羅先富，劉文強(qiáng)，潘孝武，董 錚，劉三雄，劉利成，陽(yáng)標(biāo)仁，盛新年，李小湘

（湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所/農(nóng)業(yè)部長(zhǎng)江中下游秈稻遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410125）

0 引言

水稻是世界上主要的糧食作物之一，株高是影響水稻產(chǎn)量的重要農(nóng)藝性狀。根據(jù)高度不同，一般將水稻分為高稈、半矮稈和矮稈。20世紀(jì)50年代，被譽(yù)為第一次“綠色革命”的半矮稈基因sd1的成功應(yīng)用使水稻單產(chǎn)提高了20% ～30%。隨后在水稻單產(chǎn)實(shí)現(xiàn)第二次飛躍的三系雜交稻育種中，雜交稻的親本也多采用半矮化材料。當(dāng)前，株型的改良是提高水稻產(chǎn)量的一條重要途徑，而株高是水稻株型改良的重要因子。此外，目前生產(chǎn)上應(yīng)用的半矮稈品種基本都攜帶隱性基因sd1，單一基因的廣泛應(yīng)用存在遺傳多樣性喪失的潛在風(fēng)險(xiǎn)。因此，開展株高基因的定位和克隆，應(yīng)用分子標(biāo)記輔助選擇培育適宜高度的水稻品種，具有十分重要的意義。

水稻株高的遺傳主要由微效多基因控制的數(shù)量性狀及主基因控制的質(zhì)量性狀。經(jīng)典遺傳學(xué)將控制株高的基因作為一個(gè)整體進(jìn)行研究。林鴻宣等[1]發(fā)現(xiàn)粳稻‘雪禾矮早’攜帶有與sd-1不等位的隱性矮稈基因sd-s(t)。顧銘洪等[2]從‘桂陽(yáng)矮1號(hào)’中發(fā)現(xiàn)了與sd-1不等位的隱性矮稈基因sd-g。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，許多研究者利用分子標(biāo)記鑒定了一系列的控制株高基因，目前已有70多個(gè)矮稈和半矮稈基因被定位(www.gramene.org)。羅炬等[3]利用重組自交系群體在水稻6條染色體上定位到控制株高的QTL，其中qPH2和qPH3在不同環(huán)境下均能檢測(cè)到，并進(jìn)一步精細(xì)定位qPH3在204 Kb區(qū)間。趙明芳等[4]利用構(gòu)建的水稻染色體片段代換系群體共定位到3個(gè)株高相關(guān)QTL，分布在第4和第6染色體上。

近些年，矮稈和半矮稈相關(guān)基因相繼被克隆。2002年，3個(gè)研究小組分別圖位克隆了半矮稈“綠色革命基因”sd1，該基因編碼由389個(gè)氨基酸組成的GA20氧化酶，參與赤霉素的生物合成。SD1突變導(dǎo)致突變體植株內(nèi)源赤霉素含量降低，植株基部節(jié)間變短[5-7]。矮稈基因d1由于堿基缺失突變喪失了編碼GTP結(jié)合蛋白功能，從而導(dǎo)致赤霉素信號(hào)傳導(dǎo)受阻，水稻發(fā)生矮化[8]。另一個(gè)矮稈基因d61的突變導(dǎo)致油菜素內(nèi)酯及其受體的合成受阻，造成水稻矮化[9]。D11編碼BR生物合成過(guò)程的一種P450關(guān)鍵酶，它的突變導(dǎo)致油菜素內(nèi)酯合成受阻，上部第二節(jié)間不伸長(zhǎng)，植株矮化[10]。D27編碼一個(gè)由278個(gè)氨基酸組成的含鐵蛋白，d27突變體中第4外顯子發(fā)生4 bp缺失，造成株高矮化，分蘗數(shù)增多[11]。DLT編碼一個(gè)由617氨基酸組成的植物特有的GRAS家族蛋白，DLT參與BR信號(hào)傳導(dǎo)，同時(shí)還參與BR合成的反饋抑制。DLT突變導(dǎo)致水稻矮化，分蘗變少[12]。水稻矮稈突變體brd1與OsBR6ox共分離，OsBR6ox編碼BR-6氧化酶。突變體brd1莖稈嚴(yán)重矮化，株高10 ～30 cm[13]。SLR1編碼產(chǎn)物是GA信號(hào)傳導(dǎo)的中間調(diào)節(jié)因子，屬于GRAS基因超家族，SLR1調(diào)控水稻的分蘗和株高[14]。GID1包含2個(gè)外顯子，編碼一條由354氨基酸組成的多肽。gid1突變體株高嚴(yán)重矮化、不育[15]。GID2編碼一個(gè)SCF E3復(fù)合體的一個(gè)F-box亞基，介導(dǎo)水稻中GA的信號(hào)傳導(dǎo)。gid2突變體嚴(yán)重矮化、葉片變寬、不育[16]。

盡管一些株高相關(guān)的QTL已被精細(xì)定位和克隆，但大部分QTL仍處于精度較低的初定位，所檢測(cè)到的QTL大多界定在基因組的一個(gè)較大區(qū)間，仍需要進(jìn)一步驗(yàn)證和縮小區(qū)間。此外，克隆的大多數(shù)株高基因都是屬于矮稈和半矮稈基因，高稈基因的精細(xì)定位和克隆少有報(bào)道。剩余雜合體指的是從高代群體中篩選到的在目標(biāo)區(qū)間表現(xiàn)雜合、其他區(qū)間基本純合的單株。它相當(dāng)于近等基因系材料配對(duì)雜交產(chǎn)生的F1材料，自交后獲得的群體在目標(biāo)區(qū)間呈現(xiàn)分離、其他區(qū)間保持純合。利用剩余雜合體的特點(diǎn)，本研究從‘Katy’/‘湘743’的高代自交群體中篩選出一個(gè)高稈的剩余雜合體RHL1030，以RHL1030自交衍生群體為實(shí)驗(yàn)材料，開展株高QTL定位。

1 材料與方法

1.1 群體構(gòu)建及標(biāo)記檢測(cè)

群體構(gòu)建如圖1所示，‘Katy’和‘湘743’雜交后代通過(guò)單粒傳到F10代，經(jīng)標(biāo)記檢測(cè)，篩選出一個(gè)在第1染色體RM11383-RM1198區(qū)間雜合（約12 Mb）、背景基本純合的剩余雜合體RHL1030。收獲其自交種子，經(jīng)目標(biāo)區(qū)間標(biāo)記檢測(cè)，從RHL1030自交群體RHL1030P中篩選出雜合區(qū)間分別為RM3411-RM11782、RM6703-RM1198的兩個(gè)單株RHL1030P-13和RHL1030P-58，所覆蓋的物理圖譜位置分別為31.31-34.17 Mb 和 34.51-37.6 Mb(www.gramene.org)，收獲其自交種子種植，獲得2個(gè)F2群體RHL1030P-13P和RHL1030P-58P。經(jīng)SSR標(biāo)記檢測(cè)從RHL1030P-58P群體中篩選4個(gè)單株2-5，10-7，13-1和5-4。自交這4個(gè)單株，獲得4個(gè)對(duì)應(yīng)的F2群體XK2-5、XK10-7、XK13-1和XK5-4。經(jīng)標(biāo)記檢測(cè)，分別從每個(gè)群體中篩選母本純合型、父本純合型及雜合型材料各40株。

圖1 群體構(gòu)建示意圖

本研究應(yīng)用的標(biāo)記均為SSR標(biāo)記，采用盧等[17]的方法提取DNA，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用6%的非變性聚丙烯酰胺檢測(cè)。

1.2 性狀考察

2019年夏在湖南農(nóng)科院水稻研究所長(zhǎng)沙實(shí)驗(yàn)基地種植132個(gè)單株組成的RHL1030P群體。2019—2020年在海南三亞基地種植RHL1030P-13P群體和RHL1030P-58P群體，分別包含191和151個(gè)單株。2020年夏在湖南農(nóng)科院水稻研究所長(zhǎng)沙實(shí)驗(yàn)基地種植XK2-5群體192株、XK10-7群體154株、XK13-1群體192株和XK4-3群體192株。株行距20×20 cm，正常田間管理。成熟后，記載群體株高。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用MAPMAKER(EXP3.0b)[18]作圖軟件，構(gòu)建RHL1030P、RHL1030P-13P和RHL1030P-58P群體的區(qū)域連鎖圖譜，用Kosambi函數(shù)將重組率轉(zhuǎn)化成遺傳距離(cM)。應(yīng)用 Windows QTL Cartographer 2.5[19]檢測(cè)RHL1030P、RHL1030P-13P和RHL1030P-58P群體株高QTL。用SPSS對(duì)株高性狀進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 株高QTL定位

應(yīng)用RHL1030P群體分離區(qū)間的7個(gè)SSR標(biāo)記（RM11383、RM3411、RM297、RM212、RM6703、RM5389和RM1198）進(jìn)行連鎖分析，構(gòu)建了第1染色體目標(biāo)區(qū)間的連鎖圖譜，跨越25.1 cM。該群體QTL分析顯示，檢測(cè)到一個(gè)株高QTL，LOD值8.8，貢獻(xiàn)率55.56%（圖2）。表現(xiàn)加性效應(yīng)為主，增效等位基因來(lái)自于父本‘湘743’。

圖2 利用RHL1030P群體（上）和RHL1030P-58P群體（下）進(jìn)行株高QTL分析

為了進(jìn)一步驗(yàn)證和分解目標(biāo)區(qū)間，增加在‘Katy’和‘湘743’間呈現(xiàn)多態(tài)性的SSR標(biāo)記RM11782。利用該標(biāo)記從RHL1030P群體中篩選雜合區(qū)間分別為RM3411-RM11782和RM6703-RM1198的兩個(gè)單株RHL1030P-13和RHL1030P-58，進(jìn)一步自交發(fā)展了兩個(gè)對(duì)應(yīng)分離群體RHL1030P-13P和RHL1030P-58P。應(yīng)用這兩個(gè)群體分別進(jìn)行株高QTL分析。結(jié)果顯示RHL1030P-13P群體沒(méi)有檢測(cè)到有顯著差異的QTL。RHL1030P-58P群體檢測(cè)到一個(gè)顯著差異的QTL，LOD值33.8，貢獻(xiàn)率46.1%，增效等位基因來(lái)自于‘湘743’（圖2）。

2.2 以染色體片段代換系效應(yīng)差異為基礎(chǔ)的QTL定位

為了進(jìn)一步分解RM6703-RM1198區(qū)間，篩選并添加了一個(gè)多態(tài)性SSR標(biāo)記RM8085，利用該標(biāo)記從RHL1030P-58P群體中篩選到RM6703-RM8085區(qū)間雜合的3個(gè)單株2-5、10-7、13-1及RM5389-RM1198區(qū)間雜合的單株5-4。從這4個(gè)單株自交一代的群體中分別篩選分離區(qū)間為母本純合型、父本純合型及雜合型的單株各40株，組成4套3種不同基因型材料。通過(guò)對(duì)每一套不同基因型材料表型性狀進(jìn)行顯著性分析，判斷雜合區(qū)間是否存在顯著QTL效應(yīng)。

方差分析結(jié)果表明，雜合區(qū)間RM6703-RM8085分離的3個(gè)群體（XK2-5、XK10-7、XK13-1）的3種不同基因型間存在顯著性差異，表明該區(qū)間存在控制株高QTL。3個(gè)群體 XK2-5、XK10-7、XK13-1檢測(cè)到的QTL增效等位基因均來(lái)自于父本‘湘743’，且以加性效應(yīng)為主，貢獻(xiàn)率分別為63.1%、69.2%和74.1%。雜合區(qū)間RM5398-RM1198分離的XK5-4群體3種不同基因型間沒(méi)有顯著性差異。結(jié)果表明株高QTL位于RM6703-RM8085區(qū)間分離的群體。

表1 2個(gè)區(qū)間在同質(zhì)遺傳背景下對(duì)株高性狀的作用

3 討論與結(jié)論

QTL分析在水稻重要農(nóng)藝性狀上已經(jīng)有較多報(bào)道。但在初級(jí)定位群體中，由于遺傳背景復(fù)雜，很難將QTL定位到一個(gè)精準(zhǔn)的區(qū)間。針對(duì)初定位QTL區(qū)間，利用分子標(biāo)記選擇重組染色體片段代換系，在同質(zhì)遺傳背景下分析其性狀表型差異，將目標(biāo)QTL界定于更狹小的區(qū)間，是復(fù)雜性狀QTL精細(xì)定位的常用方法。本研究在前期發(fā)現(xiàn)剩余雜合體衍生群體(RHL1030P)有株高分離的情況下進(jìn)行株高QTL分析，結(jié)果在RM11383-RM1198區(qū)間鑒定到一個(gè)控制株高QTL。進(jìn)而從該群體篩選不同重組單株進(jìn)一步發(fā)展群體，在RM6703-RM1198區(qū)間依然能夠檢測(cè)到該QTL，加性效應(yīng)與初定位結(jié)果一致，且進(jìn)一步縮小了目標(biāo)區(qū)間。同理，在RM6703-RM1198區(qū)間分離群體中篩選不同重組單株自交，通過(guò)方差分析將控制株高QTL界定在RM11782-RM5389區(qū)間。通過(guò)gramene網(wǎng)站查詢發(fā)現(xiàn)，在該區(qū)間并沒(méi)有控制株高基因的報(bào)道，表明本研究定位的株高相關(guān)QTL是一個(gè)新位點(diǎn)。

QTL定位的精細(xì)程度部分取決于多態(tài)性標(biāo)記的數(shù)量。本研究證實(shí)RM6703-RM8085(34.51M ～34.86 Mb)區(qū)間分離群體包含株高QTL。由于考慮到標(biāo)記兩側(cè)的重組區(qū)域，目標(biāo)QTL實(shí)際界定于RM11782-RM5389區(qū)間，覆蓋的物理圖譜位置為34.17M ～35.73Mb。相較于RM6703-RM8085(34.51M ～34.86 Mb)區(qū)分離區(qū)間，株高QTL區(qū)間仍然較大。筆者篩選了RM8085-RM5389區(qū)間所有的SSR標(biāo)記和In/Del標(biāo)記，擬開展更精細(xì)的定位，遺憾的是沒(méi)有篩選到多態(tài)性標(biāo)記。下一步擬開發(fā)其他標(biāo)記如Caps標(biāo)記等進(jìn)一步更精細(xì)定位株高QTL。

QTL定位受環(huán)境影響很大，相同的群體在不同的環(huán)境可能檢測(cè)到不同QTL。本研究初定位群體RHL1030P種植在長(zhǎng)沙，驗(yàn)證群體RHL1030P-58P群體種植在海南，均能檢測(cè)到目標(biāo)株高QTL，且貢獻(xiàn)率較高，表明該QTL是一個(gè)穩(wěn)定表達(dá)的主效位點(diǎn)。此外，在篩選剩余雜合體時(shí)，是從自交F10代開始，理論上基因組背景絕大部分純合。因此，沒(méi)有考慮目標(biāo)區(qū)間外的基因組背景。XK2-5、XK10-7、XK13-1群體是在前期F10基礎(chǔ)上繼續(xù)自交兩代后形成，但這3個(gè)群體在株高上仍表現(xiàn)明顯的差異。這些結(jié)果表明盡管剩余雜合體是高代自交系，但遺傳背景可能仍然存在分離。值得一提的是在XK2-5、XK10-7、XK13-1群體中，除了株高分離外，抽穗期也明顯發(fā)生了分離，表明該雜合區(qū)間存在控制抽穗期相關(guān)基因。前期有報(bào)道Ghd7控制株高的同時(shí)也影響抽穗期[20]，本研究定位的株高QTL是有兩個(gè)控制不同性狀的基因連鎖亦或是一因多效還需對(duì)區(qū)間進(jìn)一步分解。

本研究利用剩余雜合體自交衍生的群體定位到一個(gè)新的控制株高QTL，表明從高代群體中挑選剩余雜合體進(jìn)行QTL精細(xì)定位是可行的。另一方面，鑒定的株高QTL為改良水稻株型提供更多選擇。