楚 丹，冉茂良，卞橋，熊錦翼，陳斌*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128；2.畜禽遺傳改良湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙 410128）

microRNA（miRNA）是一類(lèi)廣泛存在于生物體內(nèi)的內(nèi)源性、非編碼單鏈RNA 分子，數(shù)量多且長(zhǎng)度較短，在生物體內(nèi)廣泛發(fā)揮作用，主要在轉(zhuǎn)錄后靶向結(jié)合靶基因并使其沉默而發(fā)揮影響基因表達(dá)的調(diào)控作用。研究表明，miRNA 參與調(diào)控細(xì)胞凋亡、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、造血功能、脂肪細(xì)胞調(diào)控等，在眾多生物學(xué)過(guò)程中通過(guò)不同的調(diào)節(jié)途徑發(fā)揮重要作用。miRNA 還與腫瘤的形成和發(fā)展嚴(yán)密相關(guān)，其中miR-139 是近年來(lái)研究抑癌作用的熱點(diǎn)miRNA，研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-139 能夠抑制腫瘤細(xì)胞的多種惡性表型，并以miR-139表達(dá)水平作為預(yù)后預(yù)測(cè)參考指標(biāo)，由此看出miR-139具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。研究發(fā)現(xiàn)，miR-139 與其宿主基因的表達(dá)存在差異，在結(jié)腸癌細(xì)胞與胃癌細(xì)胞中以彼此獨(dú)立的形式各自發(fā)揮作用，卻在非小細(xì)胞型肺癌細(xì)胞中同步表達(dá)，這表明miR-139 作為癌癥相關(guān)的miRNA 其調(diào)控受到多種因素影響，可能存在多種調(diào)控模式。不僅如此，miR-139 表達(dá)量還與少精子癥呈現(xiàn)顯著相關(guān)性，miR-139 還能一定程度預(yù)示雄性生殖問(wèn)題。除癌癥疾病等問(wèn)題之外，miR-139 對(duì)于畜禽的繁殖以及生長(zhǎng)發(fā)育也有重要影響，比如miR-139 被證實(shí)能靶控重要的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控因子，抑制miR-139 表達(dá)后能夠顯著促進(jìn)山羊乳腺上皮細(xì)胞的增殖而抑制其凋亡。另外降低豬表皮干細(xì)胞中miR-139 表達(dá)水平后，能有效促進(jìn)干細(xì)胞自我修復(fù)而加速傷口愈合。由此推斷，miR-139 可能通過(guò)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)參與并調(diào)控畜禽睪丸發(fā)育和精子生成。

本研究利用多個(gè)網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫(kù)以及在線軟件檢索miR-139 及其不同物種基因組中的位置并進(jìn)行多物種序列比對(duì)，選用鄰近法構(gòu)建距離參數(shù)為0.20 的多物種miR-139 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并使用RT-qPCR 實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)在豬7個(gè)發(fā)育階段的睪丸組織中miR-139 的表達(dá)差異及變化，分析miR-139 在物種進(jìn)化進(jìn)程中的正向選擇和在睪丸生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)趨勢(shì)，為進(jìn)一步了解剖析miR-139 的功能和作用機(jī)制以及后續(xù)的遺傳研究工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 miR-139 序列獲得 從miRBase 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.miRbase.org/cgi-bin/browse.pl）中下載獲得所有物種的miR-139 的成熟序列及其前體序列。

1.2 miR-139 定位 統(tǒng)計(jì)搜集到的所有物種miR-139 前體序列，利用Ensembl 數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST（http://asia.ensembl.org/index.html）程序?qū)ζ浠蚪M數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索（BLAST Assembled RefSeq Genomes），以確定miR-139 在基因組中的位置。

1.3 miR-139 系統(tǒng)進(jìn)化分析 對(duì)所收集到的miR-139前體序列在CLustal W 在線軟件上進(jìn)行多序列比對(duì)（Multiple Sequences Alignment，MSA），并將比對(duì)結(jié)果輸入到MEGA X 軟件中，采用基于距離參數(shù)0.20的鄰近法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建miR-139 的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.4 miR-139 在豬睪丸組織中的表達(dá) 采集1 日齡（D1）、30 日齡（D30）、60 日齡（D60）、90 日齡（D90）、120 日齡（D120）、150 日齡（D150）及180 日齡（DM）7個(gè)發(fā)育階段的正常健康沙子嶺公豬睪丸組織并利用傳統(tǒng)Trizol 裂解法提取各樣品的總RNA。將總RNA 通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄和反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，隨即進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)。內(nèi)參為U6，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)3個(gè)重復(fù)。以D1 為基準(zhǔn)采用2法計(jì)算多組別的miR-139 相對(duì)表達(dá)量。miR-139 引物序列見(jiàn)表1。

表1 miR-139 引物序列

1.5 靶基因預(yù)測(cè) 利用miRDB（http://mirdb.org/）、miRWalk（http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/）、TargetScan（http://www.targetscan.org/mamm_31/）、ENCORI（http://stafrbase.sysu.edu.cn/）4 種在線軟件預(yù)測(cè)人、小鼠和大鼠3個(gè)物種中miR-139 的靶基因，通過(guò)Draw Venn Diagram 對(duì)預(yù)測(cè)到的3個(gè)物種miR-139的靶基因取交集，獲得多物種間保守性高的靶基因。

1.6 miR-139靶基因GO和KEGG功能富集分析 采用DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）在線數(shù)據(jù)軟件對(duì)已獲得的miR-139 候選靶基因進(jìn)行GO 和KEGG 分析，并用R 語(yǔ)言軟件進(jìn)行功能富集分析。

2 結(jié)果

2.1 miR-139 的定位 在miRBase 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索共獲取44 條miR-139 基因的序列，廣泛存在于43個(gè)物種中，均具有典型莖-環(huán)二級(jí)結(jié)構(gòu)，屬于高度保守的基因（表2）。以這43 種物種的miR-139 前體序列作為查詢(xún)序列，分別對(duì)這些物種的基因組DNA 進(jìn)行BLAST 搜索，確定各個(gè)基因序列在基因組中的區(qū)域位置。結(jié)果可知，miR-139 主要分布在哺乳綱、爬行綱和魚(yú)類(lèi)動(dòng)物；在哺乳綱動(dòng)物之中，靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的miR-139 大部分位于第11 號(hào)染色體，僅獼猴的miR-139 位于14 號(hào)染色體，主要分布在負(fù)鏈，除此之外其他哺乳動(dòng)物的miR-139 在各染色體均有分布，如小鼠、褐家鼠、家犬、牛和豬分別分布在7、1、21、15 號(hào)和9 號(hào)染色體，且多位于正鏈；在魚(yú)類(lèi)動(dòng)物中miR-139 正負(fù)鏈均有分布。另外，有少數(shù)物種的基因定位和正負(fù)鏈目前未知，如：絨毛猴、斑馬魚(yú)、斑點(diǎn)叉尾鲴、鯉魚(yú)和鮭魚(yú)。造成miR-139 在不同種群中基因組DNA 分布差異和定位未知的情況，很有可能是在漫長(zhǎng)的基因進(jìn)化歷程中，發(fā)生一系列復(fù)雜的環(huán)境和生理等變化所導(dǎo)致的保留或丟失。

表2 miR-139 在不同物種中的分布特征

2.2 miR-139 序列同源性分析 運(yùn)用CLustal W 軟件對(duì)miR-139 的40 種典型物種的成熟序列進(jìn)行多序列比對(duì)分析（圖1），結(jié)果顯示，各物種序列長(zhǎng)度（19～25 nt）相近，共有18個(gè)保守堿基，分別位于第1～11 位、13～19 位，說(shuō)明miR-139 基因同源性較高，在不同物種間高度保守。比對(duì)結(jié)果還顯示，miR-139 基因在其進(jìn)化過(guò)程中某些堿基可能發(fā)生了缺失。例如，絨毛猴（）、倭黑猩猩（）、斑馬魚(yú)（）、熱帶爪蟾（）、短尾負(fù)鼠（）在第20 位、21 位和22 位分別缺失了堿基C、A 和G。此外，各物種miR-139 成熟序列的2～8 位堿基即種子序列完全相同，表現(xiàn)出較高的種間保守性。

圖1 miR-139 基因的成熟序列比對(duì)

2.3 miR-139 進(jìn)化分析 為了分析miR-139 的進(jìn)化關(guān)系，以miR-139 的前體序列為基準(zhǔn)，對(duì)來(lái)自40個(gè)物種的miR-139 構(gòu)建基于鄰近法（Neighbor-Joining,NJ）的ML 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2）。由圖2 可知，miR-139 主要分布在哺乳類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)、爬行類(lèi)和魚(yú)類(lèi)動(dòng)物中，總體上分布為2個(gè)大分支。其中哺乳類(lèi)動(dòng)物聚為一個(gè)分支，在此分支中又分成2個(gè)小分支，褐家鼠、豚鼠、絨毛猴和倭黑猩猩這4個(gè)物種自成一個(gè)小分支，人和小鼠的親緣關(guān)系可能較近；另外一個(gè)大分支主要包括魚(yú)類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)和爬行類(lèi)動(dòng)物，魚(yú)類(lèi)和鳥(niǎo)類(lèi)更密切地匯聚成一個(gè)小分支，爬行類(lèi)則在另一小分支中，而在這大分支中，哺乳類(lèi)的短尾負(fù)鼠、袋獾和鴨嘴獸也聚入其中。由此可見(jiàn)，miR-139 在不同物種的進(jìn)化歷程中存在較大的差異性和復(fù)雜性，推測(cè)miR-139 可能經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的復(fù)雜進(jìn)化和演變過(guò)程。

圖2 多物種miR-139 基因形成的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.4 miR-139 在豬睪丸組織中的表達(dá)分析 由實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)的結(jié)果（圖3）可知，miR-139 在沙子嶺豬睪丸組織中各個(gè)時(shí)期都有所表達(dá)，且在出生后至保育期的表達(dá)水平逐漸降低，性發(fā)育期的仔豬睪丸組織中miR-139 表達(dá)水平在120 d 上升又在150 d 有所下降，性成熟期表達(dá)水平又顯著升高。由此可知，miR-139 可能對(duì)睪丸發(fā)育和性生殖調(diào)控有重要影響作用。

圖3 豬睪丸組織不同時(shí)期中miR-139 的表達(dá)情況

2.5 miR-139靶基因GO功能富集分析 使用TargetScan 6.2軟件預(yù)測(cè)到153個(gè)候選靶基因，對(duì)這些靶基因進(jìn)行GO功能富集分析（圖4），結(jié)果表明，生物學(xué)過(guò)程中miR-139 的靶基因主要參與RNA 聚合酶II 啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、DNA 模板轉(zhuǎn)錄的正負(fù)調(diào)控、蛋白質(zhì)泛素化、軸突導(dǎo)向等；細(xì)胞成分層面，在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和胞外外泌體上集中散布；分子功能層面，與DNA、RNA 的poly A 端、金屬離子結(jié)合的靶基因顯著富集。GO 富集結(jié)果顯示，miR-139 的靶基因主要起結(jié)合、轉(zhuǎn)錄前調(diào)節(jié)的作用，并且大多數(shù)在細(xì)胞及其外泌體中發(fā)揮功能。

圖4 miR-139 靶基因的GO 分析

2.6 miR-139 靶基因KEGG 富集分析 對(duì)TargetScan 6.2軟件預(yù)測(cè)到的153個(gè)候選靶基因進(jìn)行KEGG 通路分析，共注釋到18 條通路（圖5），結(jié)果表明，預(yù)測(cè)到的miR-139 靶基因在10個(gè)信號(hào)通路中顯著富集，主要在沙門(mén)氏菌感染、催乳激素信號(hào)通路、癌癥通路、胰島素抵抗、粘著斑、結(jié)直腸癌、cAMP 信號(hào)通路、ARVC 通路、AMPK 信號(hào)通路和黏著連接發(fā)揮作用。其中多數(shù)基因富集在催乳激素信號(hào)通路、cAMP 信號(hào)通路、AMPK 信號(hào)通路和黏著連接處，對(duì)調(diào)控畜禽繁殖和生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程有重要作用。

圖5 miR-139 靶基因的KEGG 分析

2.7 miR-139 靶基因保守預(yù)測(cè) 由于miR-139 在物種間的高保守性，為避免單個(gè)網(wǎng)站預(yù)測(cè)結(jié)果的偶然性和假陽(yáng)性，利用miRDB、miRWalk、TargetScan、ENCORI 4個(gè)靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站中人、小鼠和大鼠3個(gè)物種miR-139靶基因的預(yù)測(cè)結(jié)果取交集實(shí)現(xiàn)物種豬miR-139 靶基因的預(yù)測(cè)。得到靶基因統(tǒng)計(jì)表（表3）和韋恩圖（圖6），4 種軟件靶基因取交集獲得保守豬源靶基因共25個(gè)。

圖6 4 種軟件對(duì)miR-139 靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果

表3 miR-139 靶基因統(tǒng)計(jì)

3 討 論

microRNA 是一類(lèi)重要的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子，數(shù)量多且短小，在生物體內(nèi)廣泛發(fā)揮作用，它們通常與mRNA 的5'-UTR 或3'-UTR 結(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控作用，是mRNA 基因表達(dá)或沉默的關(guān)鍵調(diào)控因子，參與動(dòng)植物體多種生物學(xué)過(guò)程并對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育起重要作用。本研究利用miRBase 數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站搜索miR-139，從已測(cè)序的43個(gè)動(dòng)物物種中獲得了44 條miR-139 基因序列，說(shuō)明其廣泛分布于不同物種中。多物種序列比對(duì)結(jié)果和系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹(shù)顯示，miR-139 經(jīng)歷了漫長(zhǎng)且復(fù)雜的進(jìn)化進(jìn)程，并在進(jìn)化過(guò)程中有多次堿基復(fù)制、增加或者缺失，但堿基第1～11 位、13～19 位完全一致，突變率低，多物種間此序列高度保守。而miRNA 與miRNA 之間往往又存在著復(fù)雜的調(diào)控通路或網(wǎng)絡(luò)，彼此之間共同作用進(jìn)而在生物體內(nèi)發(fā)揮影響作用。研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs 在睪丸組織發(fā)育和精子生成的各個(gè)階段中發(fā)揮著關(guān)鍵的功能作用。對(duì)此，冉茂良從不同發(fā)育日齡的公豬睪丸組織中鑒定出329個(gè)差異表達(dá)的miRNA，Chen也對(duì)豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行了miRNA 文庫(kù)分析，并發(fā)現(xiàn)存在68個(gè)miRNA 差異表達(dá)。本研究中也發(fā)現(xiàn)，miR-139 在豬睪丸組織發(fā)育的不同時(shí)期表達(dá)變化差異較大且與卞橋研究中miRNA-130a/b 基因家族在豬睪丸組織發(fā)育的不同時(shí)期表達(dá)趨勢(shì)一致。Luo 等人研究也發(fā)現(xiàn)miR-130a 能夠通過(guò)TGF-/smad5 信號(hào)通路和PI3K/AKT 信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)對(duì)豬睪丸支持細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)控，對(duì)精子發(fā)生過(guò)程有重要影響作用。

為更進(jìn)一步探究miR-139 在豬睪丸組織中的功能地位和作用途徑，本研究對(duì)miR-139 進(jìn)行多網(wǎng)站靶基因預(yù)測(cè)并進(jìn)行GO 和KEGG 分析。分析結(jié)果表明，miR-139 可能主要起結(jié)合、轉(zhuǎn)錄前調(diào)節(jié)的作用，并且大多數(shù)在細(xì)胞及其外泌體中發(fā)揮功能。注釋到的信號(hào)通路，除癌癥發(fā)展相關(guān)途徑以外，cAMP 信號(hào)通路、AMPK 信號(hào)通路等多個(gè)信號(hào)途徑都參與畜禽繁殖和生長(zhǎng)發(fā)育的影響調(diào)控過(guò)程。利用多個(gè)在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)到的保守豬源靶基因中，、、、、等多個(gè)靶基因?qū)π笄萆?、排卵或泌乳過(guò)程有重要調(diào)控作用。以上結(jié)果均提示miR-139 在調(diào)控雄性生殖發(fā)育和睪丸精子生成過(guò)程中可能有重要作用。

研究發(fā)現(xiàn)，miR-139 是一種與癌細(xì)胞高度相關(guān)的miRNA 分子，它在多種腫瘤組織中低表達(dá)，并能與其靶基因靶向聯(lián)結(jié)來(lái)調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡，如靶向結(jié)合、、、和分別對(duì)乳腺癌、前列腺癌、胃癌膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和肝癌的發(fā)生有重要影響作用。因此miR-139 也被認(rèn)為是腫瘤疾病相關(guān)的重要診斷基因，在未來(lái)臨床治療和預(yù)后方面有很大的功能作用以及應(yīng)用前景。除與癌癥形成發(fā)展密切相關(guān)以外，miR-139 對(duì)于畜禽的繁殖分泌等性狀也有重要影響。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-139 還能夠與（Growth Hormone Receptor）和（Type I Insulin-Like Growth Factor Receptor）的3'UTR區(qū)靶向結(jié)合抑制相關(guān)通路，進(jìn)而影響奶牛乳腺上皮細(xì)胞的表觀特征使其增殖力下降并降低-酪蛋白分泌水平，影響奶品質(zhì)。除GHR 和IGF1R，Zhou 等人發(fā)現(xiàn)miR-139 還能與（Dihydrofolate Reductase）的3'UTR區(qū)靶向結(jié)合，調(diào)控牛骨骼肌源性衛(wèi)星細(xì)胞的增殖和分化過(guò)程。因此，推測(cè)miR-139 可能與靶向結(jié)合調(diào)控相關(guān)細(xì)胞的增殖與凋亡進(jìn)而影響睪丸發(fā)育和精子發(fā)生過(guò)程。

4 結(jié) 論

本研究通過(guò)對(duì)miR-139 進(jìn)化、在豬睪丸組織中的表達(dá)變化分析以及靶基因預(yù)測(cè)及其GO 和KEGG 分析，發(fā)現(xiàn)miR-139 在多物種間序列高度保守，miR-139 可能與和靶向結(jié)合，激活或抑制其可能參與的信號(hào)通路，對(duì)公豬睪丸發(fā)育以及精子生成發(fā)揮重要調(diào)控作用。