許嬌霞，趙勇超，王兆琛，白雪，張楠，岱紅艷，張家新

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古自治區(qū)動物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

精子在睪丸生成后，經(jīng)附睪頭運(yùn)輸?shù)礁讲G尾，在附睪轉(zhuǎn)運(yùn)過程中精子發(fā)生形態(tài)、胞質(zhì)和細(xì)胞核的變化，結(jié)構(gòu)不斷完善，最終獲得運(yùn)動能力和受精能力，成熟的精子儲存在附睪尾。在這個過程當(dāng)中，附睪上皮細(xì)胞和精子的代謝都會產(chǎn)生一定的副產(chǎn)物——活性氧（ROS)，生理范圍的ROS 對于精子正常功能的發(fā)揮是必需的。在正常情況下，體內(nèi)過量的ROS 會被一系列精子內(nèi)或精子外的抗氧化劑分子清除，若附睪內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)和內(nèi)源性ROS 生成之間失衡，會引起氧化應(yīng)激、使得精子結(jié)構(gòu)受到損害、精子活力降低。因此，附睪精子和附睪液的抗氧化酶活性的正常維持對于精子的成熟以及儲存尤為重要。調(diào)節(jié)細(xì)胞抗氧化功能的酶主要有超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px） 和過氧化物酶(POD)。有報道表明，在不同動物的附睪液或精子中檢測到了不同的酶活性（山羊、馬、豬、大鼠、人、狗），然而這些酶在綿羊附睪的活性變化模式鮮有報道。鑒于此，本研究系統(tǒng)地研究了不同抗氧化酶在綿羊附睪不同部位附睪液和精子的抗氧化酶活性變化模式，為進(jìn)一步研究綿羊附睪抗氧化功能的調(diào)節(jié)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 在2020 年11 月—2020 年12 月，采集10～12 月齡、體重相近、健康的6 只小尾寒羊的睪丸，實(shí)驗(yàn)綿羊在相同條件下飼養(yǎng)于土左旗翔泰養(yǎng)殖合作社，在屠宰場屠殺，每只羊的樣品分別設(shè)置3個重復(fù)組。根據(jù)Rana 等采集附睪液和附睪精子的方法，將白膜完整的睪丸和附睪置于PBS 中冷藏保存，2 h 內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。根據(jù)Cyr、Rana 等對附睪的劃分標(biāo)準(zhǔn)（圖1），于超凈臺中將附睪頭、附睪體、附睪尾分離，分別浸入含有3 mL PBS 潔凈無菌的培養(yǎng)皿中。每個部位用細(xì)剪刀剪3～4個切口，使附睪腔內(nèi)液體從切口滲出，室溫下孵育10 min，用鑷子輕輕擠壓，收集附睪各部位滲出含有精子的管腔液，室溫下1 000 ×g 離心5 min。上清液則為附睪液，將精子沉淀用PBS 洗滌3 次，最后利用雷氏曼染色法對精子涂片進(jìn)行染色，確保精子無血細(xì)胞污染。

圖1 附睪結(jié)構(gòu)

1.2 抗氧化酶活性檢測

1.2.1 精子蛋白的提取 根據(jù)碧云天公司W(wǎng)estern 及IP 細(xì)胞裂解液的說明書進(jìn)行試驗(yàn)，取100 萬左右精子，加入200 μL IP 裂解液，充分裂解后，12 000 ×g 離心5 min，取上清，即可用于后續(xù)抗氧化酶活性的檢測。

1.2.2 蛋白濃度的檢測 根據(jù)博士德公司BCA 蛋白濃度測定試劑盒的說明書分別對綿羊附睪不同部位附睪液和精子的蛋白濃度進(jìn)行檢測，在96 孔板中加入20 μL 的標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品，再加入BCA 工作液200 μL，37℃孵育20 min 后，用酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek 儀器有限公司產(chǎn)Synergy HT）測定A562。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出待測樣的蛋白濃度。

1.2.3 總抗氧化力的檢測 根據(jù)碧云天公司總抗氧化能力檢測試劑盒的說明書分別對綿羊附睪不同部位附睪液和精子的T-AOC 進(jìn)行檢測，利用ABTS 法，抗氧化物可將ABTS·+還原為ABTS。在96 孔板中相繼加入過氧化物酶工作液、待測樣、ABTS 工作液，并設(shè)置空白對照組，室溫孵育6 min，使用酶標(biāo)儀測定A414，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過公式比蛋白濃度計(jì)算T-AOC。

1.2.4 SOD 活性的檢測 根據(jù)碧云天公司SOD 活性檢測試劑盒的說明書分別對綿羊附睪不同部位附睪液和精子的SOD 活性進(jìn)行檢測，在96 孔板中依次加入待測樣品、SOD 檢測緩沖液、WST-8/酶工作液、反應(yīng)啟動工作液，37℃孵育30 min，利用WST-8 法，對WST-8 產(chǎn)物比色，通過公式比蛋白濃度計(jì)算出SOD 活性。

1.2.5 CAT 活性的檢測 根據(jù)碧云天公司過氧化氫酶活性檢測試劑盒的說明書分別對綿羊附睪不同部位附睪液和精子的CAT 活性進(jìn)行檢測，過氧化物酶可催化過氧化氫生成紅色產(chǎn)物，設(shè)置空白對照，96 孔板依次加入樣品、過氧化氫酶檢測緩沖液、過氧化氫溶液，混勻后25℃反應(yīng)5 min，然后加入過氧化氫酶反應(yīng)終止液混勻以終止反應(yīng)。取1個新的離心管加入40 μL 過氧化氫酶檢測緩沖液，再加入10 μL 上述反應(yīng)體系，混勻。取10 μL 加入到96 孔板中，再加200 μL 顯色工作液。25℃孵育15 min，使用酶標(biāo)儀測定A520，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過公式比蛋白濃度計(jì)算出CAT 活性。

1.2.6 GSH-Px 活性的檢測 根據(jù)碧云天公司總谷胱甘肽過氧化物酶檢測試劑盒的說明書分別對綿羊附睪不同部位附睪液和精子的GSH-Px 活性進(jìn)行檢測，利用NADPH 法，檢測NADPH 的減少量，在96 孔板中依次加入谷胱甘肽過氧化物酶檢測緩沖液、待測樣品和GSH-Px 檢測工作液，混勻，加入40 μL GSH-Px 檢測工作液，室溫下孵育15 min，再加10 μL 過氧化物試劑溶液混勻，立即使用酶標(biāo)儀測定A340，每隔2 min測定1 次，連續(xù)測定10 min，通過公式比蛋白濃度計(jì)算出GSH-Px 的活性水平。

1.2.7 POD 活性的檢測 根據(jù)索萊寶公司過氧化物酶（POD）活性檢測試劑盒的說明書分別對綿羊附睪不同部位附睪液和精子的POD 活性進(jìn)行檢測，POD 在有過氧化氫存在的情況下能使愈創(chuàng)木酚發(fā)生氧化生成茶褐色物質(zhì)。在離心管中按順序加入試劑一、試劑二、試劑三、蒸餾水、樣品，混勻后取200 μL 加入到96 孔板中，使用酶標(biāo)儀測定30 s 和90 s 時的A470，通過公式比蛋白濃度計(jì)算出POD 的酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 酶活性采用SAS 25.0 軟件中的ANAVO進(jìn)行單因素方差分析和顯著性檢驗(yàn)，<0.05 為差異顯著，<0.01 為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 綿羊附睪液抗氧化能力的結(jié)果 如表1 所示，從附睪頭到附睪尾，附睪液中T-AOC 顯著上升，其中附睪尾的液體中T-AOC 顯著高于附睪頭和附睪體，附睪頭和附睪體差異不顯著；附睪尾和附睪體的液體中SOD活性顯著高于附睪頭，而附睪尾和附睪體差異不顯著；CAT 活性在附睪不同部位的附睪液中差異不顯著；附睪尾液體中GSH-Px 活性顯著高于附睪頭和附睪體，而附睪頭液體中GSH-Px 活性顯著高于附睪體；附睪尾液體中POD 活性顯著高于附睪頭和附睪體，附睪頭與附睪體差異不顯著。

表1 不同部位附睪液抗氧化指標(biāo)

2.2 綿羊附睪精子抗氧化能力的結(jié)果 如表2 所示，從附睪頭到附睪尾，附睪精子中的T-AOC 顯著上升，其中附睪尾精子中的T-AOC 顯著高于附睪頭和附睪體，附睪體精子中的T-AOC 顯著高于附睪頭；SOD 在附睪尾和附睪體精子中的活性顯著低于附睪頭，附睪尾和附睪體差異不顯著；附睪尾精子中GSH-Px 活性顯著高于附睪頭和附睪體，附睪頭和附睪體差異不顯著；附睪尾精子中POD 活性顯著高于附睪頭和附睪體，附睪體顯著高于附睪頭；而在附睪精子中并未檢測到CAT 活性。

表2 不同部位附睪精子抗氧化指標(biāo)

3 討 論

哺乳動物精子在睪丸形成后，需要在附睪進(jìn)一步完成成熟過程。但是從附睪頭運(yùn)輸?shù)礁讲G尾的過程中，精子質(zhì)膜的多不飽和脂肪酸水平增加，使得精子更容易受到氧化損傷。精子在附睪的運(yùn)輸過程中，代謝率、形態(tài)和運(yùn)動模式都會發(fā)生變化，因此其氧化還原狀態(tài)也會相應(yīng)改變。盡管已有研究表明，在不同動物附睪中都能檢測到抗氧化酶活性，但是相關(guān)酶活性的變化趨勢有著不同的結(jié)果，附睪液和精子中的酶活性不僅隨空間的變化而變化，而且這種空間變化也可能存在物種特異性，鑒于此本實(shí)驗(yàn)對綿羊附睪不同部位附睪液和精子中抗氧化酶活性的變化進(jìn)行了研究。

T-AOC 是酶類和非酶類抗氧化劑成分的總和，本研究中，從附睪頭到附睪尾不論是精子還是附睪液中T-AOC 均呈上升趨勢，附睪尾部精子和附睪液的T-AOC均顯著高于其他的附睪部位，這與Rana 等在山羊附睪頭到附睪尾中附睪液T-AOC 的變化趨勢相一致。這可能是由于尾部精子PUFA 濃度較高，會產(chǎn)生大量ROS，故需要自身以及附睪環(huán)境更高的抗氧化能力來平衡過量的ROS。

SOD 是清除過氧陰離子O-重要的抗氧化酶，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示附睪液中總SOD 的活性均呈升高趨勢，而在山羊的附睪液、以及野豬的附睪精子中也報告了類似結(jié)果。在附睪精子中SOD 活性的變化趨勢與之相反，這與山羊附睪中精子SOD 的活力變化趨勢一致。CAT 可將HO轉(zhuǎn)化為水和氧氣，有報道表明，在豬、狗、小鼠、兔的附睪精子中均未檢測到CAT 的存在，而在馬、人、狗、豬和牛的精漿中CAT 含量很高。研究發(fā)現(xiàn)精漿中的CAT 主要來源于前列腺液，而結(jié)合本研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)綿羊附睪精子上并不存在CAT 活性，而附睪液中存在CAT 活性，這說明附睪液也可能是精漿中CAT 的來源之一。由此可見，隨著附睪不同區(qū)域活性氧類型的變化，CAT在許多哺乳動物精子中的抗氧化功能并不是必需的，這些酶活性在附睪中不同的變化可能歸因于精子對特定抗氧化酶的不同需求。

GSH-Px 在哺乳動物不同器官廣泛分布，并參與附睪成熟精子的保護(hù)。本研究結(jié)果顯示，附睪液和附睪精子從頭到尾均呈升高趨勢，這與山羊附睪液中GSH-Px 活性的變化趨勢一致。而在馬的附睪液中GSH-Px 活性從附睪頭部到尾部逐漸降低，與本研究結(jié)果相反，這可能是由于物種差異性所致。附睪液中的GSH-Px 的表達(dá)取決于附睪上皮細(xì)胞的分泌情況，而其活性又會根據(jù)不同的抗氧化需求表現(xiàn)出一定差異。

POD 在附睪上皮主細(xì)胞、基底細(xì)胞和窄細(xì)胞中高度表達(dá)，但在附睪頭和附睪尾上皮的透明細(xì)胞中不表達(dá)。POD 是精子中重要的抗氧化劑，可以調(diào)節(jié)過氧化物（HO和有機(jī)過氧化物）和過氧化物亞硝酸鹽（ONOO）等ROS 水平，以避免細(xì)胞毒性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不論是附睪液還是精子，從附睪頭至附睪尾POD 活性均呈升高趨勢，故此精子儲存在附睪尾時需要自身以及附睪液中更高活性的POD 保護(hù)精子免受氧化應(yīng)激的損害。

總的來說，不論是在綿羊的附睪液還是附睪精子中，T-AOC 從附睪頭到附睪尾均呈升高趨勢，其中GSH-Px 和POD 的活性在尾部最高，精子中SOD 活性逐漸降低，而且在精子中未檢測到CAT 活性。這可能是由于附睪不同部位的生理作用不同，故而精子對不同抗氧化酶有著不同的需求，但其具體的形成原因仍需進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

綜上所述，綿羊附睪不同部位附睪液及其精子的抗氧化酶活性存在區(qū)域特異性，在附睪尾的抗氧化酶活性明顯升高，這說明隨著精子的成熟，儲存在附睪尾的精子對抗氧化環(huán)境有更高的需求。