張迎燕，劉亞楠，鄭定黔，田若寧，徐麗，李昂，吳旭

（福建農(nóng)林大學動物科學學院（蜂學學院），福建福州 350002）

山麻鴨，也稱龍巖麻鴨，飼養(yǎng)量高達2.5～3 億只，是福建省數(shù)量最多、分布最廣的中小型蛋鴨品種。它具有體型小、早熟、產(chǎn)蛋量高、適應性強及飼料轉(zhuǎn)化率高等顯著特征。在我國禽蛋產(chǎn)業(yè)中，鴨蛋產(chǎn)量約占禽蛋總量的12%，具有重要的經(jīng)濟價值。

蛋殼特異性基質(zhì)蛋白是禽類蛋殼中主要的組成成分，其分布在蛋殼的各個區(qū)域，并伴隨不同階段蛋殼的礦化過程，發(fā)揮著不同的作用和功能。OC-116 蛋白是第一個被克隆的蛋殼特異性基質(zhì)蛋白。該蛋白質(zhì)主要以含有GAG（Glycosa Minoglycan）和不含GAG 的形式存在于禽類的蛋殼中。這2 種形式主要通過蛋白質(zhì)翻譯、糖基化轉(zhuǎn)化和寡糖基化修飾，從而形成蛋白聚糖，進而使該糖蛋白攜帶糖胺聚糖。糖胺聚糖因含有豐富陰離子，對Ca具有較強的結(jié)合親和力，這一特征有助于形成CaCO結(jié)晶體，而CaCO結(jié)晶體是禽類蛋殼重要的組成成分，因此，OC-116 蛋白聚糖對禽類蛋殼具有重要影響?；蚓幋a的氨基酸序列中載有2個N 糖基化位點和2個二硫化物結(jié)合物，在蛋殼鈣化的過程中起主要作用。Dunn 等以2 000 只母雞為材料，對傳統(tǒng)蛋殼性狀指標進行測定，并與基因進行了關聯(lián)分析，顯示該基因與蛋殼性狀指標有明顯的相關性。

本研究以山麻鴨作為實驗動物，從其子宮部組織中克隆基因，并進行了序列、理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)分析與預測、物種間同源性分析及不同組織中的表達譜分析，為進一步探究山麻鴨基因與蛋殼形成的相關性提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗樣品 于福建省龍巖市山麻鴨原種場隨機選取處于產(chǎn)蛋高峰期（30 周齡）的山麻鴨9 只，每3 只鴨子的同一組織混為一個樣品，共做3個重復。用手術(shù)刀和鑷子取心、肝、脾、肺、腎、胸肌、肌胃、下丘腦、垂體、卵巢、漏斗部、膨大部、峽部、子宮部組織，無菌生理鹽水沖洗后放入2 mL 的凍存管中，做好標記，迅速置于液氮中保存，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存。

1.2 引物設計與合成 根據(jù)綠頭鴨（Anas platyrhynchos）的基因（登錄號：XM_027456976）序列，設計基因的同源擴增引物，PCR 擴增并測序。設計3'RACE及5'RACE 擴增引物，做3'RACE 及5'RACE 實驗，獲得基因的3'末端及5'末端序列。設計的引物信息如表1 所示，引物由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。

表1 山麻鴨OC-116基因所有引物序列

1.3 組織RNA 提取與cDNA 合成 使用TaKaRa RNAwaso plus 試劑盒提取14個山麻鴨組織RNA，并檢測其總RNA 的濃度、純度以及完整性，-80℃保存。以山麻鴨的子宮部組織RNA 為模板，使用PrimeScript1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa,Code No.6110A）試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用Tks Gflex ? DNA Polymerase（TaKaRa,Code No.R060A）試劑盒對基因進行PCR 擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，切膠回收并測序。

1.4基因全長cDNA 的克隆 3' RACE 和5'RACE擴增實驗：3'RACE PCR 反應，根據(jù)同源擴增獲得的序列，設計合成3'RACE 引物，以子宮部獲得的cDNA 作為模板，使用上述引物，做2 次3'RACE PCR 擴增，分別切膠回收目的產(chǎn)物，對回收的PCR產(chǎn)物直接測序，均使用各自GSP 引物測序。5'RACE PCR 反應，根據(jù)已獲得序列，設計合成5'RACE PCR 引物。使用SMARTerRACE 5'/3'Kit（TaKaRa,Code No.634858）進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以獲得的cDNA 作為模板，做5'RACE PCR 擴增，以上述實驗中GSP1 引物擴增獲得的產(chǎn)物作為模板，用各5'RACE-GSP2 引物分別與Short 引物做5'RACE 套式PCR 擴增。切膠回收上述產(chǎn)物目的條帶，Infusion 克隆到pRACE 載體，挑選陽性克隆菌液，提取質(zhì)粒送往北京睿博興科生物技術(shù)有限公司進行測序。

序列線性關系擴增驗證：在RACE 實驗獲得的序列上，設計擴增引物，對3'RACE 及5'RACE 獲得的序列做線性關系驗證確認。

1.5基因的生物信息學分析 將山麻鴨基因的測序結(jié)果用DNAStar 軟件進行拼接，并與GenBank 登錄的基因序列進行BLAST分析。利用ExPASy 數(shù)據(jù)庫的ProtParam（http://expasy.org/tools/proparam.html）軟件分析氨基酸序列；利用SignalP4.1在線軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進行信號肽預測分析；通過TMHMM 在線工具（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）對編碼氨基酸的跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域進行預測；利用PredictProtein在線工具（http://www.predictprotein.org/）對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進行預測；利用MEGA-6.0 軟件，根據(jù)編碼的氨基酸序列信息，以N-J 算法，Bootstrap 設為1 000，對基因繪制系統(tǒng)進化樹，并進行遺傳進化分析。

1.6基因組織表達分析 實驗以山麻鴨14個組織樣品的cDNA 為模板，基因為內(nèi)參基因，進行實時熒光定量PCR 檢測，對14個組織樣品中基因的相對表達量進行分析。

1.7 統(tǒng)計分析 本研究所采用的定量法為相對定量法，參照2計算公式計算出基因在不同組織中的差異表達，并使用SPSS 22.0 軟件進行方差顯著性檢驗，以<0.05 表示差異顯著，<0.01 表示差異極顯著作為判斷標準，并用GraphPad Prism 7.00 繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1基因全長cDNA 序列的獲得 通過DNAstar軟件分析可知，基因的cDNA全長為2 129 bp，其中3'端序列長度為171 bp，5'端序列長度為50 bp，開放閱讀框的長度為1 908 bp，編碼635個氨基酸（圖1），其GeneBank 登錄號為：MW541048。

圖1 OC-116基因的全長cDNA 序列及氨基酸組成

2.2基因編碼氨基酸的理化性質(zhì)分析 結(jié)果表明，該基因預測的分子式為CHNOS，相對分子量為64 247.16。理論等電點（pI）為6.01，其有74個帶負電的殘基（Asp+Glu），62個帶正電的殘基（Arg+Lys）。對其進行不穩(wěn)定性預測，發(fā)現(xiàn)該蛋白是不穩(wěn)定性系數(shù)為73.58 的不穩(wěn)定蛋白。脂溶系數(shù)為58.76，總的平均親水系數(shù)為-0.565，其疏水值在第7個氨基酸處最大，在第70個氨基酸處最小，疏水值分別為3.067 和-2.700（圖2-A）?；蚓幋a的635 種氨基酸中，甘氨酸（16.5%）、丙氨酸（11%）、絲氨酸（10.2%）含量較高。

用Signal P4.1 在線軟件進行信號肽預測分析，結(jié)果由圖2-B 可知：該基因的預期剪切位點在16 至17個氨基酸之間。使用TMHMM 在線軟件預測跨膜結(jié)構(gòu)，可以看到該蛋白質(zhì)不包含跨膜結(jié)構(gòu)（圖2-C）。通過PredictProtein 軟件對山麻鴨OC-116 蛋白二級結(jié)構(gòu)預測分析可知，螺旋（Hh）、折疊（Ee）、和無規(guī)卷曲（Cc）分別占比0.47%、17.64%和81.89%。

圖2 OC-116 蛋白的理化性質(zhì)和蛋白結(jié)構(gòu)圖

2.3 山麻鴨基因同源性分析及系統(tǒng)進化樹構(gòu)建結(jié)果表明，基因與綠頭鴨和黑天鵝的核苷酸序列同源比對結(jié)果分別為100%和93.37%。與綠頭鴨、黑天鵝和棕硬尾鴨的氨基酸序列同源性分別為99.54%、89.78%和87.75%。根據(jù)編碼的氨基酸序列信息，使用MEGA 6.0 軟件構(gòu)建了12個生物的系統(tǒng)進化樹（圖3）。從圖中可以看出：與黑天鵝（XP_035410799.1）、綠頭鴨（EOB06364.1）和棕硬尾鴨（XP_035180566.1）的親緣關系最近，與原鴿（PKK28944.1）、原雞（NP_9 89900.1）、鸚鵡（KQK84288.1）、企鵝（XP_019327876.1）和杜鵑（XP_009557835.1）的親緣關系次之，與家燕（RMC13647.1）、鱷魚（XP_019382161.1）和烏龜（XP_039397699.1）的親緣關系最遠。

圖3 OC-116基因的系統(tǒng)進化樹

2.4 山麻鴨基因不同組織中的相對表達量分析應用qRT-PCR 方法對山麻鴨基因14個組織樣品的相對表達量進行分析（以卵巢為對照組），結(jié)果見圖4。結(jié)果顯示：mRNA 在子宮、峽部和垂體中的表達量極顯著高于其他組織。在肺、膨大部和漏斗部中的表達也相對較高；但在卵巢，腎臟和心臟中，以及胸肌中的表達水平相對較低；下丘腦、脾臟、肝臟和肌胃組織中的表達水平達到最低。

圖4 OC-116基因在山麻鴨不同組織中的mRNA 相對表達量

3 討 論

OC-116 蛋白是蛋殼基質(zhì)蛋白中的一員，是一種與生物鈣化緊密關聯(lián)的蛋白質(zhì)。本實驗通過RACE 克隆技術(shù)獲得了山麻鴨基因的cDNA全長序列，其長度為2 129 bp，開放閱讀框為1 908 bp，可編碼635個氨基酸，并對該基因編碼氨基酸的理化性質(zhì)進行分析，所得結(jié)果與該基因在其他禽類蛋殼中的研究結(jié)果相類似。說明基因在禽類中的進化過程中具有較高的保守性。對基因在NCBI 上進行Blastn 和Blastp多重比對發(fā)現(xiàn)，山麻鴨與黑天鵝、綠頭鴨和棕硬尾鴨的親緣關系最近，與家燕、鱷魚和烏龜?shù)挠H緣關系最遠。有研究表明，OC-116 蛋白在蛋殼鈣化層及表面有機層中均有分布，與蛋品質(zhì)的蛋形指數(shù)、蛋殼厚度及蛋殼強度密切相關。Mourik 等發(fā)現(xiàn)OC-116 蛋白是雞蛋殼基質(zhì)的主要成分，首先在蛋殼中鑒定到，參與蛋殼鈣化，對蛋殼品質(zhì)有重要的影響。Ahmed 等發(fā)現(xiàn)在強制換羽后老齡化母雞身上，OC-116 蛋白的含量會隨著蛋殼強度的增加而增加，推測OC-116 蛋白含量與蛋殼強度大小呈正相關。以上研究均表明OC-116 蛋白與禽類蛋品質(zhì)密切相關。雖然OC-116 蛋白在其他物種中已有研究，但在山麻鴨中是首次，對基因的克隆為進一步研究鴨蛋蛋品質(zhì)提供了豐富的生物信息學材料。

本實驗應用qRT-PCR 方法對基因在山麻鴨體內(nèi)14個組織中的相對表達量進行分析。結(jié)果顯示：該基因在子宮部、峽部和垂體中的表達量極顯著高于其他組織。在前人研究中已被證實這2個部位分別是蛋殼鈣化和蛋殼膜形成的重要部位，推測本研究中的基因在蛋殼形成過程中也發(fā)揮著類似的作用。葉幼榮對蛋雞不同產(chǎn)蛋期生殖器官中mRNA的相對定量進行研究，得到該基因在子宮部和峽部上的表達量最高，這一結(jié)果與本實驗結(jié)果相類似。Miksík等研究發(fā)現(xiàn)OC-116 蛋白是一種糖蛋白，它存在于蛋殼的多個部位，在蛋殼的乳頭層、角質(zhì)層、柵欄層中均能檢測到該蛋白的存在。表明該蛋白在蛋殼的形成過程中，主要通過鈣沉積的方式，來影響蛋殼表面的結(jié)晶體礦物質(zhì)，進而對蛋殼質(zhì)量產(chǎn)生影響。OC-116 蛋白是一種有利于蛋殼鈣化的蛋白多糖，它通過促進Ca的結(jié)合和沉淀從而有助于蛋殼的生物礦化過程。楊凌霄等發(fā)現(xiàn)基因主要作用于蛋殼表面的碳酸鈣和方結(jié)晶體，進而對蛋殼不同形成階段進行調(diào)控，從而影響蛋殼質(zhì)量。吳磊等以長順綠殼蛋雞為實驗材料對基因與蛋雞的蛋品質(zhì)性狀指標間進行了核苷酸多態(tài)位點關聯(lián)性分析，發(fā)現(xiàn)AA 基因型和CC 基因型均是改善蛋殼品質(zhì)的有利基因型，而雙倍型H2H2 是改善蛋殼品質(zhì)的有利雙倍型。以上研究均表明，基因在蛋殼的鈣化、礦化及蛋殼的形成過程中發(fā)揮著重要的作用，推測基因在山麻鴨蛋殼形成過程中也發(fā)揮著類似的作用。

4 結(jié) 論

本實驗首次克隆了山麻鴨基因的全長cDNA 序列，并做了組織表達譜。該基因在山麻鴨不同組織中均有表達，在子宮部和峽部中的表達量極顯著高于其他組織；其中子宮部和峽部分別是蛋殼礦化和蛋殼膜形成的部位，表明該基因在山麻鴨蛋殼的形成過程中扮演著重要角色，為以后研究提供了研究素材。