王忠桂

摘 要：當(dāng)今食品安全問(wèn)題成為人們關(guān)注的重點(diǎn)問(wèn)題，食品行業(yè)機(jī)構(gòu)和相關(guān)部門(mén)一直致力于探尋低成本、高效率、方便快捷的微生物檢測(cè)方法，為食品生產(chǎn)加工過(guò)程中的質(zhì)量監(jiān)督提供可行方案。本文對(duì)PCR技術(shù)的種類(lèi)、特點(diǎn)與優(yōu)勢(shì)、應(yīng)用范圍、所面臨的問(wèn)題以及在食品微生物檢測(cè)中的運(yùn)用和發(fā)展情況進(jìn)行研究，為食品行業(yè)和相關(guān)部門(mén)提供參考和借鑒依據(jù)。

關(guān)鍵詞：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（PCR）;食品;微生物

Application of PCR Technology in the Detection of Food Microorganisms

WANG Zhonggui

（Hebei Lvnong Testing Technology Service Co.， Ltd.， Langfang 065400， China）

Abstract： Food safety issues in today’s society have become the focus of people’s attention. Food industry organizations and related departments have been committed to exploring low-cost， high-efficiency， convenient and quick microbial detection methods to provide feasible solutions for quality supervision in food production and processing. This paper studies the types， characteristics and advantages， application scope， problems faced and application and development of PCR technology in food microbial detection， and provides a reference for the food industry and related departments.

Keywords： Polymerase Chain Reaction（PCR）; food; microorganism

我國(guó)現(xiàn)階段的食品工業(yè)發(fā)展已進(jìn)入關(guān)鍵轉(zhuǎn)型升級(jí)期，由高速增長(zhǎng)階段邁向高質(zhì)量發(fā)展階段。食品的質(zhì)量安全作為人們生活中的首要問(wèn)題，與人們的生活健康息息相關(guān)，逐漸成為社會(huì)關(guān)注的熱點(diǎn)。食品安全是食品行業(yè)保持健康發(fā)展的基石[1]。食品生產(chǎn)過(guò)程中一旦發(fā)生微生物污染，將會(huì)對(duì)人體的健康產(chǎn)生危害。因此，需要加強(qiáng)食品中的微生物檢測(cè)來(lái)提升食品質(zhì)量安全[2]。PCR技術(shù)是一種較先進(jìn)的檢測(cè)技術(shù)，在多個(gè)領(lǐng)域均有較廣泛應(yīng)用，在食品微生物檢測(cè)領(lǐng)域，PCR技術(shù)具有準(zhǔn)確性高、操作便捷的特點(diǎn)，可有效檢測(cè)食品中的微生物含量。因此，食品微生物檢測(cè)中需摒棄操作復(fù)雜且準(zhǔn)確率差的檢測(cè)方法，發(fā)揮PCR技術(shù)的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)，提高食品微生物檢測(cè)的時(shí)效性和準(zhǔn)確性[3]。

1 PCR技術(shù)概述

1983年MILLUS博士發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術(shù)，該技術(shù)是一種能對(duì)生物體DNA進(jìn)行復(fù)制、擴(kuò)增的技術(shù)，可對(duì)特定生物體的特定DNA的序列進(jìn)行復(fù)制擴(kuò)增。PCR技術(shù)的DNA擴(kuò)增過(guò)程分為3個(gè)階段，即變性階段、退火階段、延伸階段。變性階段中將DNA雙鏈打開(kāi);在退火階段中將特性異物與打開(kāi)的DNA單鏈進(jìn)行結(jié)合;在延伸階段中，使用DNA聚合酶以DNA單鏈為模板進(jìn)行DNA的合成，實(shí)現(xiàn)DNA分子的大量擴(kuò)增，從而獲得大量的DNA分子并進(jìn)行檢測(cè)分析[4]。PCR技術(shù)的特殊性在食品微生物檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用，通過(guò)PCR技術(shù)對(duì)食品中所含有的微生物的DNA進(jìn)行檢測(cè)，以確定食品中含有的微生物的含量和種類(lèi)。PCR技術(shù)可以提高食品微生物的檢出率、時(shí)效性以及準(zhǔn)確性，及時(shí)排除食品微生物污染對(duì)人們健康的威脅，提高食物安全屏障。

2 PCR技術(shù)的應(yīng)用類(lèi)型

2.1 普通PCR技術(shù)

通過(guò)PCR技術(shù)可以特異性地?cái)U(kuò)充待檢微生物的基因片段，以實(shí)現(xiàn)快速獲得檢驗(yàn)結(jié)果的目的，與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，PCR技術(shù)具有操作便捷、靈敏度高的特點(diǎn)，檢測(cè)人員一般只要幾個(gè)小時(shí)即可完成食品微生物的測(cè)定工作。其缺點(diǎn)是在目前的實(shí)際應(yīng)用中，尚無(wú)法對(duì)待檢測(cè)樣品中的活體細(xì)胞和死亡細(xì)胞進(jìn)行鑒別，只能對(duì)已知微生物的核酸序列進(jìn)行測(cè)定。因此，還需要對(duì)食品中微生物對(duì)PCR技術(shù)的特異性反應(yīng)進(jìn)行更深入的研究。

2.2 多重PCR技術(shù)

多重PCR技術(shù)（Multiplex Polymerase Chain Reaction，mPCR）的工作原理是在同一PCR擴(kuò)增過(guò)程中加上兩對(duì)以上的引物，實(shí)現(xiàn)一次性完成多個(gè)核酸片段擴(kuò)增的目的，使檢測(cè)過(guò)程更加方便、快捷。例如，大腸桿菌、致病性弧菌和沙門(mén)氏菌等細(xì)菌就可以進(jìn)行同步檢測(cè)。與傳統(tǒng)檢測(cè)方法需大量生化實(shí)驗(yàn)相比，多重PCR技術(shù)可通過(guò)一次性擴(kuò)增來(lái)進(jìn)行批量檢測(cè)，實(shí)用性和應(yīng)用性較強(qiáng)。在食品微生物檢測(cè)工作中，結(jié)合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，多重PCR技術(shù)可大量減少檢驗(yàn)工作量，縮短檢測(cè)時(shí)間，進(jìn)行快速初篩，在大幅提升工作效率的同時(shí)還可以降低檢測(cè)成本[5]。多重PCR技術(shù)的缺點(diǎn)是存在假陰性的情況。因此，需提升樣品質(zhì)量，排出干擾因子的影響，改進(jìn)樣品處理工作。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)

熒光定量PCR技術(shù)（Quantitative Real-time PCR）屬于分子生物學(xué)范疇，因此該技術(shù)可以結(jié)合先進(jìn)生物技術(shù)進(jìn)行應(yīng)用，是在普通PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上利用熒光特性的不同進(jìn)行核酸定量測(cè)定，具有敏感度高、檢測(cè)范圍寬、穩(wěn)定性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，且該方法無(wú)需進(jìn)行PCR后續(xù)處理，可有效避免交叉感染，保障檢查結(jié)果的精準(zhǔn)性，目前在國(guó)內(nèi)外食品微生物快速檢測(cè)領(lǐng)域已廣泛應(yīng)用到熒光定量PCR技術(shù)[6]。但熒光定量PCR技術(shù)依然存在假陽(yáng)性結(jié)果的缺點(diǎn)，且儀器設(shè)備昂貴，使用成本較高。

2.4 RT-PCR檢測(cè)技術(shù)

逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）是一種更先進(jìn)的檢測(cè)技術(shù)，食品中所含有的大部分微生物種類(lèi)均能使用該技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，且檢測(cè)準(zhǔn)確度高、靈敏性強(qiáng)，還可用于檢測(cè)食品中含有的不同微生物種類(lèi)，對(duì)不同微生物的特征進(jìn)行區(qū)分。

3 PCR技術(shù)的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)

傳統(tǒng)食品微生物檢測(cè)一般采用顯微鏡直接觀察法和平板計(jì)數(shù)法，傳統(tǒng)檢測(cè)方法的工作原理是對(duì)活菌的總數(shù)進(jìn)行人工測(cè)定，以上兩種檢測(cè)方法具有設(shè)備簡(jiǎn)易、操作簡(jiǎn)單且成本低廉的優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用較為廣泛。但這兩種方法也存在明顯的缺點(diǎn)，其操作過(guò)程和結(jié)果較依賴(lài)于檢測(cè)人員的操作技術(shù)和鑒別能力，具有一定的主觀性，且整個(gè)檢測(cè)過(guò)程工作較煩瑣，試驗(yàn)周期較長(zhǎng)。因此，這兩種檢測(cè)方法難以保證其結(jié)果的客觀性、準(zhǔn)確性和時(shí)效性，特別是在進(jìn)行大批量檢測(cè)工作時(shí)，所需人力、物力較大且時(shí)效性非常差[7-8]，而使用PCR技術(shù)進(jìn)行食品微生物檢測(cè)，可快速得到檢測(cè)結(jié)果，時(shí)效性高且準(zhǔn)確率能得到保障。

3.1 操作流程便捷

傳統(tǒng)食品微生物檢測(cè)工作周期長(zhǎng)、時(shí)效性差、檢查結(jié)果具有主觀性、欠缺準(zhǔn)確度和整體工作效率較低。而應(yīng)用PCR技術(shù)只需一名工作人員即可進(jìn)行檢測(cè)工作，時(shí)效性和準(zhǔn)確率高。

3.2 準(zhǔn)確率高

食品中含有的微生物數(shù)量和種類(lèi)較多，不同種類(lèi)的微生物具有不同特征，造成檢測(cè)方法差異較大，傳統(tǒng)檢測(cè)方法難以對(duì)微生物種類(lèi)進(jìn)行鑒別區(qū)別。PCR技術(shù)可依據(jù)其技術(shù)特點(diǎn)對(duì)微生物種類(lèi)進(jìn)行有效鑒別與區(qū)分，是保障食品安全的重要技術(shù)。

3.3 時(shí)效性高

傳統(tǒng)食品微生物檢測(cè)技術(shù)對(duì)一般菌種的檢測(cè)需花費(fèi)2 d以上的時(shí)間才能得到檢測(cè)結(jié)果，時(shí)效性較差，對(duì)于突發(fā)性食品安全事件無(wú)法及時(shí)采取有效應(yīng)對(duì)措施，滯后的檢測(cè)結(jié)果會(huì)導(dǎo)致受微生物污染的食品流入市場(chǎng)，對(duì)消費(fèi)者的健康造成較大危害。PCR技術(shù)的檢測(cè)過(guò)程在1 d內(nèi)即可完成，可快速、及時(shí)地得到檢測(cè)結(jié)果，對(duì)指導(dǎo)食品安全生產(chǎn)以及保障消費(fèi)者的健康安全具有重要意義[9]。

4 PCR技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中應(yīng)用

4.1 致病菌的檢測(cè)

在食品微生物檢測(cè)工作中，致病菌是一項(xiàng)重要檢測(cè)項(xiàng)目，傳統(tǒng)檢測(cè)方法操作過(guò)程較煩瑣，需進(jìn)行菌種培養(yǎng)、收集分離以及檢測(cè)等環(huán)節(jié)，檢測(cè)周期一般在5 d以上，限制了食品監(jiān)督部門(mén)的工作效率，而PCR技術(shù)可有效縮減致病菌檢測(cè)周期，提高食品監(jiān)督部門(mén)的工作效率。致病菌的檢測(cè)流程如下。①富集細(xì)菌，通過(guò)離心過(guò)濾等方式進(jìn)行細(xì)菌分離;②裂變過(guò)程，將獲得的DNA進(jìn)行檢測(cè);③使用特異性核酸探針和電泳來(lái)完成檢測(cè)DNA序列的工作，最終確定病菌的數(shù)量和種類(lèi)。PCR技術(shù)在致病菌檢測(cè)上始于沙門(mén)氏菌，目前對(duì)該病菌的檢測(cè)方案已較為成熟[10]。隨著技術(shù)發(fā)展，PCR技術(shù)也在不斷拓寬技術(shù)應(yīng)用范圍，不僅可以對(duì)沙門(mén)氏菌進(jìn)行有效檢測(cè)，還能應(yīng)用于金黃色葡萄球菌的檢測(cè)。

4.2 非致病菌的檢測(cè)

PCR技術(shù)可有效檢測(cè)食品中的非致病菌，但對(duì)于非致病菌的檢測(cè)范圍存在局限性，對(duì)食品中乳酸菌的檢測(cè)應(yīng)用較多。乳酸菌是一種分布廣泛的非致病菌，具有較高的生物學(xué)價(jià)值。研究表明，大部分乳酸菌有益于人體健康，少部分乳酸菌對(duì)消費(fèi)者健康存在危害。乳酸菌對(duì)各種生長(zhǎng)環(huán)境的適應(yīng)性較強(qiáng)，即使真空中乳酸菌也能生存。在食品生產(chǎn)中，乳酸菌應(yīng)用較廣，常作為添加劑來(lái)使用。部分乳酸菌可作為防腐劑，能顯著抑制食物腐敗過(guò)程，延長(zhǎng)食品保質(zhì)期。使用PCR技術(shù)對(duì)乳酸菌進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，需充分了解乳酸菌的知識(shí)背景和生產(chǎn)規(guī)律，能夠快速得到乳酸菌的菌落資料，然后進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，檢測(cè)其發(fā)酵過(guò)程，監(jiān)測(cè)食品在此過(guò)程中的腐敗程度，確定保質(zhì)期的有效性[11]。另外，PCR技術(shù)也可應(yīng)用于酸奶中的乳酸菌檢測(cè)且準(zhǔn)確度較高。

5 PCR技術(shù)應(yīng)用于食品微生物檢測(cè)所面臨的問(wèn)題

食品生產(chǎn)過(guò)程中的微生物污染途徑較多，影響范圍也較大，是食品安全的關(guān)鍵問(wèn)題。隨著社會(huì)發(fā)展，食品生產(chǎn)規(guī)模不斷擴(kuò)大，同時(shí)危害來(lái)源也不斷增多，微生物污染范圍廣且檢測(cè)范圍增大。在現(xiàn)有的技術(shù)水平和生產(chǎn)規(guī)模下，食品微生物的檢測(cè)工作也隨之增加，而檢測(cè)技術(shù)的欠缺，導(dǎo)致食品污染事件發(fā)生概率增大。

6 在食品微生物檢測(cè)中如何加強(qiáng)運(yùn)用PCR技術(shù)

食品檢測(cè)部門(mén)廣泛存在工作人員綜合能力素養(yǎng)水平不高的現(xiàn)象，因此應(yīng)注意人才引進(jìn)工作，尤其是針對(duì)PCR技術(shù)的培訓(xùn)工作需加強(qiáng)，才能提升檢測(cè)部門(mén)的工作效果和工作效率。加大檢測(cè)人員的培養(yǎng)和支持力度，完善PCR檢測(cè)技術(shù)的人才培養(yǎng)機(jī)制，重視檢測(cè)人員的專(zhuān)業(yè)技能培訓(xùn)，制定具體有效的培訓(xùn)方案，提升PCR技術(shù)工作人員的知識(shí)水平和技術(shù)能力，幫助檢測(cè)人員樹(shù)立正確的工作態(tài)度和理念，提升職業(yè)道德素養(yǎng)，更好地保障食品生產(chǎn)的安全。

7 結(jié)語(yǔ)

食品生產(chǎn)質(zhì)量安全工作與食品微生物檢測(cè)技術(shù)具有密切聯(lián)系，為了不斷提升食品微生物檢測(cè)的準(zhǔn)確性和時(shí)效性，更好地滿(mǎn)足人們對(duì)食品質(zhì)量安全的要求。我國(guó)正處于產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型時(shí)期，PCR技術(shù)的應(yīng)用仍處于發(fā)展階段，相關(guān)部門(mén)和企業(yè)應(yīng)注重提升食品檢測(cè)人員的綜合能力以及素養(yǎng)水平，提升對(duì)PCR技術(shù)的認(rèn)知，拓展對(duì)PCR技術(shù)的實(shí)踐、應(yīng)用能力，提高檢測(cè)工作的準(zhǔn)確性和有效性，使PCR技術(shù)發(fā)揮保障食品安全，維護(hù)良好的食品市場(chǎng)環(huán)境的作用。

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