普天磊，韓學琴，羅會英，鄧紅山，廖承飛，范建成，何 璐，金 杰

（云南省農(nóng)業(yè)科學院熱區(qū)生態(tài)農(nóng)業(yè)研究所，元謀干熱河谷植物園，云南 元謀 651300）

0 引言

辣木(Moringa oleiferaLam.)是辣木科辣木屬的多年生落葉喬木，生長迅速，耐干旱貧瘠，環(huán)境適應性強，是熱帶亞熱帶地區(qū)的速生樹種。辣木有13個種，原產(chǎn)于印度、肯尼亞、尼日利亞等國家，在中國云南、福建、廣東、海南等地均有種植[1-2]。辣木含有豐富的礦物質(zhì)、氨基酸、維生素、不飽和脂肪酸等營養(yǎng)成分和多糖、黃酮、酚酸、萜類等功能性成分[3-4]，具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗炎等多種生理功能[5]，在食品、飼料和醫(yī)藥等行業(yè)應用廣泛，享有“奇跡之樹”的美譽[6]。辣木屬于新興的產(chǎn)業(yè)資源，相關育種及豐產(chǎn)栽培技術研究尚處于初級階段，推進優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)辣木品種的培育具有重要意義。

花粉活力的強弱是影響植物雜交育種、性狀改良以及豐產(chǎn)栽培的重要因素之一，花粉活力的測定方法主要有I2-KI染色法、氯化三苯四氮唑法（TTC法）、醋酸洋紅染色法、離體萌發(fā)法等，其中離體萌發(fā)法是目前評價花粉活力較為直觀和準確的方法，在植物的育種研究中應用廣泛[7-8]。目前關于花粉萌發(fā)條件優(yōu)化的報道多集中于核桃、茶樹、睡蓮等植物，其中，核桃花粉離體培養(yǎng)基最佳組合為200 g/L蔗糖，500 mg/L硼酸，20 mg/L氯化鈣[9]；茶樹花粉離體萌發(fā)最佳培養(yǎng)基為150 g/L蔗糖，150 mg/L硼酸，100 mg/L硝酸鈣[10]；睡蓮花粉為100 g/L蔗糖，20或40 mg/L硼酸，20 mg/L氯化鈣[11]；辣木花藥細小，花粉黏在花藥上不易分離觀測，本研究采用的液體離體萌發(fā)法，有助于花粉分散，然而目前并沒有辣木花粉離體萌發(fā)相關的報道。本文優(yōu)化辣木花粉的離體培養(yǎng)基以及測定不同辣木材料的花粉活力，旨在為辣木雜交育種及豐產(chǎn)栽培研究中的育種親本選擇提供技術支撐，以促進辣木優(yōu)良種質(zhì)資源的開發(fā)和利用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗區(qū)概況 試驗地點位于云南省楚雄自治州元謀縣云南省農(nóng)業(yè)科學院熱區(qū)生態(tài)農(nóng)業(yè)研究所辣木創(chuàng)新基地（25.69°N，101.87°E，海拔1118.1 m），株行距為2 m×2.5 m，該地屬于季風型河谷干熱氣候，多年平均氣溫21.9℃，年降水量520 ～590 mm，年蒸發(fā)量4000 ～4300 mm，年日照時數(shù)2550 ～2744 h，具有“炎熱干燥、降水集中、干濕季分明”的氣候特征[12]。

1.1.2 材料 試驗材料于天氣晴朗的早晨9:00點時取樣，選取長勢良好、無病蟲害的辣木植株，摘取盛開的辣木花朵帶回實驗室，小心用鑷子撥開花瓣，分離出花藥，用于花粉培養(yǎng)基篩選與不同材料的辣木花粉活力比較試驗。

1.2 方法

1.2.1 花粉離體萌發(fā)法 取9粒新鮮采集的辣木花藥置于EP小管中，使用移液器向管中加入300 μL培養(yǎng)液，將花粉輕輕剝落使花粉粒分散于培養(yǎng)液，并置于墊濕濾紙的培養(yǎng)皿中，避光條件下自然培養(yǎng)，定時觀察，直至花粉萌發(fā)率穩(wěn)定，觀察前先將花粉培養(yǎng)基輕輕混勻，再使用移液器吸取適量滴在載玻片上，并用顯微鏡進行鏡檢，每個玻片隨機選取5個不重復的視野，每個視野的花粉數(shù)不少于150粒，各處理重復3次，統(tǒng)計視野內(nèi)的花粉總數(shù)和花粉萌發(fā)數(shù)，以每個處理的平均值代表相關結(jié)果，辣木花粉活力的計算見公式(1)：

1.2.2 培養(yǎng)基篩選 在前期預實驗的基礎上，以100 g/L蔗糖，100 mg/L硼酸，100 mg/L氯化鈣作為基本培養(yǎng)基，探討不同濃度蔗糖、硼酸、氯化鈣對花粉萌發(fā)的影響。其中，蔗糖設定5個濃度梯度，分別為：50、100、150、200、250 g/L；硼酸設定的5個濃度梯度為：50、100、150、200、250 mg/L；氯化鈣設定的5個濃度梯度為：100、200、300、400、500 mg/L。在單因素試驗的基礎上，以蔗糖(150、175、200 g/L)、硼酸(100、125、150 mg/L)、氯化鈣(300、400、500 mg/L)進行4因素3水平共9個組合L9(43)的正交試驗，每個組合進行3次重復試驗，依據(jù)花粉萌發(fā)率篩選出辣木花粉的最佳萌發(fā)培養(yǎng)基。

1.2.3 不同辣木材料的花粉活力測定 選取長勢良好，辣木籽產(chǎn)量大及不同種源的辣木材料，其中YMLM-2、6、8、9、10、25是楚雄綜合試驗站自選育的材料，YMLM-27、29、30分別是來自于肯尼亞、馬里、美國的材料，對上述辣木材料的花粉活力進行測定，可為不同辣木材料的開花座果研究和雜交育種親本選擇研究奠定基礎。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 采用Image-Pro Plus軟件統(tǒng)計視野內(nèi)的花粉總數(shù)和花粉萌發(fā)數(shù)，采用Excel軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，GraphPad Prism 6軟件進行作圖，SAS 9.0軟件進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣木花粉萌發(fā)形態(tài)及過程

辣木花粉呈類球形，共有3個萌發(fā)孔，通常情況下每個辣木花粉粒僅一個花粉萌發(fā)孔萌發(fā)出花粉管，并形成4種不同時期的萌發(fā)狀態(tài)。其中，辣木花粉萌發(fā)初期，花粉粒一側(cè)隆起透明狀凸起，隨著萌發(fā)時間的延長，凸起部位逐漸增長，形成花粉管，花粉粒中的內(nèi)含物會進入其中，均勻分布并逐漸充滿于整個花粉管，形成萌發(fā)中期和后期的形態(tài)。此外，在同一處理的辣木花粉中，未萌發(fā)、萌發(fā)初期、萌發(fā)中期、萌發(fā)后期4種狀態(tài)的辣木花粉粒均可同時存在（圖1）。

圖1 辣木花粉萌發(fā)圖

2.2 不同培養(yǎng)基組分對辣木花粉萌發(fā)的影響

不同濃度的氯化鈣處理中，辣木花粉萌發(fā)率較高的區(qū)域集中于300、400、500 mg/L三個濃度，其中當氯化鈣濃度為400 mg/L時，花粉萌發(fā)率顯著高于其他處理，值為4.61%。氯化鈣濃度為200 mg/L時，花粉萌發(fā)率最低，為3.80%，且與300、500 mg/L濃度差異不顯著。不同硼酸濃度處理呈現(xiàn)出中間高、兩頭低的分布趨勢，50、200、250 mg/L三種硼酸處理濃度的花粉萌發(fā)率在3.45% ～3.60%之間，三者之值差異不顯著，且它們的花粉萌發(fā)率顯著低于100和150 mg/L兩個處理，當硼酸濃度為150 mg/L時，辣木花粉萌發(fā)率最高，值為7.16%。當蔗糖濃度為150 g/L時，花粉萌發(fā)率顯著高于其余處理，為7.85%；當蔗糖濃度達200 g/L以上時，辣木花粉萌發(fā)率逐漸降低，但無顯著性差異；蔗糖濃度為100 g/L時，花粉萌發(fā)率最低，值為3.99%（圖2）。

圖2 辣木花粉離體萌發(fā)的單因素試驗結(jié)果

2.3 正交試驗處理對辣木花粉萌發(fā)的影響

單因素試驗表明，辣木花粉在400 mg/L氯化鈣，150 mg/L硼酸，150 g/L蔗糖的培養(yǎng)基中萌發(fā)表現(xiàn)較好，為了減弱這3個因素之間的交互作用，選取對花粉萌發(fā)影響較大的水平進行正交試驗，確定萌發(fā)培養(yǎng)基的最佳濃度組合（表1）。試驗發(fā)現(xiàn)3個因素對辣木花粉管萌發(fā)率的影響從大到小的排列順序為：蔗糖質(zhì)量濃度＞氯化鈣質(zhì)量濃度＞硼酸質(zhì)量濃度。正交試驗得出的最佳組合是A2B2C3，即氯化鈣400 mg/L，蔗糖175 g/L，硼酸150 mg/L。對9組正交試驗的花粉萌發(fā)率進行方差分析，結(jié)果表明第5處理的花粉萌發(fā)率顯著高于其余處理，第2、6、9處理的花粉萌發(fā)率顯著高于第1、3、7處理，且第2處理與第9處理間差異不顯著，同時，第3處理與第7處理的花粉萌發(fā)率差異不顯著，第1處理的花粉萌發(fā)率顯著低于其余處理。對上述正交試驗結(jié)果進行方差分析，詳見表2。結(jié)果表明，氯化鈣和蔗糖兩個因素對辣木花粉萌發(fā)有顯著性意義(P＜0.05)，而硼酸濃度對辣木花粉萌發(fā)無顯著性意義。

表1 影響辣木花粉萌發(fā)的L9(43)正交試驗結(jié)果

表2 花粉管離體萌發(fā)的正交試驗方差分析

2.4 不同辣木材料的花粉活力

利用上面的配方對候選親本材料的花粉萌發(fā)活力進行了測定，發(fā)現(xiàn)不同辣木材料間花粉萌發(fā)率間差別較大，其中YMLM-30的花粉萌發(fā)率最高，為12.34%，YMLM-27的花粉萌發(fā)率最低，為4.66%，YMLM-2、25、8的花粉萌發(fā)率顯著高于YMLM-9、6、10、29、27，且YMLM-6、10、29的花粉萌發(fā)率差異不顯著。不同種源的辣木中，美國種源的花粉萌發(fā)率最高(12.34%)，其次為馬里種源，值為5.77%，最低為肯尼亞種源，花粉萌發(fā)率為4.66%。

圖3 不同辣木材料的花粉萌發(fā)率測定結(jié)果

3 討論與結(jié)論

前期預實驗分別采用了I2-KI染色法、氯化三苯四氮唑法（TTC法）、離體固體培養(yǎng)基萌發(fā)法測定辣木的花粉活力，其中I2-KI染色法的測定原理是：有活力的花粉會積累淀粉，可被I2-KI溶液染成藍色，發(fā)現(xiàn)試驗用辣木花粉幾乎未染成藍色而呈黃色。TTC法是利用有活力的花粉呼吸作用強，產(chǎn)生的脫氫酶可將TTC由無色還原成紅色的原理，從而可將花粉染成紅色，試驗發(fā)現(xiàn)TTC溶液不能將辣木花粉染成紅色，僅使花粉顏色變淺，上述試驗發(fā)現(xiàn)這兩種染色法均不能很好的判斷上述辣木材料的花粉活力有無。辣木花藥細小，長度約為1 mm，且其花粉黏在花藥上，干燥后不易分離，培養(yǎng)于固體培養(yǎng)基上的花粉粒相互粘連，不利于花粉總數(shù)統(tǒng)計，故本研究采用離體液體培養(yǎng)法對辣木的花粉活力進行測定。

本實驗采用的花粉萌發(fā)培養(yǎng)基中，加入了蔗糖、氯化鈣、硼酸3種基質(zhì)，其中，蔗糖是花粉萌發(fā)的主要碳源，不僅可為花粉管細胞分裂和生化過程提供主要營養(yǎng)物質(zhì)來源，而且還可用于維持滲透壓[13-15]。高濃度的蔗糖培養(yǎng)基會造成黃牡丹花粉的原生質(zhì)體萎縮，出現(xiàn)質(zhì)壁分離的現(xiàn)象[16]，本研究單因素試驗發(fā)現(xiàn)辣木花粉在150 g/L蔗糖濃度時無質(zhì)壁分離的現(xiàn)象，且最有利于辣木花粉萌發(fā)。鈣離子是花粉萌發(fā)和花粉管生長過程中所需的重要物質(zhì)成分和信號分子[17]，適宜的鈣離子濃度有助于辣木花粉萌發(fā)。Hofer等[18]發(fā)現(xiàn)，蘋果花粉萌發(fā)孔附近的鈣離子濃度最大，尚忠林等[19]也發(fā)現(xiàn)百合花粉管在生長過程中會吸收大量培養(yǎng)基中的鈣離子，若減少鈣離子含量，百合花粉萌發(fā)亦隨之減少。本研究發(fā)現(xiàn)400 mg/L氯化鈣濃度較利于辣木花粉萌發(fā)。硼離子會增加細胞內(nèi)的游離鈣離子，使其達到啟動花粉萌發(fā)的最佳濃度[20]；同時還可參與花粉管壁的形成、花粉管囊泡運輸、碳水化合物吸收以及酚類物質(zhì)代謝等生理生化過程[21]，當硼酸濃度為150 mg/L時，較為適宜辣木花粉萌發(fā)。

不同辣木材料間的花粉萌發(fā)率差異顯著，辣木花粉的萌發(fā)率不僅與品種有關，還與花粉的采集時間有關，相關學者也有類似的試驗發(fā)現(xiàn)?？椎聜}等[22]發(fā)現(xiàn)不同發(fā)育時期對棗花粉萌發(fā)率具有顯著影響，且不同棗品種在不同發(fā)育期的花粉活力有顯著差異。黃瓊等[23]對4種散粉時期的薄殼山核桃花粉活力進行比較，發(fā)現(xiàn)散粉盛期的花粉活力最強。與此同時，改變培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間等參數(shù)，會使辣木花粉萌發(fā)率隨之改變。楊瀾等[24]探討培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間對多肉植物花粉萌發(fā)的影響，發(fā)現(xiàn)12 ～28℃有利于提高花粉管萌發(fā)率。常海龍等[25]表明甘蔗花粉萌發(fā)率和花粉管發(fā)育對溫度十分敏感，28 ～30℃花粉萌發(fā)率高且花粉管生長速度快。后續(xù)試驗會繼續(xù)對辣木花粉的最佳采集時間、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間等參數(shù)進行探討，另在進行不同材料或品種的花粉活力比較時，也需充分考慮上述參數(shù)對花粉萌發(fā)的影響，可對影響因素進行初步篩選并固定，再在同一條件下進行花粉活力比對。

本試驗采用單因素和正交試驗確立了辣木花粉萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基，即175 g/L蔗糖，400 mg/L氯化鈣，150 mg/L硼酸。并用該培養(yǎng)基測定了9種產(chǎn)量表現(xiàn)佳及不同種源的辣木材料，其中YMLM-30的花粉萌發(fā)率最高，為美國種源，YMLM-27的花粉萌發(fā)率最低，為肯尼亞種源。