楊 光，霍雨佳，智達(dá)夫，蘇紅，楊宏新，竇傲蕾，曹貴方*

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

草原短尾羊是呼倫貝爾地區(qū)特有的綿羊品種，由于其肉質(zhì)鮮美、蛋白含量高和脂肪含量低，深受廣大消費(fèi)者喜愛。有研究通過對(duì)草原短尾羊和巴爾虎羊尾部進(jìn)行X 光觀察發(fā)現(xiàn)，相較于巴爾虎羊，草原短尾羊尾椎骨存在畸形；在基因組重測(cè)序結(jié)果和DNA 測(cè)序結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，短尾羊群體（T-box Transcription Factor T）基因發(fā)生c.G334T 錯(cuò)義替換，推測(cè)草原短尾羊的短尾性狀主要由尾椎骨畸形引起，且與基因的突變相關(guān)。該處突變可能會(huì)引起B(yǎng)rachyury 蛋白功能上的改變，進(jìn)而影響該蛋白與下游靶基因的結(jié)合，從而導(dǎo)致草原短尾羊尾椎骨畸形。草原短尾羊群體中也存在尾部長(zhǎng)短差異，所以也有研究指出綿羊尾部長(zhǎng)度的不同與Brachyury蛋白表達(dá)存在“劑量效應(yīng)”。是T-box 轉(zhuǎn)錄因子家族中最早發(fā)現(xiàn)的成員，也是中胚層發(fā)育的標(biāo)志基因，在基因突變小鼠中出現(xiàn)尾部變短的表型；進(jìn)一步對(duì)小鼠進(jìn)行基因型檢測(cè)發(fā)現(xiàn)短尾鼠均為突變雜合子，純合突變小鼠胚胎發(fā)育第10 天由于尿囊無法正常合成導(dǎo)致死亡，并且在其他短尾表型動(dòng)物中同樣發(fā)現(xiàn)基因突變會(huì)導(dǎo)致尾骨發(fā)育不良。mRNA 主要表達(dá)在小鼠胚胎發(fā)育時(shí)期，除在脊索細(xì)胞中能夠檢測(cè)到mRNA，在健康成年小鼠其他部位幾乎不表達(dá)；對(duì)綿羊的研究發(fā)現(xiàn)，mRNA 主要在胚胎的脊索細(xì)胞和原條中表達(dá)，mRNA 表達(dá)部位隨著胚胎發(fā)育時(shí)間的推移而不斷變化。目前，綿羊胚胎發(fā)育過程中mRNA 具體的表達(dá)趨勢(shì)還鮮見報(bào)道。NCBI 數(shù)據(jù)庫中綿羊mRNA 序列共有3 種可變剪切體，長(zhǎng)度分別為1 311 bp（登錄號(hào)：XM_027972732）、1 308 bp（登錄號(hào)：XM_027972733）、1 134 bp（登錄號(hào)：XM_004011450）;但在實(shí)驗(yàn)過程中有時(shí)會(huì)出現(xiàn)與以上均不匹配的另一種mRNA 可變剪切體。為了更深入地研究形成綿羊短尾性狀的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)獲取不同時(shí)期草原短尾羊胚胎，克隆cDNA全長(zhǎng)序列并對(duì)其蛋白質(zhì)理化性質(zhì)進(jìn)行分析，為研究草原短尾羊Brachyury蛋白質(zhì)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 草原短尾羊由呼倫貝爾鄂溫克錫尼河鎮(zhèn)蘇和巴特爾家庭牧場(chǎng)提供，公羊母羊自然交配當(dāng)天記為短尾羊胚胎第0 天，分別在胚胎14、16、20 d 和25 d對(duì)母羊進(jìn)行宰殺，從母體子宮內(nèi)解剖獲取草原短尾羊胚胎并迅速放入液氮中保存。

1.2 主要試劑 RNA fast 200 總RNA 極速抽提試劑盒購自上海飛捷生物技術(shù)有限公司；SanPrep 柱式DNA膠回收試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；SMARTer RACE 5'/3'Kit、DNA Markers、In-Fusion HD Cloning Kit 均購自TaKaRa 公司；Trans T1 Chemically Competent Cell 購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；5 min TA/Blunt-Zero Cloning Kit、2×Phanta Max Master Mix（Dye Plus）、ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix、HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit （+gDNA wiper）、質(zhì)粒小提試劑盒購自諾唯贊生物（南京）公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫中所登記的綿羊（Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase；登錄號(hào)：NM_001190390）和（登錄號(hào)：XM_027 972732）mRNA 序列設(shè)計(jì)qPCR、3'RACE 和5'RACE引物，引物序列發(fā)送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行合成，引物序列見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)用引物序列

1.4 草原短尾羊胚胎RNA 的提取及cDNA 合成 將草原短尾羊14、16、20 d 和25 d 胚胎剪碎后放入液氮中研磨，并按照RNA fast 200 總RNA 極速抽提試劑盒說明書進(jìn)行總RNA 提取。將提取后總RNA 按照HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)物于-20℃保存。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 將草原短尾羊各個(gè)時(shí)期胚胎cDNA 統(tǒng)一稀釋至100 ng/μL 作為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)基因mRNA 表達(dá)量。反應(yīng)體系為：2×ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix 1 μL、ddHO 7.2 μL、上下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL、cDNA 1 μL。反應(yīng)程序如下：預(yù)變性95℃ 30 s、循環(huán)反應(yīng)95℃10 s、60℃ 30 s、95℃ 15 s 共40個(gè)循環(huán)；熔解曲線反應(yīng)60℃ 60 s、95℃ 15 s。每個(gè)時(shí)期的胚胎均設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔檢測(cè)。反應(yīng)結(jié)束后使用Bio-Rad CFX 96 自帶軟件進(jìn)行分析，將軟件中輸出的Ct 進(jìn)行2計(jì)算，并將計(jì)算出的結(jié)果使用GraphPad Prism 9 軟件繪制柱形圖。使用軟件中的Independent-Samples T Test 進(jìn)行F檢驗(yàn)和T 檢驗(yàn)。

1.6基因的RACE 克隆基因已知片段克隆：將草原短尾羊胚胎cDNA 作為模板，Brachyury 上、下游引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系如下：上、下游引物（10 μmol/L）各2 μL、cDNA 1 μL、ddHO 20 μL、2×Phanta Max Master Mix（Dye Plus）25 μL。反應(yīng)程序如下：預(yù)變性95 ℃ 3 min；循環(huán)程序共30個(gè)循環(huán)包括變性95℃ 15 s、退火60℃ 15 s、延伸72℃ 3 s；徹底延伸72 ℃ 5 min。將擴(kuò)增后的產(chǎn)物連接至pCE2 TA/Blunt-Zero 載體并轉(zhuǎn)化至Trans T1 大腸桿菌中，涂至具有氨芐抗性的固體LB 平板，挑取單克隆菌落用LB 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h 并提取質(zhì)粒，將質(zhì)粒送往生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。基因3'RACE 和5'RACE擴(kuò)增按照SMARTer RACE 5'/3'Kit 說明書進(jìn)行。3'RACE和5'RACE 產(chǎn)物無縫克隆連接至Lineareized pRACE vector，無縫克隆連接體系和連接條件按照In-Fusion HD Cloning Kit 說明書進(jìn)行。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至Trans T1 大腸桿菌中，涂至具有氨芐抗性的固體LB 平板，挑取5個(gè)單克隆菌落，用LB 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h 并提取質(zhì)粒，將質(zhì)粒送往生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.7 草原短尾羊基因序列分析 將測(cè)序后的序列使用DNAMAN 軟件進(jìn)行拼接后獲得基因cDNA全長(zhǎng)序列，使用DNA star 軟件將基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)（CDS）翻譯成氨基酸序列并輸入NCBI Blast進(jìn)行序列比對(duì)，將比對(duì)后結(jié)果篩選并使用Mega 7 軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建，方法使用鄰接法（Neighbor-Joining），自聚值為1000；使用SignalP 4.1（www.cbs.dtu.dk）網(wǎng)頁工具預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)信號(hào)肽；使用Swiss modle（beta.swissmodel.expasy.org）網(wǎng)頁工具預(yù)測(cè)Brachyury蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)；使用ProtScale（web.expasy.org）網(wǎng)頁工具預(yù)測(cè)Brachyury 蛋白質(zhì)親疏水性；使用PSIPRED v4.0（bioinf.cs.ucl.ac.uk） 和SOPMA（prabi.ibcp.fr）網(wǎng)頁工具預(yù)測(cè)Brachyury 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和計(jì)算各類二級(jí)結(jié)構(gòu)的比例。

2 結(jié)果與分析

2.1 草原短尾羊各個(gè)時(shí)期胚胎基因相對(duì)表達(dá)量鑒定 如圖1 所示，基因在草原短尾羊16 d 胚胎表達(dá)量高于其他胚胎時(shí)期，14 d 胚胎時(shí)期略低于16 d胚胎，20 d 胚胎mRNA 的表達(dá)量遠(yuǎn)低于16 d 胚胎時(shí)期，在25 d 胚胎時(shí)期mRNA 幾乎不表達(dá)，說明14 d 至20 d 胚胎正處于中胚層細(xì)胞分化階段，在25 d 胚胎內(nèi)中胚層細(xì)胞分化已停止。

圖1 TBXTmRNA 在草原短尾羊各個(gè)時(shí)期胚胎中的相對(duì)表達(dá)量

2.2基因的RACE 克隆 如圖2 所示，以草原短尾羊16 d 胚胎cDNA 為模板進(jìn)行基因cDNA全長(zhǎng)克隆結(jié)果，其中第1 輪3’RACE 巢式PCR 產(chǎn)物經(jīng)過1% 瓊脂糖凝膠電泳顯示結(jié)果為涂帶，5’RACE 巢式PCR 產(chǎn)物經(jīng)過1% 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示條帶位置 在100 bp左右；將 第1 輪3’RACE 和5’RACE 巢式PCR 產(chǎn)物稀釋后作為模板進(jìn)行第2 輪巢式PCR，第2 輪3’RACE 巢式PCR 產(chǎn)物電泳后顯示條帶在2 000 bp至1 000 bp之間，第2 輪5’RACE巢式PCR 產(chǎn)物電泳后顯示條帶在750 bp 至500 bp 之間，已知片段在2 000 bp 至1 000 bp 之間，條帶符合預(yù)期片段大小。

圖2 草原短尾羊TBXT基因電泳檢測(cè)

2.3 草原短尾羊基因序列分析 如圖3 所示，將測(cè)序后的序列使用DNAMAN 軟件進(jìn)行序列拼接獲得草原短尾羊基因cDNA全長(zhǎng)序列共2 426 bp，其中開放閱讀框1 335 bp，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA，通過軟件翻譯預(yù)測(cè)編碼444個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)為6.912，分子量為48 328.56 道爾頓。并將拼接后的cDNA全長(zhǎng)序列上傳至NCBI 數(shù)據(jù)庫（登錄號(hào)：MZ146381）；3’非編碼區(qū)（3’UTR）和ployA 尾長(zhǎng)度為763 bp，5’非編碼區(qū)（5’UTR）長(zhǎng)度為328 bp；對(duì)該基因進(jìn)行核苷酸序列組成分析后發(fā)現(xiàn)腺嘌呤（A）含量為22.67%、鳥嘌呤（G）含量為28.44%、胞嘧啶（C）含量為30.05%和胸腺嘧啶（T）含量為18.76%。鳥嘌呤（G）和胞嘧啶（C）所占比率為58.49%，高于腺嘌呤（A）和胸腺嘧啶（T）所占比率41.43%。

圖3 草原短尾羊TBXTcDNA全長(zhǎng)序列和預(yù)測(cè)氨基酸序列

如圖4 所示，將預(yù)測(cè)后草原短尾羊氨基酸序列輸入NCBI 網(wǎng)站中Protein BLAST 進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果顯示草原短尾羊Brachyury 與山羊、羚羊、牛、鹿、海豚、豬、狗、豹、人、羊駝相似性分別為95%、94%、94%、94%、91%、90%、90%、90%、90%、90%；并將以上序列下載后使用Mega 7 軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建，自舉值為1 000，結(jié)果顯示草原短尾羊與山羊?qū)偻贿M(jìn)化分支，與人和羊駝進(jìn)化距離較遠(yuǎn)。

圖4 預(yù)測(cè)Brahcyury 氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹

如圖5A 所示，將預(yù)測(cè)后草原短尾羊氨基酸序列輸入Swiss modle 網(wǎng)頁工具使用同源建模法預(yù)測(cè)Brachyury 蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)，QMEAN 值為-1.04，可信值在-4～0 內(nèi)，表示該模型可信度較高，如圖5B 所示，使用ProtScale 網(wǎng)頁工具預(yù)測(cè)Brachyury 蛋白質(zhì)親疏水性，結(jié)果表示Brachyury 蛋白為疏水蛋白；如圖5C 和表2 所示，Brachyury 蛋白無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)占比最多占整體結(jié)構(gòu)的56.53%，-螺旋、片層和-彎曲分別占總體的21.40%、16.22%和5.86%。

圖5 Brachyury 蛋白理化性質(zhì)分析

表2 各類二級(jí)結(jié)構(gòu)占Brachyury 蛋白的比例

3 討 論

在綿羊的早期胚胎發(fā)育過程中，伴隨著中胚層細(xì)胞的分化，mRNA 的表達(dá)量逐漸降低；最后該基因僅在脊索細(xì)胞中表達(dá)。mRNA 主要表達(dá)部位為胚胎中的原條，其功能為維持原條中表皮細(xì)胞的遷移能力。本研究發(fā)現(xiàn)草原短尾羊16 d 胚胎中mRNA 表達(dá)量最高，表明該時(shí)期的綿羊胚胎中胚層細(xì)胞分化較為旺盛，結(jié)合Michel 等人的研究可以發(fā)現(xiàn)，此時(shí)的mRNA 可能表達(dá)于胚胎原條中部和尾部。在16 d 后mRNA 的表達(dá)量逐漸降低，推測(cè)胚胎中原條逐漸退化成脊索細(xì)胞。在小鼠胚胎中的研究發(fā)現(xiàn)，Brachyury 是脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)育過程中的關(guān)鍵因子，許多參與上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的基因需要Brachyury 的激活才能促使體節(jié)的形成；由于基因突變，胚胎原條中的表皮細(xì)胞遷移能力受損，導(dǎo)致胚胎的后部沒有脊索細(xì)胞，即使胚胎前部有少部分脊索細(xì)胞但不能正常分化，導(dǎo)致小鼠體節(jié)的缺失或發(fā)育異常。在小鼠胚胎發(fā)育過程中mRNA 最高表達(dá)時(shí)期為第8.5 天，此時(shí)小鼠胚胎中原條向中胚層祖細(xì)胞分化，Brachyury作為轉(zhuǎn)錄激活劑調(diào)節(jié)這一過程，而小鼠胚胎8.5 d 可能與16 d 綿羊胚胎所處的發(fā)育階段相互對(duì)應(yīng)，推測(cè)胚胎所處時(shí)期同為中胚層細(xì)胞分化和胚胎體軸延伸時(shí)期，Clements 等認(rèn)為在胚胎發(fā)育過程中mRNA 表達(dá)的梯度很可能與表皮生長(zhǎng)因子的調(diào)控作用正相關(guān)，然而在綿羊胚胎發(fā)育過程中這一復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制亟待深入探究和證實(shí)。

本研究以16 d 胚胎cDNA 為模板，使用RACE 技術(shù)克隆草原短尾羊基因cDNA全長(zhǎng)，所獲得的開放閱讀框長(zhǎng)度均大于NCBI 和Ensmble 數(shù)據(jù)庫中所公開的序列，經(jīng)過序列對(duì)比后發(fā)現(xiàn)主要的Gaps 部位集中在第4 外顯子和第5 外顯子內(nèi)，在不同組織或者同一組織的不同發(fā)育階段，可變剪切的形式不是一成不變的，可變剪切形式的增多極大地豐富了真核動(dòng)物的蛋白質(zhì)多樣性；在綿羊胚胎中得到mRNA 還具有哪些生物學(xué)意義需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

既作為胚胎發(fā)育時(shí)期的重要轉(zhuǎn)錄因子，也作為對(duì)草原短尾羊短尾性狀成因研究中的候選基因，對(duì)其蛋白功能上的研究十分必要，對(duì)突變Brachyury 蛋白與野生Brachyury 蛋白在結(jié)構(gòu)上差異的認(rèn)知，有助于深入討論突變后的Brachyury 蛋白如何影響下游靶基因的結(jié)合。有研究針對(duì)短尾羊和大尾羊的雜交實(shí)驗(yàn)表明，由于綿羊中c.334G>T 錯(cuò)義替換導(dǎo)致綿羊尾部變短，同時(shí)也有其他研究中指出，影響草原短尾羊和巴爾虎羊尾部長(zhǎng)短差異的原因在于尾部的脂肪沉積，由此可以推測(cè)影響草原短尾羊尾部表型的原因可能不止一種。由于前人關(guān)于綿羊基因的研究較少，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可作為參考并從草原短尾羊16 d 胚胎中獲取高豐度的mRNA，進(jìn)一步體外制備Brachyury 蛋白，探究其突變位點(diǎn)對(duì)草原短尾羊尾椎骨發(fā)育的影響。

4 結(jié) 論

本研究對(duì)14、16、20 d 和25 d 草原短尾羊胚胎中mRNA 表達(dá)量進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)16 d 胚胎中表達(dá)量最高并以其cDNA 為模板，成功克隆cDNA 序列全長(zhǎng)序列，為研究綿羊短尾性狀的形成機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。