鄭 超，皮勁松，吳艷，魏文焯，梁振華，杜金平，劉靜波，張昊*

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室，湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心，湖北武漢 430064；2.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽 621010）

應(yīng)激不僅造成蛋鴨一定程度的腸組織損傷，而且還增加腸道炎癥損傷因子的表達，體現(xiàn)為蛋鴨采食量下降、體重降低，產(chǎn)蛋性能下降，養(yǎng)殖后期死淘率增加等。腸黏膜是機體抵御致病菌原損傷的第一道防線，也是應(yīng)激的重要靶器官。在應(yīng)激時，腸黏膜易發(fā)生缺血、缺氧，腸道通透性增加，導(dǎo)致屏障功能受損，危害機體健康。腸上皮細(xì)胞之間的緊密連接形成緊密的屏障可防止腸腔內(nèi)病原體和內(nèi)毒素侵入體內(nèi)，而適當(dāng)?shù)纳掀て琳铣墒鞂τ谀c道防御和體內(nèi)平衡至關(guān)重要。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路是氧化應(yīng)激反應(yīng)中基因轉(zhuǎn)錄的主要調(diào)節(jié)劑，在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮重要作用，例如細(xì)胞生長、分化、凋亡和對環(huán)境刺激的應(yīng)激反應(yīng)。p38 是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族的成員，是促炎性細(xì)胞因子通路中的關(guān)鍵酶，與p38 具有結(jié)構(gòu)和功能同源性的MAPK 包括c-Jun 氨基末端激酶（JNK）、胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶5/大絲裂原活化蛋白激酶1（ERK5/BMK1）。SB203580是一種特定的p38MAPK 抑制劑，通過直接或間接競爭性與p38a、P 亞基上具有ATP 酶活性的結(jié)合位點結(jié)合，使p38MAPK 失去與ATP 結(jié)合的能力，從而使其失去激酶活性，實現(xiàn)對p38MAPK 信號通路的抑制作用。鑒于腸道作為應(yīng)激應(yīng)答的重要靶器官，MAPK 信號通路在應(yīng)激蛋鴨腸屏障功能的調(diào)節(jié)作用需要明確。原代鴨小腸上皮細(xì)胞具有與體內(nèi)腸上皮細(xì)胞基本結(jié)構(gòu)、代謝和功能相當(dāng)?shù)奶攸c，是研究腸道應(yīng)激反應(yīng)調(diào)控機制的良好模型。研究表明，p38MAPK 信號通路涉及氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)，并且與腸上皮屏障功能密切相關(guān)。本試驗通過HO建立鴨小腸上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激模型，采用MAPK 信號通路抑制劑（SB203580）研究其對蛋鴨小腸上皮細(xì)胞細(xì)胞活力、跨膜電阻、氧化應(yīng)激相關(guān)基因以及緊密連接蛋白mRNA 相對表達量的影響，以明確MAPK 信號通路在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的鴨腸上皮屏障功能障礙中的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計 試驗取26 日齡鴨胚的小腸組織，參照Zhang 等方法進行細(xì)胞培養(yǎng)和氧化應(yīng)激處理。去除腸系膜及胰腺，將小腸剖開、清洗、剪碎后，用I 型膠原酶對小腸組織消化60 min 后，吹打細(xì)胞團獲得鴨小腸上皮細(xì)胞，將細(xì)胞進行差速貼壁培養(yǎng)，收集小腸上皮細(xì)胞，鋪板培養(yǎng)。試驗分為空白對照組（A 組）、陽性對照組（50 μmol/L HO，B 組）和氧化應(yīng)激基礎(chǔ)上添加MAPK 信號通路抑制劑組（10 μmol/L SB203580，C 組），每組3個重復(fù)。待36 h 后細(xì)胞布滿培養(yǎng)板，B 組和C 組50 μmol/L HO處理細(xì)胞4 h 構(gòu)建氧化應(yīng)激模型，C 組添加10 μmol/L SB203580，為試驗0 h。

1.2 細(xì)胞活力測量 使用CCK-8（Dojindo，Japan）測量細(xì)胞活力。將小腸上皮細(xì)胞以1 × 10細(xì)胞/孔接種于96 孔板中，將未分配細(xì)胞的孔用作空白對照，每組6個重復(fù)。測量各孔細(xì)胞12、24、36 h 細(xì)胞活力，將10 μL CCK-8 溶液加入細(xì)胞中，并將細(xì)胞在37℃下孵育1 h。使用酶標(biāo)儀（Bio-Rad，Hercules，CA）測量各孔在450 nm 處的吸光度。使用以下公式計算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率=（試驗孔吸光度-空白孔吸光度）/（對照孔吸光度-空白孔吸光度）×100%。

1.3 跨上皮細(xì)胞電阻（TEER）測量 在Transwell12孔板中培養(yǎng)細(xì)胞至分化成熟，然后分別測其0、12、24、36 和48 h 阻值的變化情況，每組3個重復(fù)。細(xì)胞處理后使用細(xì)胞電阻儀 （millicell ERS-2,Millipore，USA）測定Transwell12孔板（Corning，USA）上室內(nèi)細(xì)胞的TEER 值。測量各組0、12、24、36 h 和48 h TEER 值，每組3個重復(fù)。設(shè)置2個空白對照組（上室內(nèi)未接種腸上皮細(xì)胞），加入相同基礎(chǔ)培養(yǎng)基，每孔選定3個點，測定3 次，取平均值，再減去空白對照組的平均電阻值，即為該孔的TEER。

1.4 FITC-右旋糖苷透過率檢測腸上皮細(xì)胞單層通透性TEER 測量試驗結(jié)束后，上室加入200 μL 含有0.5 mg/mL FITC-右旋糖苷的無酚紅1640 培養(yǎng)基，下室加入600 μL 無酚紅1640 培養(yǎng)基（不含F(xiàn)ITC-右旋糖苷）。于37℃，5%CO培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育60 min，每孔上、下室分別取100 μL 培養(yǎng)基至黑色96 孔板，檢測樣品的熒光強度（激發(fā)光波長485 nm，發(fā)射光波長535 nm）。腸上皮細(xì)胞對FITC-右旋糖苷通透性用通透性系數(shù)Pa 表示，按如下公式計算：

Pa=[A]/t × 1/A × V/[L]，其中[A]為下室熒光值，t 為孵育時間（以秒計算），A 為上室濾膜面積（以cm表示），V 為下室液體量，[L]為上室熒光值。試驗結(jié)果均以Pa/Pc × 100%表示。

1.5 細(xì)胞RNA 提取與反轉(zhuǎn)錄 氧化應(yīng)激模型構(gòu)建后，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞12 h，將細(xì)胞樣從培養(yǎng)箱中取出，用PBS輕洗2 遍，采用TRIzol提取細(xì)胞RNA。核酸蛋白測定儀（NanoPhotometer-N60，Implen，GER）測定其吸光度（OD）值，樣品OD在1.8～2.2 可用于后續(xù)試驗，cDNA 合成按Thermo scientific 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（K1622,Thermo,USA）說明書操作，反轉(zhuǎn)錄后的cDNA 于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 氧化應(yīng)激相關(guān)基因和小腸緊密連接蛋白mRNA 相對表達量的測定 引物設(shè)計：從NCBI 上下載鴨的、核因子E2 相關(guān)因子2（）、血紅素氧合酶（）、閉合小環(huán)蛋白（）、緊密連接蛋白1（）和咬合蛋白（）mRNA 的序列，用Premier 5.0 軟件設(shè)計引物，引物序列見表1。

表1 引物序列

熒光定量PCR：每個樣品3個重復(fù)，反應(yīng)體系15 μL（100 ng/μL）：SYBRPCR Buffer 7.5 μL，cDNA 1 μL，forward primers 0.4 μL，reverse primers 0.4 μL，dd HO 5.7 μL。反應(yīng)程序：95℃ 7 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)。基因的相對表達量由2表示。

1.5 統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)用SPSS 23.0 統(tǒng)計分析軟件進行One-way ANOVA、Two-way ANOVA 和Duncan's 方法多重比較，以<0.05 作為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞形態(tài)觀察 倒置顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)特征如圖1所示，培養(yǎng)36 h 后細(xì)胞形成規(guī)則的“鋪路石”狀（圖1-A）。與對照組相比，HO處理導(dǎo)致細(xì)胞死亡或破壞，可觀察到漂浮的細(xì)胞破碎物，細(xì)胞團中間出現(xiàn)空隙（圖1-B）。添加SB203580 后可見少量漂浮的細(xì)胞代謝產(chǎn)物，細(xì)胞形態(tài)正常（圖1-C）。

圖1 小腸上皮細(xì)胞形態(tài)特征（×100）

2.2 MAPK 抑制劑對細(xì)胞活力的影響 如圖2 所示，HO處理細(xì)胞后，細(xì)胞活力出現(xiàn)不同程度的降低，SB203580 處理改善了HO引起的細(xì)胞活力下降，但是添加SB203580 12～36 h 后細(xì)胞活力仍持續(xù)下降。在12 h，與A 組相比，B 組細(xì)胞活力下降到80%左右（<0.05），C 組則有所上升（<0.05）。在24 h，與A 組相比，B組細(xì)胞活力降低（<0.05），C 組細(xì)胞活力下降（>0.05）；C 組細(xì)胞活力較B 組提高（<0.05）。在36 h，3 組細(xì)胞活力為A 組>C 組>B 組（<0.05）。

圖2 MAPK 抑制劑對細(xì)胞活力的影響

2.3 MAPK 抑制劑對TEER 的影響 如圖3 所示，HO處理使TEER 下降，SB203580 顯著提高了TEER。A組細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)36 h，TEER 逐漸上升，36 h 后有所下降。B 組細(xì)胞HO處理，12 h TEER 值下降，36 h 有所上升后下降。C 組TREE 較B 組上升（<0.05）。

圖3 MAPK 抑制劑對TEER 的影響

2.4 MAPK 抑制劑對FITC-右旋糖苷通透性（Pa/Pc）的影響 由圖4 可知，與對照組相比，HO處理引起FITC-右旋糖苷通透性（Pa/Pc）增加（<0.05），添加SB203580 后顯著降低。

圖4 MAPK 抑制劑對FITC-右旋糖苷通透性（Pa/Pc）的影響

2.5 小腸上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)基因mRNA 相對表達量由圖5 可知，HO誘導(dǎo)氧化應(yīng)激后，與A 組相比，B組和相對表達量提高（<0.05）。與B 組相比，C 組和相對表達量降低（<0.05）。

圖5 MAPK 抑制劑對小腸上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)基因mRNA 相對表達量的影響

2.6 小腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白mRNA 相對表達量 由圖6可知，與A 組相比，B 組相對表達量提高（<0.05），和相對表達量降低（<0.05）。與B 組相比，C 組和相對表達量提高（<0.05）。

圖6 MAPK 抑制劑對小腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白mRNA 相對表達量的影響

3 討 論

鴨膽小、易驚，飼養(yǎng)管理導(dǎo)致應(yīng)激時可誘發(fā)機體內(nèi)氧化應(yīng)激，在短時間內(nèi)產(chǎn)生大量高活性氧分子，加速活性氧（ROS）在細(xì)胞內(nèi)的積累，抗氧化系統(tǒng)失衡，導(dǎo)致氧化損傷過程，影響細(xì)胞活力。腸道作為重要的應(yīng)激靶器官，腸上皮細(xì)胞通過內(nèi)源信號應(yīng)答和反饋調(diào)節(jié)維持機械屏障功能。ROS 的產(chǎn)生是影響細(xì)胞活力，導(dǎo)致細(xì)胞損傷、凋亡和壞死的主要原因。氧化應(yīng)激通過p38MAPK 通路來調(diào)節(jié)和基因表達，從而產(chǎn)生或加深氧化應(yīng)激帶來的損傷。本試驗發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，HO誘導(dǎo)氧化應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞活力下降，SB203580 處理改善了HO引起的細(xì)胞活力下降，但可能受培養(yǎng)基中高劑量HO的影響，添加SB203580 12～36 h 后細(xì)胞活力仍持續(xù)下降。

氧化應(yīng)激能夠激活通路調(diào)節(jié)和的表達及活性，從而引起機體發(fā)生生理變化。是氧化應(yīng)激表達的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，通過大量ROS響應(yīng)細(xì)胞損傷，與抗氧化反應(yīng)元件（ARE）結(jié)合，介導(dǎo)的表達，在抑制細(xì)胞氧化損傷中發(fā)揮重要作用。Zhang 等研究發(fā)現(xiàn)，SB203580 通過抑制p38 磷酸化來抑制和的表達，并進一步闡明了和上調(diào)與p38MAPK 磷酸化有關(guān)。本試驗也發(fā)現(xiàn)SB203580 通過抑制p38MAPK 來降低和的表達量。

應(yīng)激引起鴨腸組織損傷，增加氧化應(yīng)激損傷程度，并通過上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激強度和炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞凋亡和腸黏膜屏障功能受損。TEER 和FITC-右旋糖苷通透性（Pa/Pc）是衡量腸上皮細(xì)胞通透性的常用指標(biāo)之一，反映物理屏障功能變化。本試驗結(jié)果表明，與對照組相比，HO處理使TEER 下降，抑制p38MAPK 信號通路顯著提高了TEER 和降低FITC-右旋糖苷通透性（Pa/Pc）。緊密連接是頂端和基底外側(cè)質(zhì)膜結(jié)構(gòu)域之間的界面，是細(xì)胞旁通透性的主要決定因素。應(yīng)激影響腸黏膜上皮緊密連接導(dǎo)致腸屏障功能障礙，增加腸道通透性，腸腔中的病原體和內(nèi)毒素進入循環(huán)系統(tǒng)，從而導(dǎo)致局部和系統(tǒng)疾病的發(fā)展。腸上皮結(jié)構(gòu)和功能的完整性取決于緊密連接蛋白包括和的正常功能和調(diào)控。研究表明，和的變化與腸上皮功能障礙有關(guān)，是觀察緊密連接屏障功能和通透性功能的重要指標(biāo)。Zhu 等研究表明，抑制p38MAPK 信號通路的表達能調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞的氧化還原平衡，從而減輕雙酚A 誘導(dǎo)的腸屏障功能破壞。荀文娟等研究發(fā)現(xiàn)，抑制p38MAPK信號通路可能通過提高緊密連接蛋白mRNA 表達和降低炎性因子mRNA 表達，從而改善腸黏膜屏障功能。本試驗發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激降低了TEER，腸道通透性增加，SB203580 處理上調(diào)和表達，減輕了HO誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激對屏障功能的損傷。

4 結(jié) 論

在本試驗條件下，SB203580 在一定程度上能夠促進鴨小腸上皮細(xì)胞的生長，可有效緩解HO引起的氧化損傷，同時增加氧化損傷過程中和的表達量，保護細(xì)胞緊密連接的屏障作用，使細(xì)胞活力上升。