彭富全，黃若干，吳祿祥，韋娜，林海英，藍(lán)曉東

廣西白云山盈康藥業(yè)有限公司，廣西 南寧 530002

0 引言

九味補(bǔ)血口服液是在經(jīng)典名方基礎(chǔ)上創(chuàng)新改進(jìn)組方制成，處方由人參、黃芪、絞股藍(lán)、五味子等藥材組成，具有益氣補(bǔ)血、健脾益胃的功效，對(duì)氣血兩虛之失眠健忘、心悸怔忡、頭暈?zāi)垦?、神疲乏力、短氣自汗、納呆食少等癥具有良好治療效果[1-2]。藥理作用與藥物在體內(nèi)的代謝行為密切相關(guān)，通過體外模擬胃腸道環(huán)境試驗(yàn)，開展九味補(bǔ)血口服液有關(guān)主要成分在胃腸道環(huán)境下的穩(wěn)定性研究，本實(shí)驗(yàn)在前期通過ACQUITY I-CLASS Plus超高效液相色譜-Xevo G2-XS四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（美國(guó)Waters公司）對(duì)九味補(bǔ)血口服液樣品溶液中的主要成分進(jìn)行了定性鑒定的基礎(chǔ)上，選取其中13個(gè)已與對(duì)照品的色譜、質(zhì)譜信息進(jìn)行比對(duì)所確證且相應(yīng)較高的化合物，采用UPLC-MS方法，通過研究九味補(bǔ)血口服液化學(xué)成分在胃腸道環(huán)境下的穩(wěn)定性，為后續(xù)藥理機(jī)制研究奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

SCIEX液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)（美國(guó)Sciex），包括ExionLC AD超高效液相色譜系統(tǒng)，自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱，二元泵和QTRAP Triple Quad5500+質(zhì)譜，Analyst軟件用于數(shù)據(jù)采集和處理。MS105DU型電子天平（瑞士梅特勒）；KQ-250E超聲波清洗器（昆山超聲）；HWS-26電熱恒溫水浴鍋（上海一恒）；H1850臺(tái)式高速離心機(jī)(湖南湘儀)。

1.2 試藥

九味補(bǔ)血口服液（廣西白云山盈康藥業(yè)有限公司，批號(hào)：211222，規(guī)格：10mL/支）；人參皂苷Rb1（批號(hào)：110704-202028）、黃芪甲苷（批號(hào)：110781-202118）、五味子醇甲（批號(hào)：110857-201815）等對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；人參皂苷Rd（批號(hào)：5826）、橙皮苷（批號(hào)：5836）、柚皮苷（批號(hào)：10668）、甘草苷（批號(hào)：9654）、甘草酸銨（批號(hào)：10845）、橘皮素（批號(hào)：10027）、川陳皮素（批號(hào)：6082）、五味子乙素（批號(hào)：8366）、毛蕊異黃酮（批號(hào)：10659）、五味子甲素（批號(hào)：7954）等對(duì)照品均購(gòu)自上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司；胃蛋白酶（豬源，1∶10000，生產(chǎn)批號(hào)：C13195129）、胰蛋白酶（豬胰臟，1∶250，生產(chǎn)批號(hào)：C13147398）均購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司；乙腈、甲酸為色譜純（美國(guó)sigmaaldrich公司），水為超純化水，其余試劑均為分析純。

2 方法

2.1 人工胃液的配制

依照2020年版《中國(guó)藥典》配制人工胃液，取稀鹽酸16.4mL，加水約800mL與胃蛋白酶10g，搖勻后，加水稀釋成1000mL，即得。

2.2 人工腸液的配制

依照2020年版《中國(guó)藥典》配制人工腸液，取磷酸二氫鉀6.8g，加水500mL使溶解，用0.lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.8；另取胰蛋白酶10g，加水適量使溶解，使兩液混合后，加水稀釋至1000mL，即得。

2.3 人工胃液體外溫孵實(shí)驗(yàn)

精密量取九味補(bǔ)血口服液10mL加入預(yù)溫孵 30min（37℃）的90mL人工胃液混合均勻，分別在37℃水浴溫孵2、4h（期間不斷輕微振搖）后精密量取6mL轉(zhuǎn)入10mL量瓶中，加3mL 0.15mol/L氫氧化鈉溶液中和，加水稀釋至刻度，搖勻，于13000r/min離心10min，取上清液，經(jīng)微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液進(jìn)行液質(zhì)分析。

2.4 人工腸液體外溫孵實(shí)驗(yàn)

精密量取九味補(bǔ)血口服液10mL加入預(yù)溫孵 30min（37℃）的90mL人工腸液混合均勻，分別在37℃水浴溫孵0h、2h、4h（期間不斷輕微振搖）后精密量取6mL轉(zhuǎn)入10mL量瓶中，立即加水稀釋至刻度，搖勻，于13000r/min離心10min，取上清液，經(jīng)微孔濾膜過濾，取濾液進(jìn)行液質(zhì)分析。

2.5 UPLC-MS條件

2.5.1 色譜條件

色譜柱為Waters HSS T3（2.1mm×100mm，1.8μm），流動(dòng)相為0.1%甲酸（正離子模式）或水（負(fù)離子模式）（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～5min，2%B；5～30min，2%～80%B；30～35min，80%～95%）；柱溫30℃；流速為0.3mL/min；進(jìn)樣體積為1μL。

2.5.2 質(zhì)譜條件

離子化方式：電噴霧離子化（ESI+或ESI-模式）；多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)(MRM)，全掃描模式（m/z50～1200）；離子噴霧電壓：-4500V或5500V；離子源壓力：15psi；氣簾氣壓力：20psi；干燥氣體和霧化氣體：氮?dú)狻Ｈ藚⒃碥誖b1、人參皂苷Rd、橙皮苷、柚皮苷、甘草苷、甘草酸銨、黃芪甲苷、毛蕊異黃酮、橘皮素、川陳皮素、五味子醇甲、五味子乙素、五味子甲素的檢測(cè)離子對(duì)分別為m/z1107.4→765.5，m/z945.4→621.3，m/z 6 0 9.1 →3 0 1.0，m/z 5 7 9.0 →2 7 1.0，m/z 417.1→2 55.0，m/z 8 21.4 →3 51.1，m/z 8 0 7.4 →6 2 7.3，m/z 2 8 5.0 →2 7 0.0，m/z 3 7 3.0 →3 4 3.1，m/z 4 0 3.1 →3 7 3.1，m/z 4 5 5.1 →4 0 9.2，m/z 4 0 1.1 →3 0 0.0，m/z417.2→316.1。

3 結(jié)果

以人工腸液體外溫孵實(shí)驗(yàn)0h時(shí)供試品溶液測(cè)定的化合物峰面積作為胃腸道穩(wěn)定性考察的Ao，Ai分別為人工胃液、人工腸液溫孵2h、4h和3h、6h后對(duì)應(yīng)化合物峰面積，按以下公式計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)各成分的變化率：

Fi=（|Ai-Ao|/Ao)×100%

結(jié)果表明，藥品中的13種主要成分在人工胃液體外溫孵實(shí)驗(yàn)中有7種發(fā)生了代謝，導(dǎo)致其含有量變化超過30%；而藥品中的13種主要成分在人工腸液體外溫孵實(shí)驗(yàn)中只有1種含量變化超過10%，表明這些化合物在腸液中的穩(wěn)定性良好，結(jié)果見表1、圖1-圖4所示。

圖1 口服液在人工胃液不同溫孵時(shí)間的TIC 圖（正離子模式）(自下而上分別為：胃液0、2、4h)

表1 不同時(shí)間點(diǎn)人工胃液、人工腸液的溫孵穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4 討論

物質(zhì)基礎(chǔ)研究一直是中藥研究的難點(diǎn)，文獻(xiàn)[12]探索運(yùn)用電子鼻檢測(cè)中藥材的藥性，從而解決中藥藥效物質(zhì)難以檢測(cè)、中西藥理論難以相通等難題。本研究是基于UPLC-MS技術(shù)同時(shí)測(cè)定九味補(bǔ)血口服液中多種成分含量，通過研究九味補(bǔ)血口服液代表性化學(xué)成分在胃腸道環(huán)境下的穩(wěn)定性，為后續(xù)進(jìn)一步開展藥理作用機(jī)制研究奠定藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。經(jīng)方法摸索，確定黃芪甲苷、毛蕊異黃酮、橘皮素、川陳皮素、五味子醇甲、五味子乙素、五味子甲素等7種組分選取正離子模式，人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、橙皮苷、柚皮苷、甘草苷、甘草酸銨等6種組分選取負(fù)離子模式。

結(jié)果顯示，人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd含量在人工胃液中下降最顯著，可能與人參皂苷在較強(qiáng)的酸性條件下水解產(chǎn)生次級(jí)苷及苷元有關(guān)[13]；五味子木脂素類組分具有很強(qiáng)的抗自由基活性，其主要代表成分為五味子醇甲、五味子乙素，并且五味子乙素的抗自由基作用最強(qiáng)[14]，但五味子醇甲與五味子乙素、五味子甲素在人工胃液和人工腸液中的穩(wěn)定性相反，表明胃蛋白酶的存在可能使五味子乙素、五味子甲素產(chǎn)生較強(qiáng)的降解，而胰蛋白酶的存在則可能使五味子醇甲產(chǎn)生一定的降解；文獻(xiàn)[15]報(bào)道川陳皮素和橘皮素的質(zhì)量濃度和pH值對(duì)吸收情況無(wú)顯著影響，文獻(xiàn)[16]報(bào)道川陳皮素在大鼠體內(nèi)產(chǎn)生較多的代謝物，推測(cè)胃蛋白酶的存在可能對(duì)這2種成分產(chǎn)生較強(qiáng)的降解作用；甘草總黃酮被發(fā)現(xiàn)不僅能降低胃蛋白酶活性和胃液分泌量，還可促進(jìn)胃黏液分泌，從而表現(xiàn)出顯著的抗?jié)兯幚砘钚訹17]，甘草酸銨的影響因素試驗(yàn)結(jié)果顯示，高溫、高濕、氧化破壞的情況下均不夠穩(wěn)定[18-19]，說明甘草酸銨可能并非基于酸與胃蛋白酶作用，而主要是在人工胃液中逐步被氧化所致。中藥的代謝研究目前大多基于單體化合物，雖然可以簡(jiǎn)單快速地闡述其在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物和途徑，但不能真實(shí)反映中藥復(fù)方制劑在多成分下的代謝情況。本研究利用UPLCMS建立了同時(shí)測(cè)定九味補(bǔ)血口服液13種成分的檢測(cè)方法，并應(yīng)用于本品在模擬胃腸道上的穩(wěn)定性研究，為后續(xù)進(jìn)一步的藥理作用研究提供有力支持。

圖2 口服液在人工胃液不同溫孵時(shí)間的TIC 圖（負(fù)離子模式）（自下而上分別為：胃液0、2、4h）

圖3 口服液在人工腸液不同溫孵時(shí)間的TIC 圖（正離子模式）（自下而上分別為：腸液0、3、6h）

圖4 口服液在人工腸液不同溫孵時(shí)間的TIC 圖（負(fù)離子模式）(自下而上分別為：腸液0、3、6h）

由于口服藥物的吸收主要在小腸上皮細(xì)胞進(jìn)行，胃腸道的酸堿物理環(huán)境及消化酶作用可能直接影響藥物的穩(wěn)定性，從而間接對(duì)藥物的吸收產(chǎn)生較大影響。本研究模擬藥品在胃腸道上的消化與吸收過程，發(fā)現(xiàn)一些組分在人工胃液中存在較大程度的降解或轉(zhuǎn)化，因而本研究對(duì)本品的臨床應(yīng)用也有一定的指導(dǎo)意義。因人體實(shí)際消化過程還存在大量微生物的參與，故還需結(jié)合其他研究方法，以更全面地闡明藥物的體內(nèi)代謝過程。