(nèi)表達(dá)，并可以促進(jìn)體內(nèi)抗原特異性T細(xì)胞增殖。RALA介導(dǎo)的mRNA疫苗免疫原性高且易于生產(chǎn)，其效力優(yōu)于由陽離子脂質(zhì)體DOTAP和融合脂質(zhì)DOPE組成的mRNA制劑。缺乏RALA基序的富含精氨酸的多肽與mRNA復(fù)合能力減弱，不具備體外轉(zhuǎn)染DC和體內(nèi)引起T細(xì)胞免疫的能力。Coolen等[39]用兩親性陽離子肽（RALA、LAH4或 LAH4-L1）與mRNA形成復(fù)合物，并將該復(fù)合物吸附到聚乳酸納米顆粒（PLA-NPs）上，形成的PLA-NP/陽離子肽/mRNA 納米復(fù)合物可以通過吞噬作用和網(wǎng)格蛋白依賴性內(nèi)吞作用被DC攝取，并在體外誘導(dǎo)DC中目的蛋白的高表達(dá)。

5 新型載體材料

除上述載體外，也有一些新型材料被用于mRNA疫苗遞送研究，如無機(jī)納米材料、水凝膠、病毒樣顆粒等。與傳統(tǒng)材料相比，這些新型材料在提升mRNA疫苗翻譯的效率和強(qiáng)度、體內(nèi)靶向定位、長效緩釋等方面具有更大的優(yōu)勢。Zhang等[40]開發(fā)了一種基于介孔二氧化硅納米粒的mRNA（MSN-mRNA）皮下給藥系統(tǒng)。該系統(tǒng)由裸mRNA和咪唑-羥吲哚RNA激活蛋白激酶（PKR）抑制劑C16的皮下儲庫組成，在體外和體內(nèi)具有很強(qiáng)的促進(jìn)mRNA翻譯的能力。皮下注射MSN-mRNA可顯著提高裸露mRNA在體內(nèi)的翻譯和表達(dá)動力學(xué)。將編碼卵清蛋白和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子的裸露mRNA和C16@MSNs組成的MSN-mRNA疫苗配方應(yīng)用于小鼠T淋巴瘤E.G7-OVA模型，可以產(chǎn)生很強(qiáng)的抑瘤作用。Yin等[41]報道了一種由氧化石墨烯（GO）和PEI組成的可注射水凝膠，用于包載編碼模式抗原卵清蛋白的mRNA（mOVA）和佐劑（R848）。該水凝膠不僅可以包裹和保護(hù)mRNA不被降解，還具有淋巴結(jié)靶向能力。這種可轉(zhuǎn)化水凝膠能顯著增加抗原特異性CD8+T細(xì)胞的數(shù)量，從而抑制腫瘤生長。同時，該制劑可以在血清中產(chǎn)生抗原特異性抗體，從而預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生。凝膠中的mOVA在體內(nèi)注射30 d后仍可檢測到，一次注射即可有效抑制腫瘤生長，說明該水凝膠是一種長期緩釋的mRNA疫苗遞送系統(tǒng)。Li等[42]用MS2噬菌體衣殼包裝mRNA疫苗，制備成了重組噬菌體MS2病毒樣顆粒（VLP），用于前列腺癌（PCA）的免疫治療。VLP中包裝的mRNA在被巨噬細(xì)胞吞噬12 h后即可翻譯成蛋白質(zhì)，能夠克服自身耐受性，激活DC，誘導(dǎo)較強(qiáng)的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，尤其是CTL反應(yīng)，可以在不上調(diào)CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的情況下平衡Ⅰ型輔助性T細(xì)胞/Ⅱ型輔助性T細(xì)胞（Th1/Th2）應(yīng)答，可完全保護(hù)小鼠免受PCA的侵襲，具有強(qiáng)大的腫瘤抑制作用。

6 傳統(tǒng)載體材料的局限性

雖然已有許多研究報道用于mRNA疫苗遞送的脂質(zhì)、聚合物、肽類等載體，但這些材料仍然存在一些問題和挑戰(zhàn)。如一些陽離子脂質(zhì)體或聚合物與mRNA的結(jié)合過于緊密，導(dǎo)致mRNA釋放困難。LNPs中脂質(zhì)的不飽和度、各組分的比例等需要更加精確的設(shè)計以提升遞送效率。PEI等聚合物大分子的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，聚合度較難控制，組成高分子鏈單元的相對分子質(zhì)量和排列變異性大，不同合成批次之間差異較大。一些聚合物在體內(nèi)具有較大毒性。遞送載體的穩(wěn)定性和包封率也需要進(jìn)一步提升。另一方面，人和動物模型的免疫系統(tǒng)存在差異，盡管有些材料在動物研究中能引起有效的免疫反應(yīng)，但這些材料能否在人體內(nèi)獲得與動物體內(nèi)相同的免疫效果，是否會出現(xiàn)新的毒副作用仍有待考察。

mRNA疫苗遞送要求以更全面的研究思路設(shè)計和開發(fā)新型遞送載體材料和遞送系統(tǒng)。要對載體介導(dǎo)的遞送過程進(jìn)行詳細(xì)研究，掌握規(guī)律，設(shè)計和優(yōu)化以增強(qiáng)內(nèi)體逃逸，提高轉(zhuǎn)染效率為目的的新載體，促進(jìn)保護(hù)性免疫反應(yīng)。掌握疫苗靶向遞送機(jī)制和規(guī)律，設(shè)計和優(yōu)化載體表面修飾方法，提高mRNA的靶向遞送效率，增強(qiáng)免疫效力，減輕毒副作用。根據(jù)有效荷載的不同對mRNA和遞送材料的組裝進(jìn)行優(yōu)化，以高度可控且可重復(fù)性的方式對組分進(jìn)行裝載。對比不同的遞送技術(shù)平臺，為設(shè)計滿足不同mRNA疫苗免疫需求的最佳遞送載體以及預(yù)測體內(nèi)免疫應(yīng)答提供有價值的指導(dǎo)。最后，需要在人體試驗中綜合評價給藥途徑、載藥劑量、給藥頻率等以確定免疫反應(yīng)的最佳參數(shù)，并在保證疫苗效力的同時優(yōu)化載體的安全性[36]。

7 結(jié)語與展望

mRNA疫苗是一種治療和預(yù)防傳染病、防治癌癥的新型疫苗。mRNA疫苗需要在載體的幫助下有效地發(fā)揮作用。mRNA疫苗遞送系統(tǒng)需要達(dá)到以下幾個要求：包埋效率高且能保護(hù)mRNA不被水解酶降解；能將疫苗遞送至靶細(xì)胞，并高效地釋放mRNA至細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行翻譯；毒性小，不使機(jī)體產(chǎn)生嚴(yán)重炎癥反應(yīng)或毒副作用。以脂質(zhì)納米粒為代表的非病毒載體遞送系統(tǒng)，可以有效負(fù)載mRNA并轉(zhuǎn)染細(xì)胞，表達(dá)特異性抗體，激活機(jī)體免疫反應(yīng)，在應(yīng)對COVID-19感染中顯示出良好的臨床效果。同時，通過緊急授權(quán)使用后的臨床結(jié)果也證實了以脂質(zhì)納米粒作為載體遞送mRNA疫苗具有較高的安全性。但mRNA疫苗極其不穩(wěn)定，在室溫下很快降解失效，需要超低溫保存，儲存條件苛刻。因此，mRNA疫苗的長期儲存和長距離運輸?shù)膯栴}仍有待解決?？傊兄颇軌虬邢蚨ㄎ?、穩(wěn)定性強(qiáng)、毒性小、易于儲存的新型非病毒載體，是未來mRNA疫苗遞送研究的目標(biāo)，同時也具有很好的臨床轉(zhuǎn)化的應(yīng)用價值。