黃 鈺，陳 斌，肖關(guān)麗

（1云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，昆明 650201；2云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，昆明 650201）

0 引言

水稻(Oryza sativaL.)是全球極其重要的糧食作物[1]。然而，害蟲是嚴(yán)重影響水稻產(chǎn)量和質(zhì)量的重要因素，其中對水稻種植影響較大的屬稻飛虱中的褐飛虱。褐飛虱(Nilaparvata lugensSt?l)是許多亞洲國家和中國水稻種植中最為首要的遷飛性害蟲，其發(fā)生范圍不斷擴(kuò)大，危害嚴(yán)重[2]，蟲量大時(shí)可對水稻稻株造成嚴(yán)重傷害，使水稻大面積減產(chǎn)甚至顆粒無收[3-4]。此外，褐飛虱還會傳播水稻鋸齒葉矮縮病(Ragged stunt virus，RSV)和草狀矮縮病(Grassy stunt virus，GSV)等病毒病[5]。其中水稻抗性品種的嚴(yán)重缺乏是中國稻飛虱危害加重的重要原因之一[6]。‘月亮谷’(‘Acuce’)是云南省元陽哈尼梯田長期種植保留下來的優(yōu)良地方水稻品種，種植歷史悠久，有良好的病蟲害抗性[7]。研究‘月亮谷’對褐飛虱取食的主要防御反應(yīng)，探明其抗蟲機(jī)理，深入挖掘該品種優(yōu)良特性，為更好利用該地方品種提供理論依據(jù)。植物在與昆蟲長期的協(xié)同進(jìn)化過程中，進(jìn)化形成了減輕昆蟲取食對其傷害多種防御機(jī)制，如植株?duì)I養(yǎng)狀況的變化、產(chǎn)生次生代謝有毒物質(zhì)或防御蛋白等[8-9]。稻飛虱取食危害后水稻稻株內(nèi)的可溶性糖含量下降[10-12]，丙二醛(MDA)和過氧化氫(H2O2)含量上升[13-14]、多酚氧化酶(PPO)活性表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢變化[15]，過氧化物酶(POD)活性在為害后顯著升高[11]。然而，不同水稻品種對不同種類稻飛虱取食危害后的生理響應(yīng)不盡一致[10,16-17]。稻飛虱對化學(xué)農(nóng)藥的抗藥性的出現(xiàn)是制約稻飛虱有效防控的重要因素[18]，因此，利用水稻抗性品種控制稻飛虱已成為稻飛虱持續(xù)控制的重要措施，而開展水稻對稻飛虱取食危害的生理反應(yīng)格外重要。云南地處云貴高原，擁有十分豐富的地方稻種資源及抗性資源[19][20]。其水稻地方品種中蘊(yùn)藏著新的抗性基因，具有豐富的遺傳多樣性，在改良水稻品種抗蟲性方面具有極高的利用價(jià)值[21]?！铝凉取窃颇显柟崽萏锓N植面積最大的主栽地方品種，有上百年的種植歷史，具有較強(qiáng)的抗病蟲害特性和豐富的遺傳多樣性，是研究水稻遺傳育種的理想材料[22-24]。研究褐飛虱取食脅迫對‘月亮谷’中可溶性糖、丙二醛(MDA)、過氧化氫(H2O2)含量，以及過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)主要防御酶活性的影響，探明地方品種‘月亮谷’對褐飛虱取食脅迫的生理響應(yīng)。利用抗性品種控制稻飛虱的為害是最為經(jīng)濟(jì)有效的防治措施，探究水稻抗褐飛虱的機(jī)制是篩選和培育抗蟲品種的基礎(chǔ)工作。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

水稻品種為云南元陽哈尼族傳統(tǒng)水稻品種‘月亮谷’，由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物資源利用與保護(hù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

抗、感褐飛虱水稻品種‘Rathu Heenati’(‘RHT’)和‘Taichung Native 1’(‘TN1’)均由中國水稻研究所提供。

褐飛虱在感蟲水稻品種‘TN1’上，飼養(yǎng)于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院昆蟲實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)箱(28 ～30℃)內(nèi)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)處理 播種前浸種催芽，水稻種子露白后在育苗盤中分別種植‘月亮谷’及抗感對照‘TN1’與‘RHT’3個水稻品種，待水稻幼苗長至2葉1心期，挑選各品種健康壯苗5株，移栽至準(zhǔn)備好的透明塑料杯(口徑90 mm、高度175 mm、容量700 mL)，雌雄比例1:1，每杯接入5對褐飛虱成蟲，然后用紗布對塑料杯封口，并置于恒溫培養(yǎng)箱中于16L:8D光周期，28 ～30℃，相對濕度70%±5%條件下飼養(yǎng)。試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，以不接褐飛虱的水稻苗作為空白對照。分別取對照和接蟲后3、6、12、24、48、72和96 h時(shí)水稻苗全部莖葉，分別裝入自封袋(100 mm×70 mm)并置于液氮速凍1 min，取出放入-80℃冰箱保存待測。

1.2.2 稻株可溶性糖含量測定 稱取樣品0.1 g，采用可溶性糖試劑盒，由蘇州格銳思生物科技有限公司生產(chǎn)（下同），分光光度計(jì)測定620 nm處的吸光值。利用測定數(shù)值計(jì)算可溶性糖含量。

1.2.3 稻株次生代謝產(chǎn)物含量測定

（1）稻株內(nèi)MDA含量測定 稱取樣品0.1 g，采用MDA試劑盒，分光光度計(jì)分別測定532 nm和600 nm處吸光值。利用測定數(shù)值計(jì)算MDA含量

（2）稻株H2O2含量測定稱取樣品0.1 g，采用H2O2試劑盒，分光光度計(jì)測定415 nm處的吸光值。利用測定數(shù)值計(jì)算H2O2含量。

1.2.4 稻株保護(hù)酶活性測定

（1）稻株P(guān)PO活性測定 稱取樣品0.1 g，采用PPO試劑盒，利用分光光度計(jì)測定420 nm時(shí)的吸光值。利用測定數(shù)值計(jì)算PPO含量。

（2）稻株P(guān)OD活性測定 稱取樣品0.1 g，采用POD試劑盒，分光光度計(jì)測定470 nm處的吸光值。利用測定數(shù)值計(jì)算POD含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用軟件Excel 2010整理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，利用單因素多重比較Duncan's新復(fù)極差法分析比較各測定數(shù)據(jù)間的差異顯著性，所有數(shù)據(jù)分析均在DPS 2005軟件中完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 褐飛虱為害后水稻可溶性糖含量變化

結(jié)果表明（圖1），褐飛虱取食3 h后，‘月亮谷’植株內(nèi)可溶性糖的含量顯著下降(P＜0.05)，降至谷值2.00 mg/gFW。而在取食脅迫6 h后，可溶性糖的含量又呈現(xiàn)上升，到48 h時(shí)達(dá)峰值8.98 mg/gFW，之后又緩慢下降；對于‘TN1’，褐飛虱取食3 h后，其體內(nèi)可溶性糖含量達(dá)谷值5.06 mg/gFW，取食12 h后，其可溶性糖含量達(dá)峰值13.67 mg/gFW，取食72 h時(shí)達(dá)第二個峰值12.90 mg/gFW，取食96 h后與對照相近；褐飛虱取食3 h后，‘RHT’的可溶性糖含量顯著下降，且在取食3 ～24 h后無顯著變化，取食48 ～72 h后又顯著增加，取食96 h后，‘RHT’可溶性糖含量又顯著下降。褐飛虱取食脅迫后，‘月亮谷’可溶性糖含量的變化趨勢與RHT可溶性糖含量的變化趨勢相近。

圖1 褐飛虱取食脅迫后水稻植株可溶性糖含量

從褐飛虱取食危害后供試水稻植株內(nèi)可溶性糖含量增加率來看（表1），褐飛虱取食3 ～96 h后，‘月亮谷’、‘TN1’和‘RHT’可溶性糖含量相較于對照平均增加了-42.85%、-21.78%和-39.46%，‘月亮谷’植株體內(nèi)可溶性糖含量增加率顯著低于‘TN1’，而與‘RHT’間無顯著差異。由此表明，褐飛虱取食危害后，‘月亮谷’和抗蟲品種‘RHT’較感蟲品種‘TN1’可溶性糖含量下降更為明顯。

表1 褐飛虱為害后水稻體內(nèi)可溶性糖、過氧化氫和丙二醛含量較對照的增降率%

續(xù)表1

2.2 褐飛虱為害后水稻過氧化氫含量的變化

由圖2可看出，褐飛虱取食脅迫3 h后，‘月亮谷’植株內(nèi)H2O2含量降低，取食6 h后，H2O2含量上升，取食12 h后，‘月亮谷’H2O2含量顯著下降，取食24 ～96 h后上升至高于對照水平，取食96 h達(dá)峰值10.29 U/gFW；褐飛虱取食3 h后，‘TN1’的H2O2含量略下降，取食6 ～48 h上升，取食48 ～96 h后H2O2含量基本不變并高于對照水平，取食96 h為峰值10.04 U/gFW；褐飛虱取食脅迫6 h后，‘RHT’的H2O2含量顯著下降，在取食12 h后顯著上升且接近對照水平，取食24 h后顯著下降，取食脅迫48 h后顯著上升，至取食72 ～96 h后H2O2含量緩慢下降，取食6 h為峰值8.15 U/gFW，且與對照無顯著差異。

圖2 褐飛虱取食脅迫后水稻體內(nèi)過氧化氫含量

從褐飛虱取食危害后供試水稻植株內(nèi)H2O2含量增加率來看（表1），取食3 ～96 h后，‘月亮谷’、‘TN1’和‘RHT’體內(nèi)H2O2含量相較于對照分別增加9.39%、42.25%和-19.74%，由此看出‘月亮谷’體內(nèi)的H2O2平均含量增加率高于抗蟲品種‘RHT’，但顯著低于感蟲品種‘TN1’。

2.3 褐飛虱為害后水稻丙二醛含量的變化

由圖3可知，褐飛虱取食脅迫3 h后，‘月亮谷’植株內(nèi)MDA含量下降，在取食6 ～24 h后上升并保持相近水平，取食48 h后顯著下降至最低值2.91 nmol/gFW，取食72h后上升并于取食96h上升至峰值6.34nmol/gFW；褐飛虱取食6 h后，‘TN1’的MDA含量顯著下降至最低值0.89 nmol/gFW，取食12 ～72 h后上升至峰值5.90 nmol/gFW，取食96 h時(shí)下降；褐飛虱取食3 ～6 h后，‘RHT’的MDA含量迅速增加，取食24 h后，‘RHT’的MDA含量顯著下降至最低值4.26 nmol/gFW，在取食48 h后上升，且取食脅迫72 ～96 h基本不變。

圖3 褐飛虱取食脅迫后水稻體內(nèi)丙二醛含量

從被褐飛虱取食脅迫后水稻植株內(nèi)MDA含量的增降率來看（表1），被取食脅迫3 ～96 h后，‘月亮谷’、‘TN1’和‘RHT’植株內(nèi)的MDA含量相較于對照分別增加了10.77%、87.81%和32.31%，‘月亮谷’植株體內(nèi)MDA含量平均增加率顯著低于‘TN1’和‘RHT’。由此表明，褐飛虱取食脅迫后，‘月亮谷’稻株內(nèi)MDA含量較感蟲品種‘TN1’和抗蟲品種‘RHT’的更低，且抗蟲品種‘RHT’的MDA含量平均增加率顯著低于感蟲品種‘TN1’。

2.4 褐飛虱為害后水稻多酚氧化酶活性的變化

由圖4可知，褐飛虱取食脅迫3 ～12 h后，‘月亮谷’植株內(nèi)PPO活性緩慢上升，取食24 h后時(shí)上升至第一峰值7.91 U/gFW，而在取食48 h后顯著下降，取食72 h顯著上升達(dá)峰值8.89 U/gFW后又下降；褐飛虱取食脅迫3 h后，‘TN1’的PPO活性迅速增加，并于取食6 h上升至峰值19.47 U/gFW，取食12 h后顯著低于對照，取食12 ～48 h后上升達(dá)峰值19.47 U/gFW，取食72 h下降后又上升；褐飛虱取食脅迫3 h后，‘RHT’的PPO活性顯著下降，在取食6 h后迅速降至接近對照水平，取食24 h后下降至最低值2.67 U/gFW，取食48 h后增加至峰值14.49 U/gFW，取食72 ～96 h后緩慢下降。

圖4 褐飛虱取食脅迫后水稻多酚氧化酶活性

由表2可知，褐飛虱取食脅迫3 ～96 h后，‘月亮谷’、‘TN1’和‘RHT’的PPO活性相較于對照的平均增加率分別為49.96%、241.87%和0.89%，表明‘月亮谷’體內(nèi)PPO活性平均增加率顯著低于感蟲品種‘TN1’，而與抗蟲品種‘RHT’間無顯著差異。

表2 褐飛虱為害后水稻體內(nèi)PPO和POD活性較對照的增降率 %

2.5 褐飛虱為害后水稻過氧化物酶活性的變化

由圖5可知，褐飛虱取食脅迫3 h后，‘月亮谷’POD活性顯著下降，在取食6 h后又顯著上升至峰值475.28 U/gFW，取食24 h后下降至最低值62.93 U/gFW，之后波動上升至高于對照水平；褐飛虱取食脅迫3 h后，‘TN1’的POD活性顯著下降，在取食6 h后又顯著上升至除對照外最高值220.80 U/gFW，取食12 h后下降，取食48 h下降至最低值23.70 U/gFW，取食72 ～96 h上升；褐飛虱取食脅迫3 h后，‘RHT’的POD活性顯著下降，在取食6 h后又顯著上升至峰值293.98 U/gFW，取食12 h后下降至最低值118.37 U/gFW，之后波動上升至高于對照水平。

圖5 褐飛虱取食脅迫后水稻過氧化物酶活性

由表2可知，褐飛虱取食3 ～96 h后，‘月亮谷’、‘TN1’和‘RHT’的POD活性相較于對照的平均增加率分別為-14.75%、-45.01%和1.75%，表明‘月亮谷’體內(nèi)POD活性平均增加率顯著低于抗蟲品種‘RHT’，高于感蟲品種‘TN1’。

3 討論

植食性昆蟲從植物中獲取生長的必要物質(zhì)，昆蟲的生長代謝直接受植物的營養(yǎng)物質(zhì)含量影響，因此，植物通過降低營養(yǎng)物質(zhì)含量，來達(dá)到抗蟲目的[25]。段燦星等[26]研究報(bào)道，抗感水稻品種的可溶性糖含量在灰飛虱為害后均下降，且感蟲品種下降幅度顯著大于抗蟲品種，而本研究中水稻被褐飛虱取食脅迫后，供試‘月亮谷’及抗蟲和感蟲品種稻株內(nèi)可溶性糖含量均降低，但抗蟲品種體內(nèi)可溶性糖含量下降幅度顯著大于感蟲品種。蟲害誘導(dǎo)后，植物中的可溶性糖轉(zhuǎn)化為次生物質(zhì)，降低了植物的適口性，植物內(nèi)營養(yǎng)成分缺少，阻礙昆蟲取食。本研究發(fā)現(xiàn)，褐飛虱取食后，水稻‘月亮谷’的可溶性糖含量較對照顯著下降，且在取食為害后的多數(shù)時(shí)期可溶性糖含量低于對照，表明水稻植株通過減少稻株內(nèi)的可溶性糖含量以響應(yīng)稻飛虱的取食脅迫。此外，褐飛虱為害后，‘月亮谷’稻株內(nèi)可溶性糖含量的下降趨勢與抗蟲品種‘RHT’相近，由此推測，‘月亮谷’與抗蟲品種‘RHT’能通過降低可溶性糖含量來表現(xiàn)對褐飛虱的抗性。

害蟲的取食危害脅迫能影響植物體內(nèi)活性氧代謝系統(tǒng)的平衡，破壞膜結(jié)構(gòu)[13]。MDA含量高低能夠指示植物細(xì)胞膜發(fā)生細(xì)胞膜脂過氧化程度[27]，也可用來表示植物抗逆境反應(yīng)的強(qiáng)弱[28]。而H2O2是植物體內(nèi)主要的活性氧，植物體內(nèi)H2O2含量可作為昆蟲對植物傷害強(qiáng)弱的生理指標(biāo)[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，褐飛虱取食脅迫后，‘月亮谷’植株內(nèi)H2O2含量明顯上升，顯著高于抗蟲品種‘RHT’體內(nèi)H2O2含量，但卻顯著低于感蟲品種‘TN1’。表明褐飛虱為害后，會誘導(dǎo)H2O2在水稻‘月亮谷’體內(nèi)積累，增加至一定程度時(shí)引起水稻‘月亮谷’的防御反應(yīng)；同時(shí)，水稻稻株內(nèi)過量積累的H2O2使水稻過氧化而造成損傷，因此，感蟲品種‘TN1’的MDA含量顯著增加。

昆蟲為害植物后，植物體內(nèi)的防御酶就會被誘導(dǎo)或抑制，從而保護(hù)植物達(dá)到防御目的[30-31]。PPO是一類催化酚類化合物氧化為醌的酶，能夠阻礙昆蟲營養(yǎng)的利用，PPO的過量表達(dá)，一定程度上在植物蟲害脅迫中起著重要的作用[33-34]。不同水稻品種的PPO活性均上升，且‘月亮谷’PPO活性增加率與抗蟲品種‘RHT’無顯著差異，表現(xiàn)出相似的防御反應(yīng)。

過氧化物酶(POD)是一種在植物中廣泛存在清除過量活性氧的氧化還原酶，同時(shí)也是植物抗逆反應(yīng)過程中的關(guān)鍵酶之一，在一定程度上使植物抵御逆境脅迫傷害[32]。本研究中，云南哈尼族地方傳統(tǒng)水稻‘月亮谷’和感蟲品種‘TN1’受褐飛虱為害后，其稻株內(nèi)防御酶POD活性反而下降，而抗蟲品種‘RHT’的POD活性略增加，這與前人結(jié)果相反[16]。受褐飛虱取食為害后，不同水稻品種的不同防御酶協(xié)同作用，不同試驗(yàn)處理及試驗(yàn)方法對試驗(yàn)結(jié)果會產(chǎn)生較大的影響，產(chǎn)生不同甚至相反的結(jié)果，需要進(jìn)一步的研究。

本研究中的云南地方品種‘月亮谷’僅在云南地區(qū)進(jìn)行種植和試驗(yàn)，適用范圍較窄，對全國范圍內(nèi)不同氣候的適應(yīng)性不明確，需要進(jìn)行更大范圍的試驗(yàn)點(diǎn)種植及完善的試驗(yàn)。而且本研究中僅僅進(jìn)行了3個水稻品種的三葉期褐飛虱成蟲取食脅迫試驗(yàn)，未進(jìn)行大量水稻品種、不同水稻生長時(shí)期與褐飛虱不同時(shí)期蟲態(tài)之間的取食試驗(yàn)；試驗(yàn)的水稻株數(shù)與單株水稻上的取食褐飛虱數(shù)量均較少，其試驗(yàn)結(jié)果存在偶然性，在今后應(yīng)進(jìn)行更加系統(tǒng)的試驗(yàn)。水稻‘月亮谷’對褐飛虱的抗性機(jī)制有待深層次的挖掘研究。

4 結(jié)論

本探究發(fā)現(xiàn)褐飛虱取食脅迫后，‘月亮谷’稻株內(nèi)可溶性糖含量下降42.85%，與抗蟲品種‘RHT’(-39.46%)無明顯差異，而顯著小于感蟲品種‘TN1’(-21.78%)；H2O2含量增加9.39%，低于感蟲品種‘TN1’42.25%)而顯著高于抗蟲品種RHT(-19.74%)；MDA平均含量增加10.77%，增加率顯著低于‘TN1’(87.81%)和‘RHT’(32.31%)；多酚氧化酶(PPO)平均活性增加49.96%，過氧化物酶(POD)活性下降，其中PPO平均活性增加率(49.96%)與‘RHT’(0.89%)無明顯差異，而顯著低于‘TN1’(241.87%)；POD平均活性下降增加率(-14.75%)均顯著低于‘RHT’(1.75%)但高于‘TN1’(-45.01%)。云南哈尼族地方水稻品種‘月亮谷’通過試驗(yàn)測定的各項(xiàng)生理指標(biāo)均與抗蟲品種‘RHT’反應(yīng)較相似，具有良好的防御系統(tǒng)應(yīng)對褐飛虱的取食為害，云南地方水稻品種‘月亮谷’可作為良好的抗褐飛虱育種材料應(yīng)用于水稻生產(chǎn)。