劉 敏，陳璐，曾怡銘，白丁平，黃小紅*

（1.中西獸醫(yī)結(jié)合與動(dòng)物保健福建省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州 350002；2.福建省獸醫(yī)中藥與動(dòng)物保健重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州 350002）

人工授精是目前最有效的生豬繁殖技術(shù)，為我國生豬品種改良和選育做出巨大貢獻(xiàn)，迅速推動(dòng)了我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。精液品質(zhì)是人工授精技術(shù)的關(guān)鍵因素，提高精液保存質(zhì)量有助于提高人工授精成功率。在實(shí)際生產(chǎn)中，主要采用常溫保存下的豬精液進(jìn)行人工授精。但精液中活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）隨著保存時(shí)間的增加而增加，過量ROS 會(huì)損傷精子結(jié)構(gòu)，破壞精子基本功能，甚至加速精子死亡，導(dǎo)致精液品質(zhì)下降。研究表明，在精液保存期間添加抗氧化劑可緩解精子氧化損傷，提高精液質(zhì)量。因此，眾多學(xué)者嘗試在稀釋液中加入抗氧化劑來改善精液品質(zhì)。

半胱氨酸（Cysteine，CYS）屬于氨基酸類抗氧化劑，具有良好的抗氧化活性。CYS 一方面可合成谷胱甘肽并增強(qiáng)谷胱甘肽過氧化物酶活性以消除ROS，另一方面經(jīng)半胱氨酸脫酸酶分解生成?；撬幔苡行宄杂苫?，顯著改善精液品質(zhì)。目前，CYS 作為抗氧化劑已應(yīng)用于人、水牛精液冷凍保存中，但將CYS 添加到杜洛克豬精液17℃保存的應(yīng)用研究未見報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在研究CYS 對(duì)17℃保存的杜洛克豬精子活力、漸進(jìn)運(yùn)動(dòng)率、質(zhì)膜完整率、頂體完整率以及抗氧化能力的影響，為CYS 運(yùn)用到豬精液17℃保存中提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)精液 本實(shí)驗(yàn)所用杜洛克豬精液由福建永城華多種豬場(chǎng)提供。采集6 頭成年健康、體況良好的杜洛克公豬混合精液，選取色澤乳白、無異味、射精量正常的精液，于2 h 內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，精子活力大于70%方可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑 CYS、檸檬酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉、碳酸氫鈉、氯化鉀、青霉素鉀均購自海麥克林生化科技有限公司；硫酸鏈霉素購自美國INALCO 公司；果糖、乙酸、甲醇均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；DAPI溶液購自北京索萊寶科技公司；異硫氰熒光素-花生凝集素?zé)晒馊疽嘿徸悦绹鳶igma-Aldrich 公司；總抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）及丙二醛（MDA）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 主要儀器 數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-4 購自國華電器有限公司；17℃恒溫箱購自北京福意電器有限公司；AMG EVOS 無目鏡數(shù)碼倒置顯微鏡（熒光型）購自美國AMG 公司；計(jì)算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)（Computer-Assisted Sperm Analysis,CASA）購自法國IMV（卡蘇）；獸用Leja 八腔室玻片購自法國IMV（卡蘇）。

1.4 基礎(chǔ)稀釋液BTS 配制 準(zhǔn)確稱取葡萄糖37.00 g、檸檬酸鈉6.00 g、EDTA-2Na 1.25 g、碳酸氫鈉1.25 g、氯化鉀0.75 g、青霉素鉀0.60 g、硫酸鏈霉素1.00 g，加雙蒸水完全溶解后，pH 調(diào)至7.2，加雙蒸水定容至1 L，4℃保存待用。

1.5 精液處理 使用CASA 上機(jī)確定精液稀釋比例，使精子密度最終為1×10個(gè)/mL。將杜洛克豬精液按照稀釋比例添加BTS 和CYS，使CYS 的終濃度分別為0、2、4、6、8 mmol/L，其中0 mmol/L 的CYS 作為對(duì)照組，分裝于無菌離心管內(nèi)，做好標(biāo)記，用10 層紗布包裹后平鋪置于17℃恒溫箱中避光保存。保存期間每隔12 h輕微晃動(dòng)精液，避免精子聚集沉淀致死。

1.6 精液品質(zhì)檢測(cè) 每隔24 h，取出精液樣品，輕輕顛倒混勻后，取100 μL 于無菌離心管中，37℃水浴10 min，吸取2 μL 上機(jī)檢測(cè)精子活力、漸進(jìn)運(yùn)動(dòng)率，直至第7 天；在第3、5、7 天，采用低滲腫脹法檢測(cè)精子質(zhì)膜完整率，將100 μL 豬精液加入1 mL 檸檬酸鈉-果糖低滲溶液中，37℃水浴1 h，再取10 μL 豬精液置于400 倍光學(xué)顯微鏡下觀察，計(jì)算彎尾精子數(shù)與精子總數(shù)的百分比；在第3、5、7 天，采用FITC-PNA 聯(lián)合DAPI 檢測(cè)精子頂體完整率，吸取20 μL 豬精液滴加在干凈載玻片上，晾干后，無水甲醇固定10 min，分別滴加DAPI、FITC-PNA 進(jìn)行染色，置于37℃恒溫箱避光孵育30 min，孵育結(jié)束后，PBS 清洗3 遍，蓋上蓋玻片，在40×倒置熒光顯微鏡下觀察，計(jì)算頭部呈圓滑綠色熒光精子數(shù)與精子總數(shù)的百分比。

1.7 抗氧化能力檢測(cè) 在BTS 中添加CYS 最佳濃度對(duì)杜洛克豬精液進(jìn)行稀釋并17℃保存，在第3、5、7 d 時(shí)分別檢測(cè)豬精液的總抗氧化能力（T-AOC）水平、丙二醛（MDA）含量、及谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析 利用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行單因素ANOVA分析，使用LSD 進(jìn)行多重比較分析差異顯著性，數(shù)據(jù)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，<0.05 作為差異顯著標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度CYS 對(duì)17℃保存下杜洛克豬精液品質(zhì)的影響

2.1.1 不同濃度CYS 對(duì)杜洛克豬精子活力的影響 如表1 所示，2 mmol/L CYS 組在保存的3～7 d 精子活力高于其他處理組（<0.05）；4、6 mmol/L CYS 組在保存期間精子活力與對(duì)照組差異不顯著；8 mmol/L CYS 組在保存1～7 d 精子活力低于其他處理組（<0.05）。

表1 不同濃度CYS 對(duì)杜洛克豬精子活力的影響 %

2.1.2 不同濃度CYS 對(duì)杜洛克豬精子前向運(yùn)動(dòng)率的影響由表2 可知，2 mmol/L CYS 組在保存第3、4 天精子前向運(yùn)動(dòng)率高于其他處理組（<0.05）；4、6 mmol/L CYS 組在保存的1～7 d 與對(duì)照組相比對(duì)精子前向運(yùn)動(dòng)率的影響不顯著；8 mmol/L CYS 組在保存期間精子前向運(yùn)動(dòng)率低于其他處理組（<0.05）。

表2 不同濃度CYS 對(duì)杜洛克豬精子前向運(yùn)動(dòng)率的影響 %

2.1.3 不同濃度CYS 對(duì)杜洛克豬精子質(zhì)膜完整率的影響通過低滲腫脹法檢測(cè)精子質(zhì)膜完整率，精子尾部彎曲情況見圖1。從表3 可看出，2 mmol/L CYS 組在保存的第3、5、7 天精子質(zhì)膜完整率高于對(duì)照組（<0.05）；4、6 mmol/L CYS 組在保存期間的精子質(zhì)膜完整率與對(duì)照組相比無顯著變化；與對(duì)照組相比，8 mmol/L CYS 組在保存第3 天的精子質(zhì)膜完整率降低（<0.05），但在保存第5、7 天無顯著變化。

表3 不同濃度CYS 對(duì)杜洛克豬精子質(zhì)膜完整率的影響 %

圖1 低滲腫脹試驗(yàn)下杜洛克豬精子質(zhì)膜

2.1.4 不同濃度CYS 對(duì)杜洛克豬精子頂體完整率的影響 經(jīng)FITC-PNA 聯(lián)合DAPI 染色后，頂體完整精子頭部會(huì)發(fā)出圓滑且明亮的綠色熒光，反之頂體破損精子頭部則呈殘缺綠色熒光或無熒光（圖2）。由表4 可知，2 mmol/L CYS 組在保存第3、5、7 天的精子頂體完整率高于其他處理組（<0.05）；與對(duì)照組相比，4 mmol/L CYS 組在保存期間對(duì)精子頂體完整率的影響不顯著，6 mmol/L CYS 組在保存第7 天的頂體完整率降低（<0.05），其他時(shí)間段對(duì)精子頂體完整率無顯著影響；8 mmol/L CYS 組中精子頂體完整率在保存的第3、5、7 天低于對(duì)照組（<0.05）。

表4 不同濃度CYS 對(duì)杜洛克豬精子頂體完整率的影響 %

圖2 FITC-PNA 聯(lián)合DAPI 熒光染色下杜洛克豬精子頂體

2.2 CYS 對(duì)杜洛克豬精液抗氧化能力的影響

2.2.1 CYS 對(duì)杜洛克豬精液中T-AOC 水平的影響 從圖3 可見，隨著杜洛克豬精液保存時(shí)間延長(zhǎng)，T-AOC水平逐漸降低。在保存的第3、5、7 天，添加CYS 后精液中T-AOC 水平均高于對(duì)照組（<0.05）。

圖3 CYS 對(duì)杜洛克豬精液中T-AOC 水平的影響

2.2.2 CYS 對(duì)杜洛克豬精液中MDA 含量的影響 如圖4 所示，在保存的第3、5、7 天，添加CYS 后杜洛克豬精液中MDA 含量與對(duì)照組相比均降低（<0.05）。

圖4 CYS 對(duì)杜洛克豬精液中MDA 含量的影響

2.2.3 CYS 對(duì)杜洛克豬精液中GSH-PX 活性的影響 從圖5 可看出，在保存的第3、5、7 天，添加CYS 后杜洛克豬精液中GSH-Px 活性與對(duì)照組相比升高（<0.05）。

圖5 CYS 對(duì)杜洛克豬精液中GSH-Px 活性的影響

3 討 論

豬精液保存過程中易受多種因素影響而產(chǎn)生過量ROS。ROS 大量累積會(huì)對(duì)豬精子造成一系列不利影響，包括損傷DNA 結(jié)構(gòu)，削弱精子的受精能力；使蛋白質(zhì)受損，引起肽鏈斷裂、構(gòu)象及免疫原性改變；破壞生物膜的完整，改變膜通透性、降低膜流動(dòng)性、增加膜脆性。CYS 作為含巰基氨基酸，具有較強(qiáng)還原性，已廣泛運(yùn)用于醫(yī)療藥品、食品保存及動(dòng)物飼料等行業(yè)。在豬精液稀釋液中添加適宜濃度的外源性抗氧化劑可有效清除精液中的ROS，對(duì)改善保存后精液品質(zhì)具有重要意義。

精子活力和前向運(yùn)動(dòng)率是精子運(yùn)動(dòng)性能參數(shù)中最具代表意義的兩個(gè)指標(biāo)，二者與公豬繁殖性能之間呈正相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，17℃保存至第7 天時(shí)，添加濃度為2 mmol/L 的CYS 組杜洛克豬精子活力和前向運(yùn)動(dòng)率仍然維持在71.06% 和74.36%。Zhu 等研究表明CYS 可降低精子DNA 氧化損傷生物標(biāo)志物8-羥基脫氧鳥苷的百分比，保護(hù)兔精子DNA 結(jié)構(gòu)，提高精子活力。由此推測(cè)，CYS 通過斷裂自身的-SH 鍵與氧自由基相結(jié)合，降低氧自由基與精子DNA 結(jié)合機(jī)率，避免DNA 鏈片段化，進(jìn)而保證精子DNA 結(jié)構(gòu)的完整，提高精子活力和前向運(yùn)動(dòng)率。

由于豬精子生物膜上富含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸，其質(zhì)膜和頂體在保存過程中易發(fā)生脂質(zhì)過氧化，造成精子運(yùn)動(dòng)能力下降，甚至活力喪失，最終引起精卵結(jié)合受阻。本實(shí)驗(yàn)中，添加2 mmol/L 的CYS 對(duì)17℃保存的杜洛克豬精子質(zhì)膜和頂體的保護(hù)作用最佳，在保存第7 天，與對(duì)照組相比，2 mmol/L CYS 組的豬精子質(zhì)膜完整率、頂體完整率分別顯著提高12.15%、5.07%，這與范楚寧的研究結(jié)果相似，即添加CYS 能夠維持獺兔精子質(zhì)膜和頂體完整性。原因可能是CYS 的主要活性基團(tuán)是具有還原性的巰基，可以避免細(xì)胞膜上的長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸被氧化，保護(hù)細(xì)胞膜的完整，同時(shí)它還能夠在細(xì)胞膜的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間或者蛋白質(zhì)分子內(nèi)部形成二硫鍵，增強(qiáng)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，從而提高杜洛克豬精子質(zhì)膜完整率和頂體完整率，增強(qiáng)精子細(xì)胞膜抵抗脂質(zhì)過氧化的能力。

T-AOC 水平、GSH-Px 活性以及MDA 含量是評(píng)估精液抗氧化能力的重要指標(biāo)。史軼超等發(fā)現(xiàn)不育癥患者精液中T-AOC 水平較正常男性精液明顯降低，并表明低水平T-AOC 會(huì)造成精子運(yùn)動(dòng)能力下降。GSH-Px 是精液中重要抗氧化物酶，提高其活性后可有效緩解精子氧化損傷。MDA 作為脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的主要代謝產(chǎn)物，MDA 含量越高，精子細(xì)胞膜氧化損傷越嚴(yán)重。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，添加2 mmol/L 的CYS 可以提高17℃保存下杜洛克豬精液中T-AOC 水平和GSH-Px 活性，降低精液中MDA 含量。這與程彩虹的研究結(jié)果相符，其發(fā)現(xiàn)半胱氨酸能夠提高冷凍綿羊精液中抗氧化物酶活性，降低MDA 水平。CYS 可能通過犧牲自身還原性巰基直接與氧自由基結(jié)合，干擾ROS 產(chǎn)生，同時(shí)從促進(jìn)谷胱甘肽合成，提高谷胱甘肽過氧化物酶活性，消除ROS 累積，以增強(qiáng)精液的抗氧化能力。

綜上所述，在17℃保存條件下，添加適宜濃度的CYS 對(duì)杜洛克豬精子活力、漸進(jìn)運(yùn)動(dòng)率、質(zhì)膜完整率、頂體完整率和抗氧化能力具有積極作用，可能通過自身抗氧化活性及促進(jìn)精子內(nèi)谷胱甘肽的合成共同發(fā)揮抗氧化作用。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，在17℃保存的杜洛克豬精液中添加CYS 能有效維持精液品質(zhì)，其中以添加2 mmol/L的CYS 對(duì)豬精液保存效果最佳。該研究結(jié)果為CYS 作為抗氧化劑應(yīng)用到豬精液17℃保存中提供理論依據(jù)，也為深入研究CYS 發(fā)揮保護(hù)作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。