李艷婷 郭 尚* 郎慧芳 郭霄飛 陳 楠

一株野生硫磺菌的分類鑒定及其菌絲培養(yǎng)條件優(yōu)化

李艷婷1郭 尚1*郎慧芳2郭霄飛1陳 楠1

（1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)山西功能食品研究院，山西 太原 030031；2. 五臺(tái)山風(fēng)景區(qū)農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)服務(wù)中心，山西 忻州 034000）

經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，明確采自山西的一株野生大型真菌為硫磺菌，對(duì)其進(jìn)行分類鑒定，并采取單因素試驗(yàn)研究碳源、氮源、碳氮比、培養(yǎng)溫度、pH對(duì)該菌菌絲體生長的影響。結(jié)果表明：該菌菌絲體生長的最佳碳源為葡萄糖，最佳氮源為酵母膏；通過響應(yīng)面優(yōu)化得到菌絲體最佳培養(yǎng)條件為碳氮比40∶1，培養(yǎng)溫度26.5 ℃，pH 5，在此條件下菌絲生長速率為5.608 mm/d。

硫磺菌；鑒定；菌絲；培養(yǎng)條件優(yōu)化

硫磺菌[(Fr). Murrill]又名硫色多孔菌、硫磺多孔菌，是一種藥食兼用的大型真菌，屬多孔菌目（Polyporales）、多孔菌科（Polyporaceae）、硫磺菌屬（），廣泛分布于世界各地，從寒溫帶到熱帶區(qū)域都有報(bào)道，我國主要集中在河北、山西、云南、遼寧、陜西、吉林、廣西等地[1,2]。硫磺菌富含多不飽和脂肪酸、草酸和布里酸等營養(yǎng)成分，具有重要的食用價(jià)值，在我國和日本的部分地區(qū)都有其食用記錄。也有報(bào)道稱硫磺菌中存在大量抗氧化、抗菌、抗腫瘤的多糖及活性蛋白成分，具有巨大的藥用價(jià)值[3-5]。

對(duì)野生硫磺菌的人工馴化栽培雖已成功，但尚未實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)[6]。本研究對(duì)采自山西廣靈的一株野生大型真菌（圖1）進(jìn)行鑒定，結(jié)果確定是硫磺菌。對(duì)其子實(shí)體進(jìn)行組織分離，得到純化菌絲體。探討碳源、氮源、碳氮比、培養(yǎng)溫度、pH對(duì)該菌菌絲生長的影響，進(jìn)而以菌絲生長速率為指標(biāo)，采用響應(yīng)面法研究溫度、碳氮比、pH對(duì)其生長的影響，以期得到菌絲體最佳培養(yǎng)條件，為規(guī)?；斯ぴ耘嗵峁┮欢ㄉ飳W(xué)特性理論依據(jù)。

圖1 供試菌株子實(shí)體形態(tài)

1 材料與方法

1.1 供試菌株

野生菌子實(shí)體釆自山西省廣靈縣的一棵榆樹枯樹干的基部。該地區(qū)位于北緯39°76.15′、東經(jīng)114°29.65′處，海拔965 m。供試菌株由子實(shí)體組織分離獲得，標(biāo)本與菌種均保藏于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)山西功能食品研究院。

1.2 試驗(yàn)方法

（1）分離純化。新鮮硫磺菌子實(shí)體，去除表面雜質(zhì)并用75%酒精清洗，采用組織分離法將子實(shí)體組織塊接入PDA培養(yǎng)基中，25 ℃黑暗培養(yǎng)。

（2）形態(tài)鑒定與分子生物學(xué)鑒定。形態(tài)學(xué)觀察：肉眼觀察子實(shí)體的外觀顏色、形狀、質(zhì)地等，用標(biāo)尺測(cè)量子實(shí)體長度、寬度和厚度。分子生物學(xué)鑒定：提取菌絲純培養(yǎng)物的DNA，進(jìn)行rDNA ITS區(qū)間序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，與待測(cè)菌種序列相似性最大的菌種，即為鑒定結(jié)果[7,8]。

（3）基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制。PDA培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，馬鈴薯200 g，瓊脂20 g，加水至1000 mL，pH自然[9]。121 ℃滅菌25 min。

（4）菌種活化。將低溫保藏的試管菌種接種至PDA平板培養(yǎng)基，室溫避光培養(yǎng)，待菌絲長滿后，用打孔器在菌落同一直徑處取直徑 1 cm的菌餅，保持生長一致[10]。

（5）氮源試驗(yàn)。以5 g豆粕粉、蛋白胨、酵母粉、酒石酸銨、麩皮、硫酸銨、磷酸氫二銨分別代替PDA培養(yǎng)基中的馬鈴薯（200 g），其他成分不變，作為試驗(yàn)培養(yǎng)基，以不加氮源的PDA培養(yǎng)基為對(duì)照，25 ℃培養(yǎng)，每個(gè)處理3次重復(fù)。觀察記錄菌絲長度、長勢(shì)等，并計(jì)算菌絲生長速率[11]。

（6）碳源試驗(yàn)。以5 g蛋白胨代替PDA培養(yǎng)基中的馬鈴薯（200 g），分別以20 g的葡萄糖、可溶性淀粉、麥芽糖、蔗糖、海藻糖、玉米粉、果糖為碳源，其他成分不變，作為試驗(yàn)培養(yǎng)基，以不加碳源的PDA培養(yǎng)基為對(duì)照，每個(gè)處理3次重復(fù)，培養(yǎng)與觀察記錄方法同1.2（5）。

（7）最適pH篩選。按照基礎(chǔ)PDA培養(yǎng)基配方，分別配制4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0等7個(gè)pH梯度培養(yǎng)基，每個(gè)處理3次重復(fù)，培養(yǎng)與觀察記錄方法同1.2（5）。

（8）最適溫度篩選。按照基礎(chǔ)PDA培養(yǎng)基配方，設(shè)置20 ℃、22 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃ 5個(gè)培養(yǎng)溫度，每個(gè)處理3次重復(fù)，觀察記錄方法同1.2（5）。

（9）適宜碳氮比篩選。分別以葡萄糖和硫酸銨為唯一碳源和氮源，配制10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1、90∶1和100∶1等10個(gè)不同碳氮比培養(yǎng)基[15]，培養(yǎng)與觀察記錄方法同1.2（5）。

（10）培養(yǎng)條件優(yōu)化試驗(yàn)。利用響應(yīng)面法優(yōu)化硫磺菌菌絲生長條件，采用 Box-Behnken 方法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及回歸分析，以菌絲生長速率作為響應(yīng)值，對(duì)菌絲培養(yǎng)過程中的溫度、pH和碳氮比3個(gè)影響因素進(jìn)行優(yōu)化[16]。

（11）菌絲生長速率計(jì)算。菌絲生長速率（mm/d）=菌落半徑（mm）/培養(yǎng)時(shí)間（d）[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生硫磺菌的分類鑒定

（1）形態(tài)特征（圖1）。子實(shí)體簇生，菌蓋寬15～35 cm，厚1.5～2 cm，呈覆瓦狀排列，肉質(zhì)多汁，干后質(zhì)量輕，質(zhì)地脆；表面呈淡黃色至硫黃色，有細(xì)絨和縱皺紋，無環(huán)帶；邊緣薄而銳、易破碎，波浪狀至瓣?duì)睢＞獬嗜榘咨?，管孔呈硫黃色，干后褪色；孔口呈多角形，平均每平方毫米分布3～4個(gè)。無菌柄。

（2）分子鑒定。將測(cè)序獲得的ITS序列在NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對(duì)分析，得到確定種名的近源種，建立系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2）。

形態(tài)學(xué)鑒定表明，本試驗(yàn)采集到的野生菌株的宏觀形態(tài)特征與硫磺菌（）的形態(tài)特征吻合；分子鑒定結(jié)果顯示，所測(cè)序列與硫磺菌的ITS序列（GenBank ID：KR187106.1）的重復(fù)率（query cover）達(dá)到90%，相似度達(dá)100%。據(jù)此，鑒定該野生菌株為硫磺菌（。

2.2 硫磺菌菌絲在不同氮源培養(yǎng)基上的生長情況

由表1可知，試驗(yàn)所選的氮源都可被硫磺菌菌絲利用，在以磷酸氫二銨為氮源和無氮源培養(yǎng)基中，菌絲未長滿且長勢(shì)很弱；在酵母粉培養(yǎng)基中菌絲生長速率最快，為5.396 mm/d，且長勢(shì)濃密，呈橙黃色；在酒石酸銨培養(yǎng)基中菌絲生長速率慢，僅2.298 mm/d，且長勢(shì)一般，顏色微黃。

圖2 基于ITS構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

表1 不同氮源培養(yǎng)基上的硫磺菌菌絲生長表現(xiàn)

注：+++為濃密、長勢(shì)強(qiáng)，++為長勢(shì)一般，+為長勢(shì)弱、稀疏；同列數(shù)據(jù)后小寫字母不同表示差異顯著（<0.05），大寫字母不同表示差異極顯著（<0.01）。下表同。

在所選6種氮源中，菌絲生長速率由慢到快的順序?yàn)椋毫姿釟涠@、酒石酸銨、硫酸銨、麩皮、蛋白胨、豆粕粉、酵母粉。綜合考慮各培養(yǎng)基中的菌絲長勢(shì)、顏色和菌落形態(tài)等，選擇最適氮源為酵母粉。

2.3 硫磺菌菌絲在不同碳源培養(yǎng)基上的生長情況

由表2可知，8個(gè)配方培養(yǎng)基都可供硫磺菌菌絲生長，但長勢(shì)與生長速度存在差異。無碳源的培養(yǎng)基上菌絲生長緩慢、稀疏、長勢(shì)弱，原因可能是瓊脂提供了微量碳源；在4號(hào)（麥芽糖）和2號(hào)（葡萄糖）培養(yǎng)基上，菌絲生長速率快，分別為4.741mm/d和4.400 mm/d，菌絲生長良好，但麥芽糖培養(yǎng)基長勢(shì)不及葡萄糖培養(yǎng)基；6號(hào)（海藻糖）培養(yǎng)基菌絲長速最慢。7種不同碳源培養(yǎng)基菌絲生長速率由快到慢的順序?yàn)椋蝴溠刻恰⑵咸烟?、玉米粉、可溶性淀粉、果糖、蔗糖、海藻糖。綜合考慮各培養(yǎng)基的菌絲長勢(shì)、顏色和菌落形態(tài)等，選擇以葡萄糖為最適碳源。

表2 不同碳源培養(yǎng)基上的硫磺菌菌絲生長表現(xiàn)

2.4 硫磺菌菌絲在不同pH培養(yǎng)基上的生長情況

由表3可知，7個(gè)不同pH條件下，硫磺菌菌絲均能生長。菌絲生長速率由快到慢的順序?yàn)椋簆H 5、pH 4、pH 6、pH 7、pH 8、pH 9、pH 10。以培養(yǎng)基pH為5.0，菌絲生長速率最快，達(dá)到5.458 mm/d，且表現(xiàn)濃密、生長勢(shì)強(qiáng)，呈橙黃色。

2.5 硫磺菌菌絲在不同培養(yǎng)溫度下的生長情況

由表4可知，硫磺菌菌絲在試驗(yàn)的5檔培養(yǎng)溫度下均能生長，但生長速率差異顯著，從快到慢的順序?yàn)椋?6 ℃、22 ℃、28 ℃、24 ℃和20 ℃。培養(yǎng)溫度為26 ℃的菌絲生長速率為5.558 mm/d，顯著快于其他4檔溫度，且表現(xiàn)色澤橙黃、菌絲濃密，可見是最佳培養(yǎng)溫度。

2.6 硫磺菌菌絲在不同碳氮比培養(yǎng)基中生長情況

由表5可知，培養(yǎng)基中的碳氮比不同，硫磺菌菌絲生長速率存在差異。當(dāng)碳氮比為30∶1時(shí)，菌絲生長速率最快，為5.438 mm/d，且表現(xiàn)濃密、生長勢(shì)強(qiáng)；而當(dāng)碳氮比升高或降低時(shí)，菌絲生長速率減慢?？梢?，碳氮比對(duì)硫磺菌菌絲生長具有顯著影響。綜合菌絲長勢(shì)和生長速度，最適碳氮比為30∶1。

表3 不同pH培養(yǎng)基上的硫磺菌菌絲生長表現(xiàn)

表4 不同培養(yǎng)溫度下的硫磺菌菌絲生長表現(xiàn)

表5 不同碳氮比培養(yǎng)基中的硫磺菌菌絲生長表現(xiàn)

2.7 硫磺菌菌絲培養(yǎng)條件的響應(yīng)面法優(yōu)化

以單因素試驗(yàn)所得培養(yǎng)條件的結(jié)果為基礎(chǔ)，選擇培養(yǎng)溫度（A）、碳氮比（B）和pH（C）3個(gè)因素，將菌絲生長速率作為響應(yīng)值，進(jìn)行菌絲培養(yǎng)條件的響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)[18]，試驗(yàn)結(jié)果如表6所示。

以培養(yǎng)溫度（A）、培養(yǎng)基碳氮比（B）和培養(yǎng)基pH（C）為參數(shù)，得到回歸方程：菌絲生長速率= 5.68 ? 0.011+ 0.017+ 0.016+ 0.044?0.028? 0.020? 0.302? 0.0222? 0.132

表6 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

采用方差分析驗(yàn)證回歸模型的有效性[19]，結(jié)果如表7所示，該回歸模型的值是18.75，值為0.0004（<0.05），表明模型具有顯著性。對(duì)硫磺菌菌絲生長速率影響非常顯著的是C2（<0.01），差異極顯著的是A2（<0.001）；回歸模型的失擬項(xiàng)值為4.26，結(jié)果顯示該回歸模型與實(shí)際情況擬合度較高，可以用于預(yù)測(cè)該菌菌絲的最佳培養(yǎng)條件。在所選的3個(gè)因素中，影響力從大到小排序?yàn)锳（培養(yǎng)溫度）>C（pH）>B（碳氮比）。

表7 方差分析表

注： *表示在5%水平上差異顯著；**表示在1%水平上差異非常顯著；***表示在1‰水平上差異極顯著。

2.8 菌絲培養(yǎng)條件的響應(yīng)面優(yōu)化分析

如圖3所示，培養(yǎng)溫度與培養(yǎng)基碳氮比，培養(yǎng)溫度與培養(yǎng)基pH的交互作用明顯，培養(yǎng)基碳氮比與培養(yǎng)基pH的交互作用不顯著，其中培養(yǎng)溫度是最大的影響因素。當(dāng)培養(yǎng)溫度固定時(shí)，隨著碳氮比的升高，菌絲生長速率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，即碳氮比達(dá)到最大值39.58∶1后，菌絲生長速率開始降低。當(dāng)培養(yǎng)基pH保持固定時(shí)，隨著培養(yǎng)溫度的升高，菌絲生長速率呈逐漸增大趨勢(shì)，當(dāng)溫度達(dá)到最大值26.54 ℃時(shí)，菌絲生長速率略微降低。碳氮比對(duì)硫磺菌菌絲生長速率的影響較小。

圖3 培養(yǎng)溫度、pH與碳氮比的響應(yīng)面曲線

采用回歸模型對(duì)硫磺菌的最佳培養(yǎng)條件進(jìn)行預(yù)測(cè)優(yōu)化的結(jié)果，最適培養(yǎng)溫度為26.54 ℃，最適培養(yǎng)基pH是4.93，最佳碳氮比為39.58∶1。在最優(yōu)培養(yǎng)條件下，硫磺菌菌絲生長速率的理論最大值是5.6079 mm/d。按照實(shí)際進(jìn)行微調(diào)后的優(yōu)化培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度26.5 ℃，培養(yǎng)基碳氮比40∶1 ，培養(yǎng)基pH為5。

3 結(jié) 論

本研究對(duì)采集到的一株野生菌進(jìn)行分類鑒定，通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，證明該菌為硫磺菌。通過單因素試驗(yàn)確定其菌絲生長的最適碳源、氮源及最佳碳氮比、培養(yǎng)溫度、pH分別是葡萄糖、酵母膏、30∶1、26 ℃和5。

選擇硫磺菌培養(yǎng)基碳氮比、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)基pH 3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，獲得菌絲最佳培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度26.5 ℃，培養(yǎng)基碳氮比40∶1，pH為5。本試驗(yàn)結(jié)果與其他學(xué)者報(bào)道的硫磺菌培養(yǎng)最適溫度、適宜pH的研究結(jié)果[20,21]一致，但在本試驗(yàn)得到的最佳培養(yǎng)條件下，硫磺菌菌絲生長速率顯著高于盧東升等[21]、閆梅霞等[22]報(bào)道的生長速率。表明本試驗(yàn)的菌絲培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果對(duì)山西硫磺菌菌株及其他硫磺菌菌株的人工馴化培養(yǎng)具有重要借鑒意義。

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Identification and optimization of mycelium culture condition of a wildstain

Li Yanting1Guo Shang1*Lang Huifang2Guo Xiaofei1Chen Nan1

(1. Shanxi Agricultural University, Shanxi Institute for Functional Food, Taiyuan, Shanxi 030031, China；2. Agriculture and Animal Husbandry Service Center of Mount Wutai Scenic Area , Xinzhou, Shanxi 034000, China)

A wildcollected from Shanxi was classified and identified. The effects of carbon source, nitrogen source, carbon nitrogen ratio, culture temperature and pH on the mycelial growth of the fungus were analyzed by single factor test, and the mycelial culture conditions were optimized by response surface test. The results indicated that the best carbon source for mycelium growth was glucose and the best nitrogen source was yeast extract. Through response surface optimization, the optimum culture conditions of mycelium were C/N ratio was 40∶1, culture temperature was 26.5 ℃, pH 5. Under these conditions, the mycelium growth rate ofwas 5.608 mm/d.

; identification;mycelium; optimization of culture condition

S646, S567.3

A

2095-0934（2022）02-138-06

山西省科技成果轉(zhuǎn)化引導(dǎo)專項(xiàng)項(xiàng)目（201904D131042）；山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科研創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)專項(xiàng)（YGC2019TD03）；山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新研究課題（YCX2020SJ04）

李艷婷（1986—），女，碩士，助研，主要研究方向?yàn)橐吧乘幱镁Z化及功能性成分開發(fā)利用。E-mail：527305917@qq.com。

，E-mail：GS0351@sohu.com。