王洋洋，劉萬代，賀利，任德超，段劍釗，胡新，郭天財，王永華，馮偉

基于多元統(tǒng)計分析的小麥低溫凍害評價及水分效應(yīng)差異研究

王洋洋1,2，劉萬代1,2，賀利1,2，任德超3，段劍釗1,2，胡新3，郭天財1,2，王永華1,2，馮偉1,2

1河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/作物生長發(fā)育調(diào)控教育部重點實驗室，鄭州 450046；2國家小麥工程技術(shù)研究中心，鄭州 450046；3商丘市農(nóng)林科學(xué)院小麥研究所，河南商丘 476000

【】明確不同水分條件下低溫脅迫引起的小麥凍害程度，篩選凍害鑒定指標并建立凍害定量評估模型，為小麥生產(chǎn)科學(xué)防控低溫凍害提供理論支撐。以弱春性品種偃展4110、蘭考198和半冬性品種鄭麥366、豐德存麥21為試驗材料，在模擬凍害發(fā)生前一周進行灌水（W）和不灌水（D）處理，于雌雄蕊分化期將盆栽小麥移到低溫模擬室進行處理，設(shè)置的溫度為-2℃（T1）、-4℃（T2）、-6℃（T3）、-8℃（T4）和-10℃（T5）以及對照（CK為當天大田溫度），低溫脅迫后的第2天測定小麥生理生化指標，將標準化后的各個生理指標進行主成分、隸屬函數(shù)、聚類分析和逐步回歸等多元統(tǒng)計分析。不同品種、水分、溫度下的各單項生理生化指標之間大多存在著顯著相關(guān)性，通過主成分分析將19個生理生化指標轉(zhuǎn)化為6個相互獨立的綜合指標，其貢獻度分別為55.972%、11.93%、7.168%、5.075%、4.236%和3.079%，代表了全部原始數(shù)據(jù)的87.459%的信息量，并根據(jù)隸屬函數(shù)算法求出各處理的凍害程度綜合評價值（值）。以值作為因變量，通過逐步回歸分析篩選出7個關(guān)鍵指標，分別為葉綠素a、葉片含水量、脯氨酸、v/m、可溶性蛋白、MDA和SOD，并確立了定量估算值的數(shù)學(xué)模型。同時，將預(yù)測值與產(chǎn)量損失率進行相關(guān)性分析，線性方程決定系數(shù)2= 0.898，表明該預(yù)測模型能夠很好地評價凍害程度。進一步對預(yù)測值進行聚類分析，可將不同凍害處理劃分為5類：未受凍（D-CK、W-CK）、輕度受凍（D-T1、W-T1）、中度受凍（D-T2、W-T2、W-T3）、重度受凍（D-T3、W-T4）以及特重受凍（D-T4、W-T5、D-T5），其產(chǎn)量損失率分別為0、0—10%、10%—30%、30%—50%及50%以上，相同的溫度和水分條件下弱春性品種的凍害程度重于半冬性品種，相同的品種和溫度條件下不灌水處理的凍害程度重于灌水處理。具體考察所篩選的生理評價指標，隨著低溫脅迫的加重，葉綠素a、葉片含水量、v/m表現(xiàn)下降趨勢，而脯氨酸、可溶性蛋白和SOD活性表現(xiàn)先升后降的特征，MDA則為相反趨勢。生產(chǎn)中在晚霜凍易發(fā)地區(qū)應(yīng)選用半冬性品種，且依據(jù)天氣預(yù)報寒流來臨前加強灌水管理，并可在凍害發(fā)生時通過凍害評價指標及定量模型及時準確評估凍害發(fā)生程度，這有利于晚霜凍害的科學(xué)防控，為災(zāi)后產(chǎn)量恢復(fù)及決策管理提供依據(jù)。

冬小麥；晚霜凍害；灌水；綜合評價；評估模型

0 引言

【研究意義】隨著溫室效應(yīng)的加劇，全球氣溫不斷升高。在全球變暖的背景下，極端天氣發(fā)生的次數(shù)、強度也在不斷增加[1]。低溫頻發(fā)增加了冬小麥生產(chǎn)系統(tǒng)的不穩(wěn)定性，加劇了冬小麥產(chǎn)量損失風險[2]。小麥拔節(jié)后霜凍被稱為晚霜凍害，在我國小麥重要產(chǎn)區(qū)黃淮海地區(qū)頻繁發(fā)生，此時小麥抗凍性相比前期明顯變?nèi)?，產(chǎn)量損失風險加大，凍害一旦發(fā)生，產(chǎn)量損失可達15%—60%[3]，嚴重影響我國糧食安全。因此，及時準確評估晚霜凍害對冬小麥產(chǎn)量的影響，以便盡早采取補救措施，對挽回因凍害造成的產(chǎn)量損失具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】研究表明，逆境脅迫對植物生長產(chǎn)生重要影響，主要通過影響滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、抗氧化物酶等生理指標[3-5]，進而對葉綠體、光合結(jié)構(gòu)造成破壞，從而導(dǎo)致葉綠素降解，葉綠素熒光如Fv/Fm和qP下降[6-8]。低溫脅迫是一種常見的逆境，植物對低溫的適應(yīng)與抗性建成是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，單一的生理指標變化無法準確評估逆境對植株的影響[9]。目前大多數(shù)研究是從生理學(xué)和形態(tài)學(xué)指標等方面對逆境脅迫進行綜合性評價[10-11]。鄒成林等[12]利用指標之間的相關(guān)性及評分分級法，綜合評價玉米苗期的抗旱性，并提出植株含水量、葉綠素含量、酶活性、可溶性糖含量、MDA含量可作為抗旱性鑒定指標。袁雨豪等[13]研究了鹽脅迫對糜子生理指標的影響，利用主成分及聚類分析將多種生理指標進行綜合，進而對耐鹽性進行分類，篩選出高度耐鹽品種。李春喜等[14]通過主成分分析、隸屬函數(shù)法和聚類分析法相結(jié)合，篩選出不同抗旱性小麥品種，并對抗旱性強弱進行分類。盧廣超等[15]對熒光參數(shù)及生理指標進行主成分分析，實現(xiàn)了4種常用植物的抗寒性分類。以上研究表明，前人利用生理指標在植物逆境脅迫下的響應(yīng)變化，并采用主成分分析、隸屬函數(shù)法等分析方法綜合評估植株的抗逆性。有關(guān)作物晚霜凍害的研究也多利用多元統(tǒng)計分析方法對作物抗寒性進行評價[16]。王樹剛等[9]發(fā)現(xiàn)，SOD、POD、CAT、MDA和可溶性蛋白可以作為小麥品種抗凍性鑒定的指標，并利用主成分分析和聚類分析法對品種進行抗寒性篩選。姜麗娜等[17]對小麥拔節(jié)期進行低溫處理，提出了滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、抗氧化物酶等生理指標可作為抗寒性鑒定指標，并利用隸屬函數(shù)法和極點排序法將不同品種的抗寒性進行強弱劃分?！颈狙芯壳腥朦c】前人相關(guān)研究多以單低溫處理、多品種材料為對象，利用主成分分析方法篩選種質(zhì)資源，以及評價不同品種的抗寒性強弱。同時寒流發(fā)生前灌水是預(yù)防小麥凍害、減輕危害的最常用的生產(chǎn)措施。但不同水分條件及低溫水平對作物凍害程度及產(chǎn)量損失的效應(yīng)是不同的，而有關(guān)這方面的研究較少。因此積極探索并明確不同水分、低溫及品種多種因素條件下晚霜凍害對小麥產(chǎn)量的影響程度及其評價方法，這對于提前評估因凍害引起的植株傷害及其產(chǎn)量損失，并及時采取預(yù)防或補救措施具有重要的參考價值?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究設(shè)置了模擬凍害發(fā)生前灌水和不灌水兩種水分條件，選用具有代表性且生產(chǎn)上大面積推廣應(yīng)用的不同類型小麥品種，測定不同低溫處理下植株生理生化指標的響應(yīng)變化，通過主成分分析法、隸屬函數(shù)法及聚類分析方法相結(jié)合綜合評估小麥凍害程度，進而借助逐步回歸分析篩選出適宜的抗寒性評價指標，以期為災(zāi)后產(chǎn)量恢復(fù)以及應(yīng)時決策管理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2018—2020年度在河南省商丘市農(nóng)林科學(xué)院小麥試驗基地的低溫模擬室進行。試驗材料選取河南省主推的4個不同類型的冬小麥品種，弱春性品種偃展4110（YZ4110）和蘭考198（LK198），半冬性品種鄭麥366（ZM366）和豐德存麥21（FDC21）。試驗用盆為直徑25 cm、高度35 cm、兩頭開口的圓柱形空心管。試驗用土取自商丘市農(nóng)林科學(xué)院小麥試驗基地大田土壤，經(jīng)過細篩、曬干、稱重后裝入桶中，土壤肥力狀況平均為有機質(zhì)13.4 g·kg-1，水解氮74.2 mg·g-1，速效磷36.31 mg·g-1，速效鉀129.48 mg·g-1。播種前將盆埋在大田之中，使其頂部與地表基本持平，使得盆栽生長環(huán)境等同于大田環(huán)境。分別于2018年11月9日、2019年11月12日進行播種，每盆均勻定株7株。低溫處理時期為雌雄蕊分化期，并設(shè)定兩個水分處理，分別為凍前1周不灌水（土壤含水量13%—15%，土壤表層干旱，D），凍前1周灌水1次（土壤含水量20%—22%，土壤水飽滿，W）。在兩個水分條件下，并設(shè)置了5個溫度梯度T1、T2、T3、T4、T5，分別對應(yīng)-2℃、-4℃、-6℃、-8℃、-10℃，以及對照CK（當日大田氣溫分別為11℃/5℃、22℃/8℃）。低溫處理時間為8 h，每次處理為5個重復(fù)。低溫處理結(jié)束后，立即將盆栽搬到大田原位，使其恢復(fù)原來的生長環(huán)境，并于低溫脅迫后的第2天進行取樣測定生理指標。

1.2 低溫模擬室

低溫室的長寬高分別為7 m×5 m×2.6 m，頂部裝置有2條尼龍布形成的通風管道，分別與室外的兩臺制冷壓縮機連接。在管道兩側(cè)均勻排布若干個直徑為5 cm的圓形通風口，冷風通過圓形通風口在1.9 m以上的水平方向上進行冷氣流動，并形成一個制冷空間。冷空氣均勻下沉，形成強輻射降溫。

1.3 生理指標測定

低溫脅迫后第2天，分別取各處理以及對照品種完全展開的頂1葉用于生理指標測定，每個處理設(shè)3次重復(fù)。葉片相對含水量（LWC）、莖相對含水量（SWC）采用烘干法，色素類指標含量測定采用分光光度法，具體包括葉綠素a（Chla）、葉綠素b（Chlb）、類胡蘿卜素（Car）、葉綠素總量（Chla+b）、葉綠素a/b（Chla/b），可溶性糖含量（SSC）采用蒽酮比色法[18]，可溶性蛋白（BCA）采用考馬斯亮藍比色法[18]，游離脯氨酸含量（Pro）采用磺基水楊酸浸提-酸性茚三酮顯色法[19]，丙二醛（MDA）含量采用TBA比色法[20]，超氧化物歧化酶（SOD）采用NBT比色法[21]，過氧化物酶（POD）采用愈創(chuàng)木酚比色法[21]，過氧化氫酶（CAT）采用過氧化氫法測定[21]。

1.4 葉綠素熒光參數(shù)測定

葉綠素熒光參數(shù)測定采用德國MINI-PAM量子分析儀。測定在上午進行，均選擇完全展開的頂1葉，每個處理測試3張葉片。葉片經(jīng)過30 min暗適應(yīng)后測定初始熒光（o）、最大熒光（m）、PSⅡ潛在活性（v/o）和PSⅡ最大光學(xué)效率（v/m）；之后測定光化學(xué)淬滅系數(shù)（qP）、相對電子傳遞速率（ETR）和PSII實際光量子效率（Y(II)）。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Excel軟件對原始數(shù)據(jù)進行預(yù)處理，SPSS19.0軟件對預(yù)處理后數(shù)據(jù)進行主成分、方差、聚類和逐步回歸分析。因為不同的農(nóng)藝指標有不同的數(shù)據(jù)范圍和單位，采用數(shù)據(jù)標準化進行轉(zhuǎn)化，每個生理指標轉(zhuǎn)換如下：

式中，′為每個指標標準化之后的數(shù)據(jù)，為第個品種指標測定值，和′為第個指標的標準偏差和第個指標的樣本平均值。

在數(shù)據(jù)預(yù)處理后，用SPSS19.0進行主成分分析（PCA），用公式（2）求得每個處理各綜合指標的隸屬函數(shù)值：

式中，表示第個綜合指標；表示第個綜合指標的最小值；表示第個綜合指標的最大值。

用公式（3）可求出各綜合指標的權(quán)重：

式中，表示第個綜合指標在所有綜合指標中的重要程度即權(quán)重；為各小麥品種第個綜合指標的貢獻率。

用公式（4）計算每個處理下的小麥的凍害程度的大小[22]，以值表示：

式中，值為各低溫處理的小麥通過用綜合指標評價得到的凍害程度綜合評價值。

將值作為因變量，對各個標準化的數(shù)據(jù)進行逐步回歸分析，獲得回歸方程。

2 結(jié)果

2.1 凍害對不同品種和水分處理的幼穗形態(tài)及產(chǎn)量的影響

小麥幼穗受凍的形態(tài)結(jié)果（以YZ4110為例）表明，隨著溫度不斷降低，幼穗受凍程度逐漸嚴重，幼穗逐漸失水萎縮變形，顏色變白，部分幼穗死亡，小花敗育加重，導(dǎo)致穗粒數(shù)顯著減少。在不灌水（D）條件下，T3溫度時出現(xiàn)幼穗部分死亡，當溫度降至T4和T5時，小麥幼穗死亡且不可恢復(fù)；而在灌水處理（W）條件下，T3溫度脅迫的幼穗凍死率較低，受凍程度明顯輕于不灌水處理，當溫度降至T4時，幼穗才出現(xiàn)部分死亡，至T5時，幼穗死亡（圖1）。

由圖2可知，凍害條件下2年產(chǎn)量的變化趨勢相同，不同低溫導(dǎo)致的小麥產(chǎn)量損失情況因水分和品種而表現(xiàn)不同。當溫度降至T1時，不灌水（D）的弱春性品種（YZ4110和LK198）的產(chǎn)量降低，較CK差異達顯著水平，而半冬性品種（ZM366和FDC21）產(chǎn)量的降低未達到顯著水平；當溫度降至T2及以下時，兩種水分條件下的所有品種產(chǎn)量均顯著降低。從產(chǎn)量損失率均值來看，不灌水條件下 T1、T2、T3、T4—T5的產(chǎn)量損失率分別為3.33%—7.83%、17.78%—28.46%、33.56%—49.38%和67.27%—93.65%；灌水條件下的產(chǎn)量損失率分別為1.70%—4.13%、12.15%—18.60%、22.33%—32.75%和41.92%—76.04%。兩種水分條件下產(chǎn)量損失率在品種間均表現(xiàn)為LK198＞YZ4110＞ZM366＞FDC21。

D為不灌水處理；W為灌水處理。5個低溫處理分別為-2℃（T1），-4℃（T2），-6℃（T3），-8℃（T4）和-10℃（T5）。下同

A為2019年，B為2020年。YZ4110、LK198、ZM366和FDC21分別為偃展4110、蘭考198、鄭麥366和豐德存麥21。誤差線上不同字母表示處理間差異顯著（P＜0.05）。下同

2.2 不同處理冬小麥生理生化指標的變異性

表1為各個指標在不同溫度和水分條件下的變化。從變異系數(shù)可以看出，在不灌水條件下，因低溫和品種引起的各指標變異系數(shù)范圍為4.87%—52.12%，而灌水條件下為3.74%—44.59%，且各指標在不灌水的變異系數(shù)均大于灌水，這表明了低溫脅迫前進行灌水，使得生理指標的穩(wěn)定性增強。從平均值可以得出，灌水條件下滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量及抗氧化物酶活性均提高。灌水下的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)（可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸）含量較不灌水分別提高了26.80%、10.23%和13.43%；抗氧化物酶活性（CAT、POD、SOD）較不灌水增幅分別為14.06%、7.2%和12.81%。對細胞膜具有毒害作用的MDA含量在灌水條件下較不灌水降低了13.06%。而葉綠素指標、植株含水量、葉綠素熒光參數(shù)等也是反映植株受凍程度的生理表征指標，其數(shù)值在灌水條件下均高于不灌水。

表1 不同水分處理下低溫脅迫處理的植株各性狀比較

Chla為葉綠素a，Chlb為葉綠素b，Car為類胡蘿卜素，Chla+b為葉綠素總量，Cha/b為葉綠素a/b，SWC為莖含水量，LWC為葉含水量，SSC為可溶性糖含量，Pro為脯氨酸，Y（II）為PSII實際光量子效率，ETR為相對電子傳遞速率，qP為光化學(xué)淬滅系數(shù)，v/m為PSⅡ最大光學(xué)效率，v/o為PSⅡ潛在活性，SP為可溶性蛋白，CAT為過氧化氫酶，MDA為丙二醛，POD為過氧化物酶，SOD為超氧化物歧化酶。下同

Chla was chlorophyll a, Chlb was chlorophyll b, Car was Carotenoids, Chla+b was total content of chlorophyll, Chla/b was chlorophyII a/b, SWC was stem water content, LWC was leaf water content, SSC was soluble sugar content, Pro was proline, Y(II) was PSII actual photochemical efficiency, ETR was relative electron transport rate, qP was photochemical quenching,v/mwas PSII maximum photochemical efficiency,v/owas PSII potential activity, SP was soluble protein, CAT was catalase, MDA was malondialdehyde, POD was peroxide dismutase, SOD was superoxide dismutase. The same as below

通過Mann-Whitney U非參數(shù)檢驗可知，除Car、Chla+b、SWC、Y (II)、ETR和POD外，其余生理指標均在灌水和不灌水間存在顯著差異（＜0.05），其中v/m達到極顯著水平（＜0.01）。以上結(jié)果表明灌水增強了植株生理生化指標對低溫的應(yīng)激響應(yīng)能力，減緩了低溫對植株造成的傷害程度，進而提高抗寒性。

2.3 不同生理生化指標之間相關(guān)性分析

測定指標中，MDA與其他指標間呈負相關(guān)，且均達極顯著水平（＜0.01），其他指標間相關(guān)性均為正相關(guān)（表2）。Chlb與余下參數(shù)中一半指標（9個）的相關(guān)性未達顯著水平；Chla/b與SWC和BAC間相關(guān)性不顯著；SWC與5個指標（SSC、BCA、CAT、POD和SOD）間相關(guān)性不顯著；除以上指標外，其余各生理指標間的相關(guān)性均達到顯著水平（＜0.05）。各生理指標之間表現(xiàn)出大小不等的相關(guān)性，且大多數(shù)指標之間的相關(guān)性達到顯著性水平，這就導(dǎo)致了生理指標之間反映植株的抗寒信息存在交叉，甚至發(fā)生很大程度的重疊。不同低溫下各個指標在植株抗寒性應(yīng)激反應(yīng)中的功能不盡相同，直接應(yīng)用各個指標對植株的抗寒性進行評價是不準確的，很難準確反映出小麥的凍害嚴重程度，導(dǎo)致評價結(jié)果具有很大的局限性。為了彌補直接應(yīng)用各個生理指標進行抗寒性評價的不足，有必要進一步采用主成分和聚類分析進行綜合評價。

2.4 主成分分析及隸屬函數(shù)分析

將原始數(shù)據(jù)進行標準化，并使用SPSS軟件對標準化后的數(shù)據(jù)主成分分析。根據(jù)累計貢獻率＞85%的原則，共提取了6個主成分，并將19個單項指標轉(zhuǎn)化為6個綜合主成分（CI1—CI6），各主成分的特征向量及貢獻率如表3所示。前6個主成分的累計貢獻率高達87.459%，具有較強的代表性，包含了原始指標所攜帶的大部分信息。其中，第一主成分中指標系數(shù)較高的為Chla、Car、Chla/b和熒光參數(shù)，第二主成分的指標為CAT和SOD，第三主成分的指標為Chlb和Chla+b，第四主成分的指標為可溶性蛋白BCA和SWC。可見，光合性狀、抗氧化物酶、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)是反映植物受凍情況最顯著的生理指標。

表2 不同生理生化指標間的相關(guān)系數(shù)

*和**分別表示0.05和0.01水平顯著相關(guān)

* and ** are significant correlation at 0.05 and 0.01 probability levels, respectively

表3 各綜合指標特征值、貢獻率以及隸屬函數(shù)權(quán)重

同時利用公式（2）對各低溫處理下的冬小麥綜合指標進行隸屬函數(shù)分析并獲得各成分的隸屬函數(shù)值U（X）及其對應(yīng)權(quán)重。并利用公式（4）計算各個低溫處理下的冬小麥凍害程度綜合評價值（值）（圖3）。由各品種的值范圍結(jié)果可知，同一水分條件下，半冬性品種的最大、最小及平均值均高于弱春性品種；而同一品種條件下，灌水的各項值也均高于不灌水。

圖3 不同灌水條件下4個小麥品種凍害程度綜合評價值（F值）的變化

為篩選出表征小麥凍害程度的重要鑒定指標，以上述的綜合評價值（）作因變量，試驗測定的19個生理生化指標（X）為自變量，采用逐步回歸分析的方法，篩選出了7個關(guān)鍵指標，并建立了最優(yōu)化的評價凍害程度的定量數(shù)學(xué)模型：

=0.605+0.038X1+0.031X7+0.022X9+0.06X13+0.022X15-0.025X17+0.038X19（2=0.990，=0.0001） 式中，X1、X7、X9、X13、X15、X17、X19分別為葉綠素a、葉片含水量、脯氨酸、v/m、可溶性蛋白、丙二醛和超氧化物歧化酶。

2.5 不同處理的F預(yù)測值聚類分析

采用最近距離法對預(yù)測值進行聚類分析（圖4），可將48個處理的小麥凍害程度劃分為5類，第一類為未受凍（D-CK、W-CK），第二類為輕度受凍（D-T1、W-T1），第三類為中度受凍（D-T2、W-T2、W-T3），第四類為重度受凍（D-T3、W-T4），第五類為特重受凍（D-T4、W-T5、D-T5）。不同水分條件影響聚類結(jié)果，在T1和T2溫度下，水分之間無差異；當溫度降至T3時，D-T3處理為重度受凍，而W-T3處理則為中度受凍；溫度繼續(xù)降至T4時，W處理處于重度受凍，而D處理則為特重受凍。輕度及以下受凍的產(chǎn)量損失率低于10%，中度受凍為10%—30%，重度受凍為30%—50%，特重受凍為50%以上。

為驗證值評估凍害程度的準確性，進一步分析產(chǎn)量損失率與相對值之間的關(guān)系（圖5）。產(chǎn)量損失率與值之間呈一元三次擬合關(guān)系（2=0.898），當產(chǎn)量損失率低于10%，該階段處于輕度及以下受凍程度，主要表現(xiàn)為內(nèi)在生理指標的應(yīng)激及響應(yīng)能力提高，以減少凍害的損傷程度，使得值趨近于1；當產(chǎn)量損失率大于10%，此時凍害已達到中度程度，已超出生理應(yīng)激范圍，值下降趨勢逐漸明顯；當脅迫程度處于重度以上時，凍害對產(chǎn)量影響嚴重，各品種值降至最低，降幅平緩。這表明了基于植株早期生理生化變化所構(gòu)建的凍害綜合模型可以準確地評價小麥后期的產(chǎn)量損失狀況。

圖4 不同水分、品種、溫度處理下的F值聚類

圖5 相對F值與產(chǎn)量損失率間關(guān)系

2.6 低溫脅迫對不同處理冬小麥生理指標的影響

通過主成分分析及多元逐步分析篩選出7個關(guān)鍵指標，以此7個生理指標為例，具體分析低溫脅迫的影響。由圖6可知，隨著凍害程度的加重，不同小麥品種的葉片含水量、葉綠素a、v/m均下降。同一低溫脅迫下，葉片含水量、葉綠素a、v/m的變化情況因品種和灌水而降幅不同。整體而言，T1和T2溫度時葉片含水量、葉綠素a、v/m降幅較小，當溫度降至T3時，降幅增大且不灌水和灌水間差異顯著，兩個水分條件下降幅最大和最小的品種均為LK198和FDC21。T3溫度相較于CK，葉片含水量在不灌水條件下降幅為4.75%—11.85%，而在灌水條件下降幅為3.49%—4.64%；葉綠素a含量在不灌水和灌水條件下降幅分別為17.48%—31.32%和8.46%—15.27%；v/m在不灌水和灌水條件下降幅分別為14.46%—24.07%和7.83%—15.95%。

由圖7可知，在正常溫度CK條件下，脯氨酸和可溶性蛋白在灌水和不灌水條件下存在顯著差異，這表明不灌水下植株處于相對脅迫狀態(tài)，使得滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量提高。隨著脅迫的不斷加重，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸和可溶性蛋白在兩種水分條件下均表現(xiàn)出先升后降的趨勢。脯氨酸含量在不灌水條件下各品種均于T2溫度時達到最大值，且處理間差異達到顯著，其中LK198增幅最小，F(xiàn)DC21增幅最大，分別較對照增加了15.43%和27.1%，當溫度降至T3時，ZM366和FDC21的脯氨酸含量仍高于CK，而另外兩個品種已低于CK；灌水條件下脯氨酸含量出現(xiàn)最高值的溫度因品種而異，YZ4110和LK198在T2溫度時脯氨酸含量最高，增幅分別為39.94%和37.38%，而ZM366和FDC21則在T3溫度時最高，分別較CK增加了51.16%和57.86%，且4個品種均在T5溫度時脯氨酸含量開始低于CK。不灌水下的可溶性蛋白含量在T1（YZ4110和LK198）或T2（ZM366和FDC21）溫度時達最大值，其中YZ4110和LK198的最大增幅為12.52%和7.17%，而ZM366和FDC21在T2下可溶性蛋白含量較CK分別增加了31.9%和32.5%。而灌水條件下的各品種可溶性蛋白含量則均在T3溫度時達峰值，較CK增幅最大的為FDC21（70.31%），增幅最小為LK198（42.67%）。

由圖8可知，在正常溫度CK條件下，兩種水分處理間SOD酶活性存在顯著性差異。SOD酶作為抗氧化物酶系統(tǒng)的第一道防線，隨著溫度的不斷降低，SOD酶活性呈現(xiàn)出先升后降的趨勢。不灌水條件下的各品種SOD酶活性在T2溫度均達最大值，4個品種的最大值較CK分別增加了25.39%、19.65%、29.83%和33.04%；灌水條件下各品種SOD酶活性均在T3溫度下達最大值，以上4個品種較CK增幅分別為55.84%、49.71%、62.6%和68.62%。作為膜脂過氧化最終產(chǎn)物的MDA，其含量隨溫度降低呈先降后升的趨勢。在不灌水條件下，4個品種均在T1溫度時最低，降幅分別為8.67%（YZ4110）、6.05%（LK198）、10%（ZM366）和11.53%（FDC21）；而灌水條件下的MDA含量在T2溫度時最小，4個品種一致，具體降幅為FDC21（29.54%）＞ZM366（29.13%）＞YZ4110（25.65%）＞LK198（17.86%）。

圖6 不同灌水處理下凍害對葉片含水量、葉綠素a和Fv/Fm的影響

圖7 不同灌水處理下凍害對脯氨酸和可溶性蛋白含量的影響

圖8 不同灌水處理下凍害對SOD酶活性及MDA含量的影響

3 討論

3.1 灌水緩解低溫脅迫影響的生理機制

低溫脅迫下植物會發(fā)生一系列生理生化反應(yīng)以響應(yīng)和抵御低溫造成的傷害[23]，凍害程度超出植株承受能力后，抵御低溫脅迫的能力降低，如滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量、抗氧化物酶活性降低，使得細胞喪失抗寒能力，從而導(dǎo)致植株死亡[24-28]。為了減緩植株受凍害的程度，前人通過灌水措施加強作物田間保溫，提高植株冠層溫度，有助于穩(wěn)定葉片含水量[29]，在減緩葉綠素和光合機構(gòu)受損程度方面發(fā)揮一定作用[30]，增強植株的抗寒性，為此有研究者將植株冠層溫度作為低溫脅迫指標[31]。曹娜等[32]研究表明，晚稻抽穗揚花期在受到低溫脅迫時，通過灌水處理可以提高冠層溫度和葉片溫度，降低冷害脅迫程度。劉立軍等[29]認為，低溫條件下，灌水處理的高羊茅葉片含水量降幅較小，不僅提高滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量，而且降低膜脂過氧化程度，緩解電解質(zhì)滲透速度，從而減弱低溫脅迫對細胞膜的傷害。單旭東等[33]研究認為，灌水處理通過提高抗氧化物酶活性，從而降低了MDA含量，緩解低溫脅迫對結(jié)縷草細胞膜的損傷。曹倩等[34]發(fā)現(xiàn)苜蓿在遭受低溫脅迫時，適宜土壤水分提高了滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量，增強了植株的滲透調(diào)節(jié)能力，使得光合機構(gòu)和葉綠素體結(jié)構(gòu)破壞程度降低。在小麥凍前澆水研究表明，凍前灌水對遭受到低溫脅迫的冬小麥具有正效應(yīng)，可有效緩解凍害造成的傷害[4]。但前人側(cè)重研究土壤表層濕度減輕低溫導(dǎo)致的產(chǎn)量損失程度，較少解釋增加土壤濕度進而增強植株抗寒性的生理機制。植株含水量是對土壤水分狀況的最直接的反映，本試驗中，灌溉土壤含水量高于未灌溉土壤含水量，進而導(dǎo)致正常溫度CK條件下灌溉植株含水量高于未灌溉植株，但兩種水分處理間差異并不顯著，而可溶性蛋白、脯氨酸、SOD酶活性在水分處理間差異達到顯著水平，這在一定程度上顯示出一些生理生化指標的變化盡管與含水量有關(guān)，卻較含水量更能反映出在低溫脅迫時緩解凍害的作用，其內(nèi)在的機理還有待進一步明確。在同一溫度下，灌水處理的葉片含水量高于不灌水處理，在正常溫度CK條件下兩種水分處理間沒有顯著差異，但隨著低溫脅迫的加重，兩種水分處理間差異水平越明顯，如T2以后差異達顯著水平，導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因可能與水分相態(tài)發(fā)生變化進而影響組織結(jié)構(gòu)及水分運輸有關(guān)，在這方面還需深入研究明確。本研究中葉片含水量與MDA含量及熒光參數(shù)極顯著相關(guān)，表明良好的水分狀況有利于減輕膜脂過氧化的傷害程度，維持較高的光合活性，進而減輕低溫對植株的凍害。整體而言，灌溉處理下葉片含水量高于未灌水，表明適當?shù)膬銮肮嗨幚碓鰪娏思毎Ｋ芰?，并降低了細胞膜透性，同時抗氧化物酶類活性提高，緩解了膜脂過氧化程度，使得MDA含量低于不灌水處理；可溶性蛋白、脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的累積量增加，進一步降低了細胞冰點，減緩了細胞膜受損程度，并且緩解了葉綠素的降解，光合受損程度降低，進而增強了植株的抗寒性。各品種在灌水處理下的葉片含水量、葉綠素含量、葉綠素熒光參數(shù)等指標在不同低溫脅迫下的降幅均低于不灌水處理；而通常作為抗寒性鑒定指標SOD酶等抗氧化物酶、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量在相同低溫脅迫下，灌水高于不灌水，這表明灌水處理的小麥植株通過最大程度的生理應(yīng)激響應(yīng)，以維持機體的正常代謝機能，減緩了受凍程度，并使得各品種能夠在嚴重脅迫下生存。本試驗中，灌水處理的小麥在T3溫度下凍害程度僅為中度受凍，而不灌水則已處于重度受凍。這表明凍前灌水提高了冬小麥的抗寒性，緩解了低溫脅迫造成的凍害程度，生產(chǎn)中應(yīng)依據(jù)天氣預(yù)報在寒流到來前，尤其對干旱地塊進行灌水，可以在很大程度上防御晚霜凍害。

3.2 多因素作用下凍害程度的綜合評估

不同的生理生化指標對逆境脅迫的響應(yīng)程度不同，單項生理生化指標無法準確評估植株抗逆性[9]。前人研究多利用綜合評價方法鑒定植株的抗逆性[22,35-36]。姜麗娜等[17]分析了24個小麥品種受到拔節(jié)期低溫脅迫的生理響應(yīng)，通過隸屬函數(shù)和綜合排序法將品種抗寒性分為5類。張軍等[37]通過分析低溫脅迫對生理指標的影響效應(yīng)，基于所測生理指標的隸屬值評估小麥品種的抗寒性。但由于各指標之間存在一定的相關(guān)性和生理重疊性，僅用隸屬函數(shù)法評估小麥的抗寒性具有較大的局限性[10]。而主成分分析法（PCA）可以將多個指標轉(zhuǎn)化成新的個數(shù)較少且彼此獨立的綜合指標，同時根據(jù)各自貢獻率的大小明確每個綜合指標的相對重要性。因此，前人利用主成分和隸屬函數(shù)相結(jié)合的方法評估植物的耐寒性，實現(xiàn)了綜合評價不同品種抗寒性強弱的目標[16-17,38-39]。前人對小麥凍害程度的研究多為單一低溫條件下品種資源的抗寒性比較，而不同的水分條件及基因型品種對低溫的響應(yīng)程度及抗寒性存在明顯差異，這導(dǎo)致以前確立的綜合評價方法并不適用于不同品種、灌水及溫度等多因素綜合條件下的小麥凍害程度評估。為此，本試驗研究小麥生產(chǎn)中3個關(guān)鍵要素（2個品種類型、2種灌水處理和6個溫度處理）條件下植株的受凍程度，但僅用單一的生理指標或者簡單相關(guān)分析凍害程度具有局限性，且缺乏準確性。故利用主成分分析和隸屬函數(shù)法將19個生理指標和熒光參數(shù)進行綜合分析，最終得到凍害程度綜合評價值（值）。隨著溫度脅迫的不斷加重，不同品種在相同水分下的綜合值均表現(xiàn)為先升后降趨勢，其原因是脅迫程度未超出細胞承受能力時，抗氧化物酶和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量升高，以抵御低溫脅迫對細胞的傷害，因此值越大，表示抗寒性越強；當脅迫加重后，由于細胞膜破裂，抗氧化物酶和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量開始明顯下降，葉片含水量、葉綠素含量和葉綠素熒光參數(shù)等降低，進而值表現(xiàn)逐漸變小。在相同的溫度和水分條件時，值表現(xiàn)為半冬性品種（FDC21、ZM366）＞弱春性品種（YZ4110、LK198），表明基因型在作物抗寒機制中發(fā)揮基礎(chǔ)作用；在相同的品種和溫度條件下，值表現(xiàn)為灌水＞不灌水，表明灌水處理通過加強對生理指標的應(yīng)激響應(yīng)能力，在生理生化層面上增強了植株的抗寒能力。進一步以值為因變量，19個生理指標為自變量，通過逐步回歸確立了凍害綜合指數(shù)的定量估算模型?；谠擃A(yù)測值進行聚類分析，可劃分為5類：未受凍、輕度受凍、中度受凍、重度受凍和特重受凍，對應(yīng)的產(chǎn)量損失率分別為0、＜10%、10%—30%、30%—50%及＞50%。研究結(jié)果有利于準確評估凍害發(fā)生后的小麥受凍程度及產(chǎn)量損失狀況，為凍害后的補救措施制定提供科學(xué)依據(jù)。

3.3 凍害綜合評估的指標篩選與提前預(yù)測評估

有關(guān)植物抗寒性的生理生化鑒定指標，前人相關(guān)研究并不完全一致，這與作物種類、品種類型、生態(tài)區(qū)以及生長環(huán)境有關(guān)[16,25,27,29]。作物抗逆性是基于基因和環(huán)境互作的多種生理指標的綜合體現(xiàn)，但由于生理指標較多，各個指標在逆境應(yīng)激反應(yīng)中的作用也不一樣，并不是所有的生理生化指標均能有效準確鑒定植物的抗逆性能。為此，前人多通過主成分-回歸分析相結(jié)合的方法篩選出抗逆性評價指標，先后在花生耐蔭性[40]、谷子耐鹽性[41]及棉花抗旱性評估[34]方面取得較好效果。目前對于小麥抗寒性指標的篩選研究大多通過生理指標與農(nóng)藝參數(shù)的相關(guān)系數(shù)及關(guān)聯(lián)性進行，王濤等[42]以小麥返青率為目標，篩選出相對含水量是小麥抗寒性評價指標；趙瑞玲等[43]以小麥葉片枯黃面積為標準，發(fā)現(xiàn)相對電導(dǎo)率可指示凍害程度；張自陽等[44]以小麥幼穗結(jié)實數(shù)為對象，明確了POD活性、SOD活性、MDA含量為小麥抗寒性鑒定指標；吳青霞等[45]以產(chǎn)量為標準，篩選出脯氨酸、可溶性蛋白含量等為抗寒性指標。前人基于主成分-隸屬分析-逐步回歸等多元統(tǒng)計方法篩選生理指標的研究較少，缺少低溫脅迫下植株生理生化反應(yīng)的綜合評價指標構(gòu)建，以及少數(shù)關(guān)鍵敏感性因子的降維。隨著全球氣候變暖及春季極端溫度波動加大，晚霜凍害的發(fā)生頻率呈上升趨勢，晚霜凍害已成為影響黃淮麥區(qū)小麥生產(chǎn)的主要災(zāi)害因子。晚霜凍害嚴重時，會使冬小麥小穗大面積受傷甚至死亡，降低產(chǎn)量。由于晚霜凍害發(fā)生較晚，往往莖葉無異常表現(xiàn)，受害部位主要是穗部，危害情況難以直觀地了解和評估，只有在抽穗以后才能夠觀察，而此時小麥成穗數(shù)已完全確定，對穗粒數(shù)所造成的影響也難以挽回。因此，凍害發(fā)生后及時依據(jù)少數(shù)關(guān)鍵幾個植株生理生化指標的變化定量評估小麥凍害程度，這對于產(chǎn)量損失評估及補救措施制定具有重要意義。本研究設(shè)置不同水分條件、品種類型及低溫脅迫水平，于凍后第2天測定19個生理生化指標，通過主成分-隸屬函數(shù)-逐步回歸分析法篩選出7個關(guān)鍵性評估凍害程度的生理指標：葉綠素a、葉片含水量、脯氨酸、v/m、可溶性蛋白、MDA和SOD，以此確立的凍害綜合指數(shù)預(yù)測值與產(chǎn)量間方程決定系數(shù)達到0.898。小麥晚霜凍害發(fā)生后，植株生理生化的變化比外觀形態(tài)指標更為顯著，在凍后第2天及時進行生理指標的采集，更能及時反映出植株的凍害程度，這為早期評估晚霜凍害對小麥造成的損害程度，從而為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中及時制定積極主動的補救措施提供依據(jù)和決策參考。此外，本文篩選出的7個指標不僅能代表眾多生理指標的原始信息量，更達到了評價指標降維的目的，減少了實際測量的工作量，這有利于準確有效評估小麥凍害程度，可應(yīng)用性強。但是生產(chǎn)中晚霜凍害發(fā)生的時期及小麥幼穗發(fā)育所處的階段并不固定，抗寒性生理指標是否存在差異，還需進一步驗證。小麥拔節(jié)后幼穗發(fā)育對低溫的抵抗力顯著下降，及時灌水改善土壤墑情是減輕晚霜凍害的主要措施，有關(guān)灌水增強小麥低溫應(yīng)激響應(yīng)的護穗機理，以及減輕凍害傷害的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)均有待進一步明確，這將為小麥凍害防御與補救減損提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

4 結(jié)論

本研究明確了兩種類型小麥品種在不同水分和低溫處理下植株的生理生化指標變化，利用主成分分析、隸屬函數(shù)法及多元逐步回歸構(gòu)建出凍害綜合評估模型，并篩選出葉綠素a、葉片含水量、脯氨酸、v/m、可溶性蛋白、MDA和SOD為小麥凍害程度的評價指標。進一步利用聚類分析將不同處理的值分為5類：第一類為未受凍（D-CK、W-CK），第二類為輕度受凍（D-T1、W-T1），第三類為中度受凍（D-T2、W-T2、W-T3），第四類為重度受凍（D-T3、W-T4），第五類為特重受凍（D-T4、W-T5、D-T5），其產(chǎn)量損失率分別對應(yīng)為0、＜10%、10%—30%、30%—50%及50%以上。比較而言，弱春性品種的凍害程度重于半冬性品種，灌水處理低于不灌水處理。可見，在小麥易發(fā)生凍害地區(qū)應(yīng)選用半冬性品種，且根據(jù)天氣變化及早灌水，有利于減輕晚霜凍害，并依靠凍害鑒定指標及模型為災(zāi)害評估及管理提供技術(shù)支持。

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Evaluation of low temperature freezing injury in winter wheat and difference analysis of water effect based on multivariate statistical analysis

WANG YangYang1, 2, LIU WanDai1, 2, HE Li1, 2, REN DeChao3, DUAN JianZhao1, 2, HU Xin3, GUO TianCai1, 2, WANG YongHua1, 2, FENG Wei1, 2

1College of Agronomy, Henan Agriculture University/Key Laboratory of Regulating and Controlling Crop Growth and Development, Ministry of Education, Zhengzhou 450046;2National Engineering Research Center for Wheat, Zhengzhou 450046;3Wheat Research Institute, Shangqiu Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Shangqiu 476000, Henan

In order to clarify the freezing injury degree of wheat under different water conditions caused by low temperature stress, the identification indexes and quantitative evaluation model of freezing injury were screened and established, which provided the theoretical support for prevention and control of freezing injury in wheat production.Weak spring cultivars of Yanzhan 4110 and Lankao 198, semi-winter cultivars of Zhengmai 366 and Fengdecunmai 21 were used as experimental materials. They were treated with irrigation (W) or no irrigation (D) one week before the freezing injury, respectively. Pot experiments were moved to a low-temperature simulation room during the female and male ear differentiation stages. The temperatures were set as -2℃ (T1), -4℃ (T2), -6℃ (T3), -8℃ (T4), -10℃ (T5) and control (CK is the field temperature on the same day). Physiological and biochemical indexes of wheat were measured on the second day after low temperature stress. The standardized physiological indexes were analyzed by multivariate statistical analysis, such as principal component, membership function, cluster analysis and step wise regression.There were significant correlations among the individual physiological and biochemical indexes under different cultivars, water contents and temperatures. Through principal component analysis, 19 physiological and biochemical indexes were transformed into 6 mutually independent comprehensive indexes, whose contribution degrees were 55.972%, 11.93%, 7.168%, 5.075%, 4.236% and 3.079%, respectively, representing 87.459% information of all original data. According to the membership function algorithm, the comprehensive evaluation value (value ) of freezing injury degree of each treatment was calculated. Takevalue as the dependent variable, the seven key indexes were selected by stepwise regression analysis, namely chlorophyll a, leaf water content, proline,v/m, soluble protein, MDA and SOD, and the mathematical model for quantitative estimation ofvalue was established. At the same time, the correlation betweenprediction value and yield loss rate was analyzed, and the linear equation determination coefficient2= 0.898, indicating that theprediction model could well evaluate the freezing injury degree.predicted value could be divided into five categories by further cluster analysis: non-freezing (D-CK, W-CK), mild frozen (D-T1, W-T1), moderate frozen (D-T2, W-T2, W-T3), severe frozen (D-T3, W-T4), and extremely severe frozen (D-T4, W-T5, D-T5). Corresponding yield loss rate were 0, 0-10%, 10%-30%, 30%-50% and more than 50%, respectively. Under the same temperature and moisture conditions, the freezing injury degree of weak spring varieties was heavier than that of semi-winter varieties, and the freezing injury degree of no irrigation treatment was heavier than that of irrigation treatment under the same varieties and temperature conditions. With the increasing of low temperature stress, chlorophyll a, leaf water content andv/mshowed a decreasing trend, the activities of proline, soluble protein and SOD increased first and then decreased, while MDA showed an opposite trend. According to the clustering results, under the same temperature and water conditions, the freezing injury degree of weak spring cultivars was more serious than that of semi-winter cultivars. Under the same variety and temperature conditions, the freezing damage degree without irrigation was worse than that under irrigation.Therefore, the semi-winter varieties should be selected in the areas prone to late frost in production, and the irrigation management should be strengthened before a cold wave according to the weather forecast. When freezing injury happened, the injury degree could be accurately assessed in timely through the evaluation index and quantitative model, which was conducive to prevention and control of late frost injury, and provides technology basis for production recovery and decision management after freezing disaster.

winter wheat; frost damage degree; irrigation; comprehensive evaluation; estimation model

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.07.004

2021-06-09；

2021-10-08

“十三五”國家重點研發(fā)計劃“糧食豐產(chǎn)增效科技創(chuàng)新”（2017YFD0300204）

王洋洋，E-mail：wyy65wyy@163.com。通信作者賀利，E-mail：he-li19870308@163.com。通信作者馮偉，E-mail：fengwei78@126.com

（責任編輯 楊鑫浩）