孫少寧，陳秋燃，李佳麗，張琛，靳榮帥，白少成，姚凡，陳陽,2，吳信生,2*

（1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009；2.農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州 225009）

新西蘭兔原產(chǎn)于美國，其早期生長快，毛皮質(zhì)地好，具有較高的飼養(yǎng)經(jīng)濟(jì)價(jià)值，并在醫(yī)藥學(xué)和生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中被廣泛應(yīng)用。構(gòu)建新西蘭白兔的毛囊體外培養(yǎng)模型對(duì)畜牧學(xué)、醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究都具有重要意義，也可為探究家兔毛囊發(fā)育機(jī)制提供研究素材。

毛品質(zhì)是衡量毛兔經(jīng)濟(jì)價(jià)值的主要性狀，毛囊決定背毛質(zhì)量，探究毛囊生長因子調(diào)控及生長條件顯得尤為重要。隨著生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，離體培養(yǎng)組織器官的可能性大大提高。麥躍等曾在血漿凝塊中嘗試種植胚胎鼠皮膚，進(jìn)行懸滴培養(yǎng)，順利獲得和普通毛囊相仿的毛囊構(gòu)造，拓展毛囊重建培養(yǎng)研究領(lǐng)域。1990年Kaufman 等研究發(fā)現(xiàn)，在William’s E 培養(yǎng)基中毛囊生長速度與體內(nèi)生長速度相近，成功建立人頭皮游離毛囊培養(yǎng)模型，但由于實(shí)驗(yàn)所用人頭皮毛囊組織來源狹窄，實(shí)驗(yàn)很難重復(fù)。范衛(wèi)新等將豬毛囊代替人毛囊展開無血清成分培養(yǎng)研究。如今，多數(shù)實(shí)驗(yàn)以人、鼠、豬、羊等動(dòng)物毛囊為模型，但兔作為常見的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，與之有關(guān)研究報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)通過體外分離毛囊，分析不同培養(yǎng)基對(duì)新西蘭白兔觸須毛囊生長、形態(tài)和增殖能力的影響，為研究毛囊生物學(xué)特征、生長調(diào)節(jié)機(jī)制提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 主要試劑 William’s E、DMEM、MEM 培養(yǎng)基來自Gibco 公司；胰島素、氫化可的松、轉(zhuǎn)鐵蛋白、亞硒酸鹽購于北京索萊寶科技有限公司；雙抗購自華北制藥有限公司；PCNA 增殖細(xì)胞核抗原（GB13010-1）購自賽維爾公司。其中，配制3 種培養(yǎng)基時(shí)，均添加10 μg/mL胰島素、10 ng/mL 氫化可的松、10 μg/mL 轉(zhuǎn)鐵蛋白、10 ng/mL 亞硒酸鹽和100×雙抗。

1.1.2 主要儀器 解剖顯微鏡（OLYMPUS）；熒光倒置顯微鏡（OLYMPUS）；CO培養(yǎng)箱（BINDER）；DK-600 恒溫水槽；SW-CJ-1F 型無菌超凈工作臺(tái)。

1.2 兔觸須毛囊的分離與培養(yǎng) 選擇2 月齡健康的新西蘭白兔，準(zhǔn)備75%酒精的容器，將其完全浸泡，處理10 s，置于已消毒完成托盤中。準(zhǔn)備好6個(gè)消毒容器，3個(gè)分別加酒精（75%），另3個(gè)分別加含雙抗的生理鹽水，將剪下的兔觸須部皮膚依次放入，浸泡。準(zhǔn)備滅菌處理好的燒杯，加入4℃生理鹽水，將浸泡處理好的觸須部皮膚置入，備用，燒杯下放冰袋。把觸須部組織順毛囊平行方向分割成細(xì)條形狀，將細(xì)條狀毛囊用顯微器械進(jìn)行分散處理，獲得獨(dú)立處于毛囊生長期的組織，去除大部分周圍組織，盡量避免兔毛囊損傷。挑選結(jié)構(gòu)完整的毛囊進(jìn)行體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。

取3個(gè)培養(yǎng)皿，依次加入William’s E 無血清培養(yǎng)液、DMEM 和MEM，將已處理兔觸須毛囊隨機(jī)分成3組置入。得到3 組兔觸須毛囊，各用3 種培養(yǎng)液洗滌2 遍，分為3 組置入 24 孔培養(yǎng)板中，標(biāo)記好，再每孔分別加入無血清培養(yǎng)液1 mL，置入細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，溫度保持37℃，2 d 更換培養(yǎng)液，持續(xù)6 d，注意控制溫度。

1.3 組織HE 染色收集已由William’s E、DMEM 和MEM 培養(yǎng)基處理4 d 后的毛囊，4% 多聚甲醛固定。50%-70%-80%-90%梯度浸泡，乙醇處理沖洗包埋。乙醇、二甲苯透明處理，浸蠟，制作厚度約5 μm 切片。用二甲苯、乙醇和不同濃度酒精脫蠟，蘇木素和伊紅染色。經(jīng)透明脫水處理后，用中性樹膠封片，顯微鏡記錄毛囊形態(tài)。

1.4 增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）免疫熒光染色 切片順次置入二甲苯I、二甲苯II，經(jīng)無水乙醇、75%和85%酒精蒸餾洗滌，置于修復(fù)盒中，中低火間斷加熱，降溫后搖晃洗滌。微干，在組織外圍畫圈，由圈內(nèi)自發(fā)熒光淬滅劑等待處理5 min，BSA 孵育30 min。加一抗、二抗室溫避光孵育，加PBS 緩沖液洗滌5 min，DAPI 染色。取出微干，抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡觀察采集。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 倒置顯微鏡下觀察，采用目鏡測(cè)微尺方式，每2 d 測(cè)量毛囊，觀察形態(tài)變化，記錄毛囊生長數(shù)據(jù)。軟件SPSS 20.0 開展單因子ANOVA 方差分析，結(jié)果以平均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，<0.05 為差異顯著，<0.01 為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 毛囊的體外培養(yǎng) 如圖1 所示，顯微鏡下毛囊未發(fā)生破損，且毛干正常生長，說明毛囊體外分離成功。在6 d的體外毛囊培養(yǎng)周期中，3 組毛囊均可長出毛干，不同組毛囊會(huì)隨著培養(yǎng)時(shí)間延長的毛干增長下降，4 d 后部分毛囊發(fā)生不同程度的彎曲甚至停止生長。

圖1 體外分離毛囊0～6d 的生長形態(tài)

2.2 不同培養(yǎng)基對(duì)毛囊毛干體外生長速度的影響 由表1可以看出，William’s E、DMEM、MEM 中毛囊毛干生長速度在不同時(shí)間均有不同，DMEM 組在2 d 和4 d 毛干生長速度高于6 d（<0.05），William’s E 組和MEM組在2 d 和4 d 的毛干生長速度也高于6 d（<0.01）。對(duì)比3 組毛囊毛干平均生長速度，William’s E 組的平均生長速度大于MEM 組（<0.05），DMEM 組與其他2 組沒有顯著差異。4 d 后各組毛干生長緩慢，MEM 組毛干生長基本停滯。

表1 培養(yǎng)基類型對(duì)毛囊毛干生長速度的影響

2.3 不同培養(yǎng)基對(duì)毛囊形態(tài)的影響 如圖2 所示，HE 染色表明3 組毛囊結(jié)構(gòu)有所不同。培養(yǎng)4 d 時(shí)，Williams’E組毛囊結(jié)構(gòu)完好，毛乳頭清晰，DMEM 和MEM 組毛乳頭消失。DMEM 組毛囊開始出現(xiàn)萎縮與結(jié)締組織開始分離，MEM 組毛囊結(jié)構(gòu)明顯萎縮，外根鞘底部變圓，毛囊變形。

圖2 HE 染色組織學(xué)分析（×40）

2.4 體外培條件對(duì)毛囊基質(zhì)細(xì)胞增殖能力影響 PCNA染色熒光在毛囊底部出現(xiàn)，其中，Williams’E 組PCNA陽性表達(dá)在毛乳頭清晰可見，DMEM 和MEM 組毛囊表達(dá)僅表達(dá)在外根鞘，說明Williams’E 組毛囊增殖能力比其他2 組強(qiáng)（圖3）。

圖3 免疫熒光染色分析（×100）

3 討 論

毛發(fā)生長受許多因素控制，呈現(xiàn)周期變化，兔的年齡、毛囊大小、操作溫度等均可能成為影響因素。1 月齡以下兔的毛囊結(jié)構(gòu)發(fā)育不完全或較嫩小，而2 月齡的兔毛囊形態(tài)大小理想、活性強(qiáng)，更適用于毛囊的分離。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇2 月齡兔觸須毛囊作為研究對(duì)象。苗勇研究表明毛囊在裸露分離時(shí)，如果完全暴露會(huì)影響其活性，其生長狀態(tài)會(huì)變差。本實(shí)驗(yàn)在分離毛囊時(shí)也注意保持毛囊的完整性，防止影響毛囊活性，在不影響觀察的情況下，可以留一些組織保護(hù)毛囊。

前人通過毛囊體外保存實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)William’s E 培養(yǎng)液優(yōu)于DMEM 培養(yǎng)液，且未添加血清的William’s E 培養(yǎng)液優(yōu)于添加血清的William’s E 培養(yǎng)液。有研究顯示毛囊更適合在無血清培養(yǎng)基中生長，因此血清在毛囊培養(yǎng)中成為無關(guān)緊要成分，所以試驗(yàn)條件均未添加血清。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在William’s E 中培養(yǎng)的毛囊可以生長6 d 以上，通過比較培養(yǎng)基成分發(fā)現(xiàn)，William’s E較DMEM 培養(yǎng)基含有更豐富的維生素、氨基酸及微量元素，有助于毛囊生長，William’s E 營養(yǎng)成分比另外兩個(gè)培養(yǎng)基更加豐足，更加接近體外觸須毛囊生長營養(yǎng)環(huán)境?？傮w來說，無血清William’s E 較其他培養(yǎng)基更貼近毛囊在新西蘭兔體內(nèi)生長的環(huán)境。Philpott 等研究發(fā)現(xiàn) William’s E 培養(yǎng)液中有NaSeO及氫化可的松，可以適當(dāng)保持毛囊形態(tài)。DMEM 和William’s E、MEM 組的毛囊生長與時(shí)間成反比，與體內(nèi)生長相比差距很大，此現(xiàn)象可能與毛囊細(xì)胞的分裂能力下降有關(guān)。毛囊脫離內(nèi)環(huán)境后，雖然體外模擬出毛囊的生長環(huán)境，但缺乏在體內(nèi)存在的各種細(xì)胞因子，微環(huán)境異常，毛囊生長會(huì)受到不同程度的阻礙。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)毛囊在William’s E 培養(yǎng)基生長最佳，這和在人、絨山羊、蒙古綿羊、北京鴨、小鼠上的研究結(jié)論相同。通過石蠟切片結(jié)果可以得出William’s E 培養(yǎng)基能維持毛囊處在生長期，而另外2 種培養(yǎng)基不能。用 PCNA免疫熒光染色觀察發(fā)現(xiàn)DMEM 和MEM 組毛囊表達(dá)僅表達(dá)在外根鞘，William’s E 組在毛乳頭PCNA 陽性表達(dá)清楚透徹，說明 Williams’E 組更適合的囊增長，更好促進(jìn)毛發(fā)生長。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在William’E 中培養(yǎng)的毛囊毛干的生長、形態(tài)以及增殖能力最佳。因此，William’s E培養(yǎng)基最適宜培養(yǎng)新西蘭白兔的觸須毛囊，可為開展動(dòng)物毛囊生長發(fā)育的研究提供參考依據(jù)。