摘要：CsBLH7與CsKNAT4分別屬于BELL類蛋白與KNOX類蛋白，可能與植物器官形態(tài)建成密切相關(guān)，但目前幾乎沒有關(guān)于CsBLH7與CsKNAT4蛋白互作的深入研究報(bào)道。采用酵母雙雜交初步確定CsBLH7與CsKNAT4能夠在細(xì)胞體內(nèi)互作，形成BLH7-KNAT4蛋白復(fù)合物。雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）進(jìn)一步確定了這種互作關(guān)系。原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染試驗(yàn)結(jié)果表明，CsBLH7與CsKNAT4分別為轉(zhuǎn)錄抑制因子與轉(zhuǎn)錄激活因子。同時(shí)，針對(duì)35S：CsBLH7、35S：CsKNAT4材料的形態(tài)分析結(jié)果表明，下胚軸細(xì)胞長(zhǎng)度分別縮短與伸長(zhǎng)，這與它們的轉(zhuǎn)錄活性相適應(yīng)。再者，35S：CsBLH7、35S：CsKNAT4遺傳材料的赤霉素合成酶基因分別下調(diào)與上調(diào)。研究結(jié)果表明，BLH7-KNAT4可能是通過調(diào)節(jié)赤霉素合成來調(diào)控下胚軸細(xì)胞長(zhǎng)度，對(duì)揭示CsBLH7和CsKNAT4調(diào)控植物形態(tài)建成分子機(jī)理具有重要意義。

關(guān)鍵詞：CsBLH7;CsKNAT4;蛋白互作;BiFC;下胚軸細(xì)胞;轉(zhuǎn)錄活性;植物形態(tài)建成

中圖分類號(hào)： S563.301? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2022）06-0041-04

收稿日期：2021-06-11

基金項(xiàng)目：黑龍江省自然科學(xué)基金（編號(hào)：LH2020C097）;黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院國(guó)自然培育項(xiàng)目（編號(hào)：2019JJPY003）;黑龍江省麻類科技創(chuàng)新基金（編號(hào)：MLCX-20）;特色經(jīng)濟(jì)作物綠色種植技術(shù)示范推廣項(xiàng)目（編號(hào)：KYBG-05WDL-2020001）。

作者簡(jiǎn)介：張利國(guó)（1978—），男，黑龍江哈爾濱人，博士，助理研究員，主要從事麻類分子育種研究。E-mail：zlg86@aliyun.com。

BELL類蛋白幾乎存在于所有植物當(dāng)中[1]，大麻中目前發(fā)現(xiàn)有13個(gè)BELL蛋白[2]?，F(xiàn)有研究揭示，BLH1能夠調(diào)節(jié)植株花基形態(tài)，在生殖生長(zhǎng)與營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)換節(jié)點(diǎn)可能發(fā)揮重要負(fù)調(diào)控功能;在擬南芥中BLH3和BLH6的轉(zhuǎn)錄活性相反，同時(shí)還可能參與調(diào)節(jié)植株葉片的形態(tài)與花期[3]。

KNOX家族作為TALE蛋白的一個(gè)亞類，也能夠從多方面參與對(duì)植物形態(tài)建成的調(diào)控。不同物種的同源BELL和KNOX蛋白可能存在不同的蛋白互作關(guān)系[4-5]。研究的前期工作基礎(chǔ)初步表明，CsBLH7可能與CsKNOXs家族部分成員之間存在蛋白互作關(guān)系。對(duì)比大麻的全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)，在大麻中發(fā)現(xiàn)6個(gè)KNOX蛋白和13個(gè)BELL蛋白，因此確定它們之間的互作關(guān)系、調(diào)節(jié)方式，對(duì)解析大麻器官形態(tài)發(fā)生的機(jī)制是十分必要的，將是揭示CsBLH7調(diào)控基因表達(dá)分子機(jī)理的基礎(chǔ)與關(guān)鍵。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究中植物材料為工業(yè)大麻新品種龍大麻4號(hào)，由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所選育。龍大麻4號(hào)的THC （四氫大麻酚）含量低于千分之一，為高產(chǎn)高纖型工業(yè)大麻品種。

1.2 酵母雙雜交相關(guān)質(zhì)粒構(gòu)建與測(cè)試蛋白-蛋白互作

采用PCR方法通過對(duì)大麻cDNA進(jìn)行克隆獲取BLH7和KNAT4的開放讀碼框片段。在酵母細(xì)胞中，轉(zhuǎn)入BLH7的同源異型結(jié)構(gòu)域蛋白片段與 Bell-like 片段，在pvgDT3中插入BLH7與BLH10的cDNA。在缺乏Trp及缺乏Leu的培養(yǎng)基中篩選酵母細(xì)胞，以測(cè)試其蛋白互作關(guān)系，在缺少Ade與Leu，以及無Trp、無His的培養(yǎng)基中培養(yǎng)篩選后的株系。使用陰性對(duì)照Pgatd7SV（40）和Pgbkt （7）Lam，陽性對(duì)照是Pgatd7SV （40）與Pgbkt （7）p53。

1.3 采用雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)（BiFC）測(cè)試蛋白-蛋白互作

通過35S啟動(dòng)子的調(diào)控，黃色熒光蛋白的兩端[4]分別連接BLH蛋白與KNOX蛋白形成融合蛋白，即C-KNAT4 與N-BLH7。擴(kuò)增完成后，在pSAT6-nEYFP-N1中亞克隆KNAT4-YFPC、KNAT3-YFPC，在pSAT6-cEYFPN1中亞克隆BLH7-YFPN、BLH10-YFPN，參考Yoo等聚乙二醇轉(zhuǎn)染擬南芥原生質(zhì)體的試驗(yàn)方法[4]展開試驗(yàn)，于Leica 2PS SSC 激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光成像情況。

1.4 原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染試驗(yàn)

在pUC19質(zhì)粒中構(gòu)建35S：GD-OIPs，用于質(zhì)粒提取和擴(kuò)增。反式強(qiáng)激活作用因子Ld-Vp16，以及報(bào)告基因2 LexA-2 Gal4：Gus和2Gal4：Gus也在本試驗(yàn)中應(yīng)用。本試驗(yàn)采用無內(nèi)毒素轉(zhuǎn)染級(jí)質(zhì)粒試劑盒（Abcam）進(jìn)行報(bào)告質(zhì)粒和效應(yīng)因子的分析，至少重復(fù)進(jìn)行3次生物學(xué)試驗(yàn)和設(shè)置2次技術(shù)性重復(fù)，數(shù)據(jù)分析處理采用t檢驗(yàn)。研究采用Gal4 DNA-binding domain和LexA DNA-binding domain，對(duì)應(yīng)GD-OIPs與VP16，其可靠性已被反復(fù)證實(shí)，例如AUX/IAA蛋白[6]、OFP4蛋白[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母雙雜交測(cè)試CsBLH7與CsKNAT4之間的蛋白互作

通過酵母雙雜交試驗(yàn)測(cè)試CsBLH7與KNAT4在體內(nèi)的相互作用，CsBLH7與轉(zhuǎn)錄蛋白因子的結(jié)合域連接組成融合蛋白，KNAT4與轉(zhuǎn)錄激活域形成融合蛋白。為排除目標(biāo)蛋白可能的自激活活性，測(cè)試結(jié)合域蛋白-Oips與激活域蛋白-Empty蛋白互作。試驗(yàn)結(jié)果表明，CsBLH7、KNAT4均無自激活活性，CsBLH7與CsKNAT4在體內(nèi)存在蛋白互作關(guān)系，形成BLH7-KNAT4蛋白復(fù)合物。CsBLH7與CsKNAT4酵母雙雜交（圖1）。在缺乏Leu與缺乏Trp的培養(yǎng)基質(zhì)中，Yeast-cell首先被選擇，在缺Leu、缺Trp、無His與無Ade的培養(yǎng)基質(zhì)中培養(yǎng)5～6 d，完成BLH-KNOX蛋白-蛋白互作測(cè)試。

2.2 雙分子熒光互補(bǔ)（BtFC）研究BLH7與KNAT4蛋白互作

由于酵母雙雜交技術(shù)上的局限性，為進(jìn)一步證實(shí)BLH7與KNAT4在細(xì)胞體內(nèi)的蛋白互作，采用雙分子熒光互補(bǔ)方法進(jìn)行測(cè)試。試驗(yàn)采用擬南芥葉肉原生質(zhì)體，共轉(zhuǎn)染YFPC-CsKNAT4與YFPN-CsBLH7，試驗(yàn)體系采用RACK1-C-EYFP作為陰性對(duì)照。BiFC試驗(yàn)結(jié)果顯示，BLH7與KNAT4蛋白互作發(fā)生在細(xì)胞核中（圖2）。

2.3 BLH7與KNAT4轉(zhuǎn)錄活性測(cè)試

從原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效應(yīng)因子相對(duì)表達(dá)量可知，圖中GD-BLH7的GUS相對(duì)表達(dá)量明顯降低（圖3），GD-KNAT4的GUS相對(duì)表達(dá)量明顯上調(diào)（圖3、圖4），由此可知CsBLH7為轉(zhuǎn)錄抑制因子，CsKNAT4為激活因子，且CsBLH7能夠與CsKNAT4互作，并能夠抑制CsKNAT4的轉(zhuǎn)錄激活活性（圖5）。

2.4 CsBLH7-CsKNAT4調(diào)節(jié)下胚軸細(xì)胞的伸長(zhǎng)

在過去針對(duì)BELL與KNOX類蛋白研究的結(jié)果表明，二者能夠調(diào)節(jié)植株的形態(tài)發(fā)育，包括葉片的形狀、莖的長(zhǎng)度、花基發(fā)育等。對(duì)比野生型（Col），35S：CsBLH7下胚軸長(zhǎng)度與下胚軸細(xì)胞長(zhǎng)度明顯縮短，35S：CsKNAT4下胚軸長(zhǎng)度明顯伸長(zhǎng)（圖6、圖7）。

在水稻、擬南芥等植物中過去關(guān)于BELL與 KNOX蛋白的研究曾報(bào)道，BELL-KNOX通過調(diào)控赤霉素合成酶基因來調(diào)節(jié)莖與細(xì)胞的伸長(zhǎng)。為進(jìn)一步探究CsBLH7-CsKNAT4調(diào)節(jié)胚軸與莖細(xì)胞長(zhǎng)度的機(jī)制，對(duì)不同遺傳背景材料的赤霉素合成酶基因做熒光定量分析。結(jié)果表明，35S：CsBLH7中CsGA20ox1表達(dá)量均降低，35S：CsKNAT4中CsGA20ox1表達(dá)量上升（圖8）。

3 討論

研究采用酵母雙雜交初步確定，CsBLH7與

CsKNAT4能夠在細(xì)胞體內(nèi)互作，形成BLH7-KNAT4蛋白復(fù)合物，雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）進(jìn)一步證實(shí)了這種蛋白互作。以擬南芥原生質(zhì)體為材料，為確定轉(zhuǎn)錄蛋白的作用開展瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，通過酶標(biāo)儀以GUS基因相對(duì)表達(dá)量，確定CsBLH7為轉(zhuǎn)錄抑制因子，35S：CsKNAT4為轉(zhuǎn)錄激活因子。材料35S：CsBLH7下胚軸與細(xì)胞長(zhǎng)度降低，材料35S：CsKNAT4下胚軸與細(xì)胞長(zhǎng)度增加。BLH7與KNAT4互作形成BLH7-KNAT4蛋白復(fù)合物，BLH7能夠抑制莖與胚軸細(xì)胞的伸長(zhǎng)，KNAT4能夠促進(jìn)莖與胚軸細(xì)胞的發(fā)育，這與BLH7作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制因子，KNAT4作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活因子的遺傳特性相適應(yīng)。結(jié)合不同材料CsGA20ox1的表達(dá)量，在BLH7與KNAT4蛋白互作基礎(chǔ)上，暗示BLH7-KNAT4可能是通過調(diào)節(jié)赤霉素合成來調(diào)控下胚軸與莖細(xì)胞長(zhǎng)度，從而影響下胚軸的發(fā)育。

同時(shí)，在過去的報(bào)道中，OFP等其他轉(zhuǎn)錄蛋白可能與BELL-KNOX蛋白復(fù)合物發(fā)生互作來發(fā)揮調(diào)控作用，形成OFP-BELL-KNOX復(fù)合蛋白[8-9]，本研究中KNAT4與BLH7的蛋白-蛋白互作，也可能并不是直接形成的，并不能排除是通過其他蛋白間接形成的互作，這需要通過體外蛋白互作試驗(yàn)進(jìn)一步來確定。

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