彭姝明，劉海鵬，李蘇萍，楊帆，段麗

(郴州市第一人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，郴州 423000)

輔助生殖技術(shù)(ART)至今已經(jīng)經(jīng)歷了40余年的發(fā)展。時(shí)至今日，囊胚培養(yǎng)和移植技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床，是提升ART成功率的有力手段之一[1-3]。目前，單囊胚移植尤其是選擇性單囊胚移植已成為提高ART成功率并且降低多胎率的常規(guī)策略。在單囊胚移植的背景下，如何挑選具有最佳種植潛能的囊胚進(jìn)行移植以獲得最好的臨床結(jié)局是廣大ART工作者面臨的難題。目前形態(tài)學(xué)評(píng)估仍然是挑選囊胚的主要手段。本研究回顧性分析了本中心近年來(lái)的單個(gè)凍融囊胚移植周期數(shù)據(jù)，通過(guò)對(duì)不同質(zhì)量的受精后第3天(D3)卵裂胚來(lái)源的凍融囊胚移植的臨床結(jié)局進(jìn)行比較分析，試圖為選擇性單囊胚移植的囊胚挑選策略提供新的參考。

一、資料與方法

1.研究對(duì)象及分組：回顧性分析郴州市第一人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心在2018年1月至2020年9月期間進(jìn)行的單囊胚凍融移植周期。納入標(biāo)準(zhǔn)：?jiǎn)蝹€(gè)凍融囊胚移植周期，所有囊胚均來(lái)源于IVF正常受精的可利用D3卵裂胚；患者基礎(chǔ)FSH<12 U/L；患者體質(zhì)量指數(shù)正常(18.5 kg/m2

共納入653個(gè)單囊胚凍融移植周期。根據(jù)囊胚培養(yǎng)來(lái)源的D3卵裂胚質(zhì)量分為優(yōu)質(zhì)卵裂胚組(n=445)和非優(yōu)質(zhì)卵裂胚組(n=208)。

2.子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備方案：(1)激素替代周期：適用于月經(jīng)不規(guī)則的患者。遞增法口服戊酸雌二醇(補(bǔ)佳樂(lè)，拜耳制藥，德國(guó))，月經(jīng)第2～4天開(kāi)始口服4 mg/d，每4 d遞增 2 mg；12 d后B超監(jiān)測(cè)子宮內(nèi)膜厚度，并檢測(cè)血清雌二醇(E2)、孕酮(P)水平，酌情調(diào)整補(bǔ)佳樂(lè)劑量，繼續(xù)促內(nèi)膜生長(zhǎng)或者添加孕激素行黃體轉(zhuǎn)換。當(dāng)子宮內(nèi)膜厚度≥7 mm、血清E2≥735 pmol/L、P<3.14 pmol/L時(shí)，開(kāi)始黃體轉(zhuǎn)換：添加黃體酮針(浙江仙琚制藥)60 mg肌肉注射，每日1次至胚胎移植日。開(kāi)始黃體轉(zhuǎn)換日定為Day0，于Day5或Day6行囊胚移植。(2)自然周期：適用于月經(jīng)規(guī)律的患者。從月經(jīng)第11天開(kāi)始行陰道B超監(jiān)測(cè)排卵，排卵日定為Day0，于Day0開(kāi)始黃體酮針40 mg肌肉注射，每日1次至胚胎移植日，于Day5或Day6行囊胚移植。

3.凍融囊胚的解凍及培養(yǎng)：凍融囊胚移植當(dāng)天上午進(jìn)行囊胚的解凍。采用玻璃化復(fù)蘇試劑盒(Vitrification VT102，KITAZATO，日本)，將載桿在液氮中取掉套管后拿出，迅速置室溫下解凍液(TS)中1 min，然后分別將囊胚移入稀釋液(DS)中3 min、洗滌液1(WS1)中5 min、洗滌液2(WS2)中5 min，再將囊胚轉(zhuǎn)入囊胚培養(yǎng)液(G2，Vitrolife-G5系列序貫培養(yǎng)液，瑞典)中觀察評(píng)分并行激光輔助孵化，置于三氣培養(yǎng)箱內(nèi)(37℃、6%CO2、5%O2)培養(yǎng)2 h后移植。

4.胚胎評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：(1)卵裂胚：正常受精后D3卵裂球≥4個(gè)、碎片<50%者為可利用卵裂胚；D3卵裂球?yàn)?～9個(gè)、碎片<20%者為優(yōu)質(zhì)卵裂胚；(2)囊胚：按Gardner囊胚評(píng)分系統(tǒng)評(píng)價(jià)，本中心規(guī)定D5或D6達(dá)3BC或3CB及以上級(jí)別者為可冷凍囊胚；D5或D6囊胚腔擴(kuò)張程度4～6期、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或滋養(yǎng)層評(píng)分為A或者B級(jí)者為優(yōu)質(zhì)囊胚。

5.妊娠判斷標(biāo)準(zhǔn)：囊胚移植后第11天測(cè)定血清HCG水平，血清HCG水平>5 U/L為HCG陽(yáng)性；囊胚移植后4周，超聲檢查見(jiàn)孕囊或見(jiàn)胎心搏動(dòng)則判定為臨床妊娠。

6.觀察指標(biāo)：復(fù)蘇優(yōu)質(zhì)囊胚率=優(yōu)質(zhì)囊胚數(shù)/復(fù)蘇存活囊胚數(shù)×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；胚胎種植率=孕囊數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%；流產(chǎn)率=流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%；活產(chǎn)率=分娩胎兒的周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%。

二、結(jié)果

1.囊胚培養(yǎng)及冷凍/復(fù)蘇情況：本研究共納入653個(gè)單囊胚凍融移植周期。根據(jù)囊胚培養(yǎng)來(lái)源的D3卵裂胚質(zhì)量分為優(yōu)質(zhì)卵裂胚組(n=445)和非優(yōu)質(zhì)卵裂胚組(n=208)。優(yōu)質(zhì)卵裂胚組優(yōu)質(zhì)囊胚率顯著高于非優(yōu)質(zhì)卵裂胚組(P<0.05)；兩組間囊胚冷凍時(shí)期和囊胚復(fù)蘇率比較均無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 不同質(zhì)量D3卵裂胚行囊胚培養(yǎng)及冷凍/復(fù)蘇情況比較(%)

2.優(yōu)質(zhì)囊胚移植周期患者一般情況及臨床結(jié)局：移植優(yōu)質(zhì)囊胚435個(gè)周期，其中來(lái)源于D3優(yōu)質(zhì)卵裂胚333個(gè)周期(優(yōu)質(zhì)卵裂胚組)，來(lái)自于非優(yōu)質(zhì)卵裂胚102個(gè)周期(非優(yōu)質(zhì)卵裂胚組)。兩組間患者年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、基礎(chǔ)FSH水平、移植日子宮內(nèi)膜厚度、內(nèi)膜準(zhǔn)備方案比較均無(wú)顯著性差異(P>0.05)；兩組間臨床妊娠率比較無(wú)顯著差異(P>0.05)，但優(yōu)質(zhì)卵裂胚組的活產(chǎn)率顯著高于非優(yōu)質(zhì)卵裂胚組(P<0.05)，而流產(chǎn)率則顯著低于非優(yōu)質(zhì)卵裂胚組(P<0.05)(表2)。

表2 不同質(zhì)量D3卵裂胚來(lái)源的優(yōu)質(zhì)囊胚移植周期情況比較[(-±s)，%]

3.非優(yōu)質(zhì)囊胚移植周期患者一般情況及臨床結(jié)局：移植非優(yōu)質(zhì)囊胚218周期，其中來(lái)源于D3優(yōu)質(zhì)卵裂胚112周期(優(yōu)質(zhì)卵裂胚組)，來(lái)源于非優(yōu)質(zhì)卵裂胚組106周期(非優(yōu)質(zhì)卵裂胚組)。兩組間患者年齡、BMI、基礎(chǔ)FSH水平、移植日子宮內(nèi)膜厚度、內(nèi)膜準(zhǔn)備方案比較均無(wú)顯著性差異(P>0.05)；兩組間臨床妊娠率無(wú)顯著性差異(P>0.05)，優(yōu)質(zhì)卵裂胚組活產(chǎn)率顯著高于非優(yōu)質(zhì)卵裂胚組(P<0.05)，而流產(chǎn)率則顯著低于非優(yōu)質(zhì)卵裂胚組(P<0.05)(表3)。

表3 不同質(zhì)量D3卵裂胚來(lái)源的非優(yōu)質(zhì)囊胚移植周期情況比較[(-±s)，%]

三、討論

雖然目前ART技術(shù)已日漸成熟，但其成功率并不十分理想。囊胚移植技術(shù)是提升ART成功率的有力手段之一，而選擇性單囊胚移植技術(shù)則是囊胚移植策略的首選。因此，囊胚的挑選成為影響ART結(jié)局的關(guān)鍵因素之一。盡管如今有諸多輔助選擇技術(shù)，如時(shí)差成像技術(shù)、胚胎植入前非整倍體遺傳學(xué)檢測(cè)(PGT-A)等應(yīng)用于囊胚的選擇，但形態(tài)學(xué)評(píng)估仍然是最主要的篩選方法。經(jīng)典的Gardner囊胚評(píng)分系統(tǒng)根據(jù)囊胚腔的大小、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)以及滋養(yǎng)層細(xì)胞的數(shù)量及形態(tài)等3個(gè)方面對(duì)囊胚進(jìn)行評(píng)級(jí)來(lái)篩選出具有較高種植潛能的囊胚[4-5]。然而形態(tài)學(xué)評(píng)估也存在著一定的局限性，Barrenetxea等[6]在一項(xiàng)前瞻性對(duì)照研究中發(fā)現(xiàn)，即便是移植評(píng)分完全相同的囊胚，其臨床結(jié)局也存在較大的差異。這可能是由于單純的囊胚形態(tài)學(xué)評(píng)估體系不夠完善的緣故，也許結(jié)合其卵裂胚階段的綜合評(píng)估可能更好。

囊胚移植的臨床結(jié)局與其卵裂胚階段的胚胎評(píng)估究竟有無(wú)關(guān)聯(lián)？相關(guān)的研究是基于囊胚形態(tài)和其所來(lái)源的卵裂胚評(píng)分的綜合評(píng)估。Mizobe等[7]的研究顯示，卵裂胚時(shí)期的碎片比例對(duì)其所形成的囊胚移植的臨床結(jié)局并無(wú)顯著影響，推測(cè)可能與胚胎的自我修復(fù)功能有關(guān)系。Balaban等[8]認(rèn)為即便卵裂胚時(shí)期評(píng)分不佳的胚胎，如果能夠形成高質(zhì)量的囊胚依然可以獲得較好的妊娠結(jié)局；Almagor等[9]研究表明，D3不規(guī)則卵裂的卵裂胚只要能夠順利發(fā)育至囊胚階段就不會(huì)影響其種植潛能和臨床結(jié)局。然而，Borini等[10]的研究認(rèn)為，卵裂胚階段的胚胎評(píng)估對(duì)于其種植潛能具有決定性的預(yù)測(cè)價(jià)值。還有研究發(fā)現(xiàn)囊胚移植的臨床結(jié)局可能與其來(lái)源的卵裂胚的評(píng)分密切相關(guān)[11-12]。以上文獻(xiàn)報(bào)道表明卵裂胚階段的胚胎評(píng)估與其囊胚的臨床結(jié)局相關(guān)性存在著爭(zhēng)議。

眾所周知，卵裂胚的形態(tài)學(xué)評(píng)分是評(píng)估卵裂胚生長(zhǎng)潛能的重要依據(jù)。然而在日常的ART工作中我們?cè)谀遗叩倪x擇上往往只注重囊胚階段的評(píng)分而忽視了之前的卵裂胚階段的評(píng)分，可能導(dǎo)致在ART中會(huì)出現(xiàn)與預(yù)期不相符合的臨床結(jié)局。本研究將我中心單囊胚移植周期的患者先按照移植囊胚的質(zhì)量進(jìn)行區(qū)分，再按照移植囊胚來(lái)源的卵裂胚形態(tài)學(xué)評(píng)估結(jié)果將其分成了優(yōu)質(zhì)卵裂胚組和非優(yōu)質(zhì)卵裂胚組，分別比較分析兩組的臨床結(jié)局。我們的研究結(jié)果顯示，非優(yōu)質(zhì)卵裂胚來(lái)源的囊胚其優(yōu)質(zhì)囊胚比例顯著低于優(yōu)質(zhì)卵裂胚來(lái)源的囊胚組，這說(shuō)明7～9細(xì)胞的優(yōu)質(zhì)卵裂胚獲取優(yōu)質(zhì)囊胚的可能性明顯高于非優(yōu)質(zhì)卵裂胚。這與Yu等[13]的研究結(jié)果相似。本研究中，盡管不同卵裂胚來(lái)源(優(yōu)質(zhì)卵裂胚 vs. 非優(yōu)質(zhì)卵裂胚)的凍融囊胚移植的臨床妊娠率并無(wú)顯著性差異(移植優(yōu)質(zhì)囊胚周期：70.57% vs. 66.67%；移植非優(yōu)質(zhì)囊胚周期：62.50% vs. 53.77%；P均>0.05)，但優(yōu)質(zhì)卵裂胚來(lái)源的凍融囊胚移植組的流產(chǎn)率顯著低于非優(yōu)質(zhì)卵裂胚來(lái)源的凍融囊胚移植組(移植優(yōu)質(zhì)囊胚周期：12.77% vs. 26.47%；移植非優(yōu)質(zhì)囊胚周期：15.71% vs. 31.58%；P均>0.05)，而活產(chǎn)率則顯著高于后者(移植優(yōu)質(zhì)囊胚周期：61.56% vs. 49.02%；移植非優(yōu)質(zhì)囊胚周期：52.68% vs. 36.79%；P均>0.05)。這說(shuō)明移植優(yōu)質(zhì)卵裂胚來(lái)源的凍融囊胚可以獲得較好的臨床結(jié)局，這與史三寶等[14]的研究結(jié)果相似。同時(shí)我們也注意到，鑒于非優(yōu)質(zhì)卵裂胚來(lái)源的凍融囊胚移植的高流產(chǎn)率，即便是優(yōu)質(zhì)卵裂胚來(lái)源的非優(yōu)質(zhì)凍融囊胚移植的活產(chǎn)率也不低于非優(yōu)質(zhì)卵裂胚來(lái)源的優(yōu)質(zhì)凍融囊胚(52.68% vs. 49.02%)。這無(wú)疑為制訂單囊胚凍融移植策略提供了新的參考，即在有非優(yōu)質(zhì)卵裂胚來(lái)源的優(yōu)質(zhì)囊胚的情況下也可以考慮移植優(yōu)質(zhì)卵裂胚來(lái)源的非優(yōu)質(zhì)囊胚。

在本研究中，優(yōu)質(zhì)卵裂胚來(lái)源囊胚移植的活產(chǎn)率顯著高于非優(yōu)質(zhì)卵裂胚來(lái)源囊胚移植的活產(chǎn)率，提示D3卵裂胚的形態(tài)學(xué)評(píng)估與其所形成的囊胚移植臨床結(jié)局密切相關(guān)。黃柳靜等[15]的研究證實(shí)，對(duì)低評(píng)分的D3卵裂胚行囊胚培養(yǎng)后移植所獲的活產(chǎn)率只有26.7%。另有研究表明，較低的胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)分意味著該胚胎非整倍體率、染色體異常發(fā)生率和表觀遺傳學(xué)異常幾率大大增加[16-18]。盡管經(jīng)歷了囊胚形成這個(gè)自然優(yōu)選的過(guò)程，但其種植潛能仍然不如優(yōu)質(zhì)卵裂胚來(lái)源的囊胚(如7～9細(xì)胞卵裂胚來(lái)源的囊胚)。這可能是非優(yōu)質(zhì)卵裂胚來(lái)源囊胚移植患者的流產(chǎn)率顯著高于優(yōu)質(zhì)卵裂胚來(lái)源囊胚移植患者，進(jìn)而導(dǎo)致其活產(chǎn)率顯著低于后者的合理解釋。

本研究的不足之處在于是單中心的回顧性數(shù)據(jù)分析，缺乏前瞻性的大樣本數(shù)據(jù)研究結(jié)果來(lái)支持觀點(diǎn)。D3卵裂胚的形態(tài)學(xué)評(píng)估對(duì)其所來(lái)源的囊胚移植臨床結(jié)局究竟有怎樣的影響尚需進(jìn)一步深入的研究。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，單囊胚凍融移植的臨床結(jié)局與其所來(lái)源D3卵裂胚的形態(tài)學(xué)評(píng)分密切相關(guān)；優(yōu)質(zhì)D3卵裂胚來(lái)源的凍融囊胚相對(duì)于其他來(lái)源的凍融囊胚移植具有更低的流產(chǎn)率和更高的活產(chǎn)率。優(yōu)先移植優(yōu)質(zhì)D3卵裂胚來(lái)源的凍融囊胚能獲得更好的臨床結(jié)局。