魯程成 趙一凡 范純新 王 建

(1. 上海海洋大學(xué)國(guó)家海洋生物科學(xué)國(guó)際聯(lián)合研究中心, 上海 201306; 2. 上海海洋大學(xué)國(guó)際海洋研究中心海洋生物系統(tǒng)與神經(jīng)科學(xué)研究所, 上海 201306; 3. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 201306)

肌肉是魚類最主要的結(jié)構(gòu)和功能組織之一, 且經(jīng)濟(jì)魚類的肌肉相關(guān)性狀很大程度影響著其品質(zhì)與產(chǎn)量。因此魚類肌肉形成和生長(zhǎng)性狀相關(guān)因素一直是水生生物學(xué)和水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題。肌肉重要組成蛋白如肌球蛋白重鏈Myh (Myosin heavy chain)家族、Melusin等編碼基因的表達(dá)及其調(diào)控,在肌肉組織形成及功能維持中起到關(guān)鍵作用[1,2]。

基因組非編碼區(qū)存在大量順式調(diào)控元件(Cisregulatory element), 是調(diào)控基因表達(dá)的重要遺傳因素, 如增強(qiáng)子(Enhancer)可以增強(qiáng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平。增強(qiáng)子常帶有細(xì)胞及組織特異性[3,4], 同一基因也可受不同增強(qiáng)子調(diào)控在不同細(xì)胞中表達(dá)[3]。調(diào)控元件與生物體許多重要表型相關(guān)[4—6], 如調(diào)控元件的變異可導(dǎo)致動(dòng)物外耳及骨骼發(fā)育異常[7]。肌肉組織特異性調(diào)控元件可以作為特定轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)在肌肉形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用[8]。如在肌肉發(fā)育過程中, 許多肌肉特異性基因的調(diào)控區(qū)可以與Myod (Myogenic differentiation 1)、Myf5 (Myogenic factor 5)等生肌調(diào)節(jié)因子(Myogenic regulatory factors, MRFs)家族蛋白結(jié)合而調(diào)控下游基因表達(dá)[9]。這種調(diào)控機(jī)制也可誘導(dǎo)成熟細(xì)胞類型變化, 如Myod可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞等多種細(xì)胞向成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化, 且轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞中大量表達(dá)Myh等肌肉重要組成蛋白[10]。可見, 研究肌肉特異性調(diào)控元件有助于解釋肌肉形成的遺傳基礎(chǔ)。

表達(dá)模式相同的基因可能受同類轉(zhuǎn)錄因子及其對(duì)應(yīng)順式元件的轉(zhuǎn)錄調(diào)控, 因此同一組織表達(dá)的多個(gè)基因的順式調(diào)控元件之間可能存在相同或相似的序列特征。許多肌肉表達(dá)基因的調(diào)控區(qū)存在E-box (CANNTG)DNA基序(Motifs), 與MRFs家族蛋白的堿性螺旋-環(huán)-螺旋(Basic helix-loop-helix,bHLH)結(jié)構(gòu)域具有很高的親和力[11]。另外, 小鼠、線蟲等物種的幾種組織特異表達(dá)基因的調(diào)控區(qū)也發(fā)現(xiàn)了相同的DNA基序[12,13]。此外, 部分順式調(diào)控元件的DNA序列具有物種間保守性, 有時(shí)甚至高于編碼區(qū)序列[14,15]?？梢? 分析肌肉表達(dá)基因調(diào)控區(qū)序列的保守性特征可以預(yù)測(cè)調(diào)控元件的存在。

本文通過分析兩組斑馬魚不同組織的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù), 篩選出在肌肉中高表達(dá)的基因, 并根據(jù)序列保守特征預(yù)測(cè)這些基因上游的調(diào)控元件。結(jié)果在5個(gè)肌肉高表達(dá)基因的近端獲得了序列特征相似DNA區(qū)域。進(jìn)一步利用斑馬魚體內(nèi)熒光報(bào)告基因表達(dá)檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)其中一段序列進(jìn)行檢測(cè), 發(fā)現(xiàn)其具有增強(qiáng)報(bào)告基因在肌肉組織中表達(dá)的能力, 其中可能包含一類肌肉組織特異型增強(qiáng)子。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與胚胎

本實(shí)驗(yàn)所用野生型AB斑馬魚與TU斑馬魚均購自國(guó)家斑馬魚中心。TB斑馬魚由野生型AB與TU品系雜交獲得。所有實(shí)驗(yàn)用魚均飼養(yǎng)于14h﹕10h光暗周期環(huán)境中, 養(yǎng)殖水溫為26—28℃, 每天早晚各喂食一次鹵蟲。

本實(shí)驗(yàn)所用胚胎由2對(duì)5月齡TB成魚內(nèi)交獲得。胚胎飼養(yǎng)于Blue water(0.06 g紅海鹽、0.01 mg/L亞甲基藍(lán)) 中, 于28.5℃進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2 斑馬魚肌肉高表達(dá)基因篩選

通過NCBI的SRA數(shù)據(jù)庫下載得到兩組包含成體野生斑馬魚肌肉及其他組織的RNA-seq數(shù)據(jù)(PRJNA255848[16]和PRJNA263496[17])。使用fastqdump轉(zhuǎn)化得到fastq文件, 并使用Trimmomatic[18]進(jìn)行質(zhì)控, 去除序列5′端14 bp, 其他保持默認(rèn)參數(shù)。通過Ensembl數(shù)據(jù)庫(release-94)下載獲得斑馬魚基因組參考序列文件(Danio_rerio.GRCz11.dna_sm.primary_assembly.fa.gz)及注釋文件(Danio_rerio.GRCz11.94.gtf)。使用HISAT2[19]將質(zhì)控后的fastq文件對(duì)比到基因組, 并使用StringTie[20]進(jìn)行基因表達(dá)量計(jì)數(shù)。使用edgeR[21]進(jìn)行組織間基因表達(dá)差異分析, 篩選肌肉相對(duì)其他6個(gè)組織(腦、鰓、心、肝、腎和腸)高表達(dá)(log2FC>=2)的基因并取交集。兩組RNA-seq分析結(jié)果取交集得到肌肉高表達(dá)基因。使用相同方法, 以log2FC<=–2為標(biāo)準(zhǔn)篩選肌肉低表達(dá)基因。通過http://geneontology.org/[22]對(duì)候選基因進(jìn)行GO功能富集, 富集結(jié)果使用ggplot2[23]進(jìn)行繪圖展示。

1.3 肌肉高表達(dá)基因近端保守DNA元件預(yù)測(cè)

根據(jù)基因組注釋文件, 獲得肌肉高表達(dá)及低表達(dá)基因的近端調(diào)控區(qū)(基因起始位點(diǎn)上游5000 bp及下游1000 bp)在基因組中的位置信息。使用bedtools getfasta工具從基因組參考序列文件中提取目標(biāo)區(qū)域的DNA序列。根據(jù)ANCORA[24](http://ancora.genereg.net/)數(shù)據(jù)庫, 以90pc_50col為標(biāo)準(zhǔn), 在上述斑馬魚肌肉高表達(dá)基因的近端調(diào)控區(qū)查找跨物種保守元件(HCNE, Highly conserved noncoding elements), 進(jìn)一步獲得物種間調(diào)控區(qū)保守的肌肉高表達(dá)基因。

使用MEME[25]工具(http://meme-suite.org/tools/meme)中的Discriminative mode算法, 以種間保守肌肉高表達(dá)基因的近端調(diào)控區(qū)DNA為基本序列(Primary sequences), 以肌肉低表達(dá)基因?qū)?yīng)區(qū)域DNA作為對(duì)照序列(Control sequences), 預(yù)測(cè)肌肉高表達(dá)基因間的近端保守DNA基序。使用MAFFT(https://www.ebi.ac.uk/ Tools/msa/mafft/)進(jìn)行DNA多序列比對(duì)及序列相似度計(jì)算。使用Tomtom[26]工具(http://meme-suite.org/tools/tomtom), 以JASPAR CORE(2018) vertebrates[27]數(shù)據(jù)庫為參考, 預(yù)測(cè)DNA基序中的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。

1.4 熒光定量PCR(qPCR)驗(yàn)證目標(biāo)基因表達(dá)情況

取TB斑馬魚成魚雌雄各5尾, 解剖獲得肌肉、腦、心、肝、腎和腸6種組織, 參照TRIzol(ThermoFisher, 15596026)說明書的步驟提取各組織的總RNA。參照HiScript Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit (諾唯贊, R312-01)試劑盒步驟將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以elfa為內(nèi)參對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行qPCR相對(duì)定量檢測(cè), 每個(gè)基因每個(gè)組織樣品進(jìn)行3次重復(fù), 引物信息見表 1。qPCR反應(yīng)按照 ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(諾唯贊, Q711-02)說明進(jìn)行,反應(yīng)體系為20 μL, 反應(yīng)條件為: 95℃, 10s; 60℃,30s; 40個(gè)循環(huán)。結(jié)果使用R以2–??Ct進(jìn)行繪圖展示和統(tǒng)計(jì)分析, 用方差分析加Tukey HSD多重比較檢驗(yàn)基因在各組織間的表達(dá)差異。

1.5 熒光蛋白表達(dá)報(bào)告質(zhì)粒構(gòu)建

帶有Tol2和EGFP的質(zhì)粒由上海海洋大學(xué)劉志偉實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng), 使用無縫克隆技術(shù)參照pTol2-GT2MP-EGFP質(zhì)粒[28]的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造, 并在Tol2內(nèi)部插入人源β-globin絕緣子序列(HBB-5′HS5和HBB-3′HS1)[29], 在Gata2啟動(dòng)子上游插入候選調(diào)控元件。具體步驟: 使用1%的間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽(Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate,MS222, sigma, E10521-10G)麻醉TU斑馬魚后取尾鰭, 用DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN,69504)提取斑馬魚基因組DNA。使用高保真酶Phanta (諾唯贊, P515-01), Gata2-F/R引物(表 1)以基因組DNA為模板擴(kuò)增得到Gata2啟動(dòng)子, Vectorgata-F/R(表 1)引物擴(kuò)增質(zhì)粒骨架, 并使兩者間存在15—20 bp的重疊區(qū)。用DpnⅠ(NEB, #R0176V)消化去除PCR產(chǎn)物中的質(zhì)粒模板, 然后利用單片段快速克隆試劑盒(ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit, 諾唯贊)連接以上2個(gè)片段。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌, 37℃培養(yǎng)12h, 使用高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒(天根, DP107-02)提取質(zhì)粒pTol2-GT2MPEGFP。以此質(zhì)粒為模板, 進(jìn)一步利用含有人源βglobin絕緣子序列的引物Insulator-F/R和Vector-HSF/R (表 1), 分別擴(kuò)增GT2MP-EGFP和Tol2質(zhì)粒骨架兩DNA片段, 兩片段利用單片段快速克隆試劑盒連接, 產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后提質(zhì)粒, 經(jīng)測(cè)序鑒定得到pTol2-HSGT2MP-EGFP質(zhì)粒作為空白對(duì)照(Empty vector control, EVC), EVC質(zhì)粒序列上傳至NCBI(MW 698954)。

表1 引物信息表Tab. 1 PCR Primers

以基因組DNA為模板, 用引物dr334F/R(表 1)擴(kuò)增出候選調(diào)控區(qū)dr334。同時(shí)通過含部分dr334序列的引物vector-HS-F/R (表 1), 利用反向PCR擴(kuò)增出pTol2-HS-GT2MP-EGFP質(zhì)粒骨架。用單片段快速克隆試劑盒將dr334插入pTol2-HS-GT2MPEGFP質(zhì)粒的HBB-5′HS5絕緣子和GT2MP之間, 得到質(zhì)粒pTol2-dr334:GT2MP-EGFP (簡(jiǎn)稱dr334)。

1.6 顯微注射、計(jì)數(shù)及統(tǒng)計(jì)分析

收集TB斑馬魚內(nèi)交產(chǎn)生的胚胎, 向1-細(xì)胞階段的胚胎中注射dr344質(zhì)粒和Tol2轉(zhuǎn)座酶mRNA混合物, 同時(shí)以EVC質(zhì)粒作為對(duì)照。每顆胚胎中約注射2 nL的混合物, 其中質(zhì)粒約為50 pg, 轉(zhuǎn)座酶mRNA約為100 pg。注射后的胚胎置于Blue water中于28.5℃進(jìn)行培養(yǎng)。分別于12 hours post fertilization(hpf)、24 hpf、36 hpf和48 hpf對(duì)注射胚胎的熒光進(jìn)行觀察和拍照。首先用1% MS222對(duì)胚胎進(jìn)行麻醉, 再用1%的甲基纖維素(Sigma, M0387-100G)固定胚胎后置于玻底培養(yǎng)皿, 在熒光顯微鏡(Axio Observer Z1, Zeiss)下進(jìn)行拍照。最后, 對(duì)具有不同熒光模式組胚胎數(shù)目使用R函數(shù)fisher.test( )進(jìn)行Fisher精確檢驗(yàn)(Fisher’s exact test), 計(jì)算獲得對(duì)應(yīng)P值及優(yōu)勢(shì)比(Odds ratio, OR)。

2 結(jié)果

2.1 成年斑馬魚肌肉高表達(dá)候選基因篩選

經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)PRJNA255848和PRJNA263496兩項(xiàng)研究中均包含斑馬魚肌肉、腦、心、肝、腎和腸的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)。利用該兩項(xiàng)研究的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),分別進(jìn)行上述組織間基因表達(dá)差異分析, 篩選得到肌肉相對(duì)其他組織高表達(dá)(log2FC>=2)的基因。在各組織比較結(jié)果取交集后, 在PRJNA255848數(shù)據(jù)中得到247個(gè)基因, 其在肌肉中表達(dá)量均高于其他5個(gè)組織; 在PRJNA263496中得到370個(gè)肌肉高表達(dá)基因。進(jìn)一步對(duì)兩組肌肉高表達(dá)基因取交集, 獲得183個(gè)肌肉高表達(dá)的基因用于后續(xù)研究(圖 1A)。為確定這些肌肉高表達(dá)基因參與的主要功能, 我們通過基因本體(GO)富集分析, 發(fā)現(xiàn)其中157個(gè)基因(85.8%)獲得GO注釋結(jié)果, 富集GO集中在骨骼肌細(xì)胞增殖調(diào)節(jié),骨骼肌收縮調(diào)節(jié), 骨骼肌肌球蛋白粗絲組裝, 骨骼肌纖維發(fā)育, 鈣離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)等(圖 1B)。用類似方法,我們篩選到了234個(gè)肌肉低表達(dá)對(duì)照基因。

圖1 轉(zhuǎn)錄組分析篩選肌肉高表達(dá)基因(A)和肌肉高表達(dá)基因GO 生物過程富集結(jié)果(B)Fig. 1 Screening for genes that are highly expressed in muscle (A) and GO biological process enrichment of the high-expression gene of muscle (B)

2.2 多個(gè)肌肉高表達(dá)基因上游存在序列相似的DNA基序簇

我們通過Ancora數(shù)據(jù)庫查找了上述斑馬魚肌肉高表達(dá)基因近端調(diào)控區(qū)中的跨物種保守元件(HCNE), 發(fā)現(xiàn)24個(gè)基因的調(diào)控區(qū)中存在跨物種非編碼保守元件(表 2), 提示這些基因可能存在種間保守的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。通過查找zfin(http://zfin.org/)表達(dá)數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn), 除個(gè)別基因數(shù)據(jù)缺失外, 絕大多數(shù)基因都在48hpf在肌肉中有表達(dá)。為探討是否存在基因間保守的表達(dá)調(diào)控, 我們以該24個(gè)近端調(diào)控區(qū)序列為查找目標(biāo), 以234個(gè)肌肉低表達(dá)基因的近端調(diào)控區(qū)序列作為對(duì)照, 使用MEME的Discriminative mode算法進(jìn)行比較, 在5個(gè)基因[itgbl1,obsl1b,zgc:9242,myh6(Ensembl 103版中被注釋為myh7l),mylk4a]的上游均發(fā)現(xiàn)了一段序列相似的保守DNA片段。片段內(nèi)部均包含成簇排列且順序一致的6個(gè)DNA基序(圖 2), 片段長(zhǎng)度為292—347 bp(表 3)。多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)5個(gè)DNA片段兩兩之間的序列相似度為78.62%—84.19%。這些DNA片段在肌肉高表達(dá)基因間的序列保守性(圖 2A), 提示其可能在調(diào)控基因組織特性表達(dá)中具有一定功能。根據(jù)片段區(qū)域信息(表 3)在Ancora網(wǎng)站查詢, 我們發(fā)現(xiàn)這些區(qū)域與Ancora中保守元件不重合(結(jié)果未展示), 提示其功能可能具有物種特異性。熒光定量PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn), 這5個(gè)基因在斑馬魚成魚肌肉中的表達(dá)量均明顯高于其他5個(gè)組織(圖 2B), 進(jìn)一步驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄組分析的結(jié)果。這些發(fā)現(xiàn)提示上述5個(gè)DNA片段可能對(duì)調(diào)控這些基因在肌肉中高表達(dá)起到作用。

表3 基因近端保守區(qū)序列信息Tab. 3 The sequence information of proximal conserved element for 5 genes

圖2 肌肉高表達(dá)基因及其近端保守DNA片段Fig. 2 Muscle highly expressed genes and proximal conserved DNA sequencesA. 5個(gè)基因近端的順序相同的DNA基序簇, 不同線條填充的矩形代表不同種基序; B. 5個(gè)基因在不同組織的qPCR相對(duì)定量結(jié)果, Y軸為各組織相對(duì)肌肉的表達(dá)量變化(2–??Ct), 誤差線為標(biāo)準(zhǔn)誤; 不同字母表示差異顯著A. DNA motif clusters with same orders for five genes. The rectangles with different line patterns represent the different motifs; B. The relative expression of 5 genes in different tissues. Y axes are relative expression to muscle (2–??Ct). Error bars are standard errors of mean.Different letters indicate significant differences

表2 Ancora數(shù)據(jù)庫中具有基因近端跨物種保守元件的斑馬魚肌肉高表達(dá)基因Tab. 2 Muscle highly expressed genes with proximal CNEs in Ancora database

2.3 目標(biāo)DNA片段顯示增強(qiáng)基因肌肉特異性表達(dá)功能

為了驗(yàn)證上述DNA基序簇的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能, 我們選取了在肌肉中表達(dá)豐富的zgc:92429 基因[30]上游的DNA基序簇區(qū)域作為研究對(duì)象。我們克隆得到了該基因上游區(qū)域334 bp的DNA片段, 經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證, 該片段序列與斑馬魚GRCz11版本基因組對(duì)應(yīng)區(qū)域序列一致。將其插入在pTol2-GT2MP-EGFP的Gata2 最小啟動(dòng)子的上游, 構(gòu)建了熒光蛋白表達(dá)報(bào)告質(zhì)粒, 該質(zhì)粒命名為pTol2-dr334:GT2MPEGFP(圖 3A, 簡(jiǎn)稱dr334)。我們同時(shí)構(gòu)建了不含克隆片段的載體pTol2-HS-GT2MP-EGFP作為對(duì)照(EVC)。分別將兩種質(zhì)粒注射到同批次的TB斑馬魚1細(xì)胞期胚胎中, 并在12hpf、24hpf、36hpf和48hpf四個(gè)發(fā)育時(shí)期通過熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。發(fā)現(xiàn)在各時(shí)期, 均有不同比例的胚胎顯示出肌肉組織特異熒光信號(hào)(圖 3B)。另外, 根據(jù)魚體內(nèi)熒光信號(hào)情況, 各時(shí)期的胚胎均可分為3類: (1) 沒有熒光信號(hào)(N); (2) 有熒光信號(hào)但非肌肉組織特異性表達(dá)(NSF); (3) 熒光信號(hào)有明顯的肌肉組織特異性(MF)(圖 3C)。對(duì)各時(shí)期三類胚胎進(jìn)行計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì) (表 4和圖 3D), 發(fā)現(xiàn)在四個(gè)時(shí)期, 注射dr334的胚胎可觀察到的熒光個(gè)體(NSF+MF)相對(duì)無熒光個(gè)體(N)的比例均高于對(duì)照組(Odds ratio范圍: 1.643—3.881), 且在24hpf(P=0.006)和48hpf(P<0.001)具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。另外, dr334組胚胎的肌肉特異信號(hào)個(gè)體(MF)相對(duì)非肌肉特異信號(hào)個(gè)體(N+NSF)的比例均高于對(duì)照組(Odds ratio范圍: 1.311—6.487), 且在發(fā)育后期更加明顯, 48hpf時(shí)具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)。這說明該長(zhǎng)度為334 bp的DNA片段不僅具有增強(qiáng)報(bào)告基因表達(dá)的作用, 且其增強(qiáng)作用帶有肌肉組織特異性。

表4 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的熒光觀察結(jié)果計(jì)數(shù)分析Tab. 4 Embryo counts upon fluorescence levels and proportion test between empty vector control and dr334 vector

圖3 熒光報(bào)告載體結(jié)構(gòu)及注射后胚胎熒光信號(hào)Fig. 3 Structure of eGFP expression reporter plasmids and fluorescence signals in zebrafish embryosA. dr334質(zhì)粒(上)及對(duì)照質(zhì)粒(下)功能區(qū)的結(jié)構(gòu); B. 3個(gè)發(fā)育時(shí)期顯示肌肉特異性熒光信號(hào)的胚胎, 標(biāo)尺=1 mm; C. 4個(gè)發(fā)育時(shí)期3種熒光信號(hào)類型胚胎的局部圖, 標(biāo)尺=1 mm; N代表沒有熒光信號(hào), NSF代表有非肌肉特異性信號(hào), MF代表有肌肉特異性熒光信號(hào); D. 4個(gè)發(fā)育時(shí)期3種熒光信號(hào)類型胚胎的比例; EVC表示注射空載體質(zhì)粒的胚胎; dr344表示注射dr344質(zhì)粒的胚胎A. Structure of functional region for dr334 plasmid (up) and control (bottom) plasmids; B. Embryos with muscle specific fluorescent signal in three developmental stages, Scale bar = 1 mm; C. Embryos with three types of fluorescent signals for four developmental stages; N is no fluorescence signal, NSF is non-specific fluorescence, and MF is muscle specific fluorescence. Scale bar = 1 mm. D. Embryo counts proportions upon fluorescence types or four developmental stages. EVC represents empty vector control plasmids were injected in to embryos; dr344 represents dr344 plasmids were injected

2.4 DNA基序簇內(nèi)存在肌肉形成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)

我們發(fā)現(xiàn)的DNA基序簇片段, 在多個(gè)肌肉高表達(dá)基因間序列保守, 且在體內(nèi)顯示增強(qiáng)基因在肌肉中表達(dá)的功能, 提示可能存在同類的轉(zhuǎn)錄因子與該區(qū)域結(jié)合調(diào)控這些基因在肌肉中高表達(dá)。我們通過Tomtom(http://meme-suite.org/tools/tomtom)對(duì)目標(biāo)DNA基序進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)。結(jié)果在motif 2、motif 3和motif 4中分別發(fā)現(xiàn)了 Xbp1(Xbox binding protein 1)[31]和twist2(twist family bHLH transcription factor 2)[32]、bhlha15(basic helix-loophelix family, member a15)[33]、myod1(myogenic differentiation 1)[34]、twist1(twist family bHLH transcription factor 1)[35]等多個(gè)肌肉形成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)(圖 4), 預(yù)測(cè)P值分別為1.34e-02、2.16e-03、1.71e-03、1.09e-02和1.64e-02, 提示該區(qū)域可能作為這些轉(zhuǎn)錄因子的靶點(diǎn), 參與基因表達(dá)調(diào)控。

圖4 Tomtom預(yù)測(cè)得到的DNA基序簇中肌肉相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)Fig. 4 Muscle-related transcription factor binding sites in motif clusters predicted by Tomtom

3 討論

3.1 斑馬魚肌肉高表達(dá)基因的非編碼元件

魚類肌肉形成及相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控是水生生物學(xué)和水產(chǎn)科學(xué)研究中的熱點(diǎn)問題。組織特異性DNA順式調(diào)控元件可以作為特定轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn), 調(diào)控基因在特定組織表達(dá)[7]。為研究可調(diào)控基因在肌肉中表達(dá)的DNA功能元件, 我們通過分析公共數(shù)據(jù)庫中的轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù), 在5個(gè)肌肉高表達(dá)基因的近端均發(fā)現(xiàn)了一段保守的DNA區(qū)域, 猜測(cè)其可能作為功能元件參與基因在肌肉中表達(dá)的調(diào)控。我們進(jìn)一步克隆獲得了zgc:92429對(duì)應(yīng)區(qū)段的DNA片段, 并將其連接到eGFP熒光報(bào)告基因上游, 使用tol2轉(zhuǎn)座系統(tǒng)將克隆DNA片段轉(zhuǎn)入斑馬魚胚胎基因組。通過觀察eGFP在體內(nèi)表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組胚胎在發(fā)育后期大比例顯示出肌肉組織特異性熒光信號(hào), 說明該DNA片段可能作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件增強(qiáng)基因肌肉特異性表達(dá)。

我們觀察到注射了實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組質(zhì)粒的胚胎均可能會(huì)表現(xiàn)為3種情況: (1)沒有熒光信號(hào);(2)非特異性熒光信號(hào); (3)肌肉組織特異熒光信號(hào)。報(bào)告基因表達(dá)除受我們關(guān)注的DNA元件影響外, 還可能會(huì)受到其他因素的影響。一方面, 注射和轉(zhuǎn)座實(shí)驗(yàn)存在一定系統(tǒng)誤差, 部分胚胎未將eGFP基因連同調(diào)控元件整合到基因組中, 造成沒有熒光蛋白生成或者隨機(jī)瞬時(shí)生成部分熒光蛋白;另一方面, eGFP基因插入到基因組其他增強(qiáng)元件附近的時(shí)候也可能被激活表達(dá), 載體設(shè)計(jì)中加入的絕緣子可能未完全阻斷其他功能元件的影響。因此各組胚胎的熒光信號(hào)表達(dá)模式均存在一定隨機(jī)性。經(jīng)對(duì)大量胚胎計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)分析后發(fā)現(xiàn), 實(shí)驗(yàn)組中肌肉組織特異性熒光信號(hào)的比例顯著高于對(duì)照組,說明目標(biāo)區(qū)域的DNA片段具有增強(qiáng)報(bào)告基因在肌肉中表達(dá)的作用。如對(duì)該系統(tǒng)進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化, 其有望作為基因工程的工具, 高效引導(dǎo)基因在肌肉中特異表達(dá)。

另外, 我們發(fā)現(xiàn)的DNA基序簇所在基因組區(qū)域(表 3), 并未與Ancora數(shù)據(jù)庫中跨物種保守元件重合, 提示其轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能可能具有物種特異性。另一方面也說明, 對(duì)基因間序列保守性分析進(jìn)行非編碼調(diào)控元件預(yù)測(cè), 可以作為跨物種序列保守分析的補(bǔ)充, 對(duì)基因組非編碼區(qū)進(jìn)行功能注釋。

3.2 多個(gè)肌肉高表達(dá)基因可能協(xié)同作用參與肌肉結(jié)構(gòu)組成

本文發(fā)現(xiàn)5個(gè)基因上游存在相似的DNA序列,這些基因均在肌肉的結(jié)構(gòu)和功能中起到重要作用。zgc:92429在斑馬魚肌肉中高度表達(dá)[36], 在人類、小鼠等物種的同源基因?yàn)镮tgb1bp2。該基因在小鼠骨骼肌和心肌中高表達(dá)且作為一種肌肉特異性信號(hào)蛋白[37]。該基因產(chǎn)物通過與一種細(xì)胞膜膜受體整合素1(itgbl1)的胞質(zhì)內(nèi)區(qū)域結(jié)合, 調(diào)節(jié)肌肉的生長(zhǎng)、收縮和修復(fù)[38]。同時(shí), 我們?cè)趇tgbl1上游也發(fā)現(xiàn)了同樣排列順序的DNA基序簇, 提示以上2個(gè)基因的表達(dá)受到同類信號(hào)的調(diào)控, 有助于其協(xié)同作用。在斑馬魚中, Obsl1b(Obscurin like cytoskeletal adaptor 1b)大量存在于肌節(jié)中參與細(xì)胞基質(zhì)、細(xì)胞和胞內(nèi)細(xì)胞骨架連接的穩(wěn)定[39]。肌球蛋白重鏈6(Myh6)構(gòu)成Ⅱ型肌球蛋白的一部分, Ⅱ型肌球蛋白在肌節(jié)中為肌肉收縮提供所需的機(jī)械力[40,41]。需要注意的是, 在多數(shù)文獻(xiàn)的報(bào)道中myh6在胚胎時(shí)期的心肌中表達(dá)豐富[42], 由于在較新版本的ensembl數(shù)據(jù)庫中也將該基因注釋為myh7l, 經(jīng)過調(diào)查發(fā)現(xiàn)myh7基因在成年時(shí)也會(huì)在骨骼肌中表達(dá)[43,44], 這也部分驗(yàn)證了我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 我們推測(cè)該基因可能在不同時(shí)期有不同的表達(dá)模式。mylk4基因作為MYLK家族的一員, 在肌肉發(fā)育中起重要作用[45], 該基因會(huì)在心力衰竭中下調(diào)并可能引起肌絲的磷酸化的下降, 從而影響心肌細(xì)胞的骨架結(jié)構(gòu)[46]。此外, 以上5個(gè)基因均在人或小鼠中參與肌節(jié)的構(gòu)成[41—43,49,50],說明這些基因可能在斑馬魚肌肉中協(xié)同作用維持肌肉的正常形態(tài)和功能, 其表達(dá)可能具有相近的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。

3.3 調(diào)控元件可能與Myod為中心的多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子組成的復(fù)合物相結(jié)合

上述5個(gè)基因的上游發(fā)現(xiàn)了相同的DNA基序簇, 提示可能存在同類的轉(zhuǎn)錄因子通過與這些候選區(qū)域結(jié)合, 調(diào)控這些基因的表達(dá)。通過Tomtom(http://meme-suite.org/tools/tomtom)預(yù)測(cè)候選區(qū)域DNA基序的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn), 發(fā)現(xiàn)該區(qū)域可能存在Myod1、Xbp1、Bhlha15、Twist1和Twist2等多個(gè)肌肉形成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn), 提示該區(qū)域可能作為這些轉(zhuǎn)錄因子的靶點(diǎn), 參與基因表達(dá)調(diào)控。Myod作為MRF的成員之一在特異肌基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起到總開關(guān)作用, 推動(dòng)肌源性細(xì)胞譜系的形成[49], 且可誘導(dǎo)非肌肉細(xì)胞(如成纖維細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞等)向成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化[8]。有研究發(fā)現(xiàn)在C2C12細(xì)胞中,xbp1被敲降后Myod等生肌調(diào)節(jié)因子的表達(dá)下調(diào), 并且細(xì)胞向成肌細(xì)胞的分化受到抑制, 猜測(cè)Xbp1可能通過誘導(dǎo)Cdk5來調(diào)控myod家族基因參與成肌細(xì)胞早期分化[50]。bhlha15是一種myod的負(fù)調(diào)控因子, 該基因通過與Myod形成異二聚體或者與自身形成二聚體來占據(jù)E-box區(qū)域, 從而使得胚胎時(shí)期的肌肉分化增殖保持動(dòng)態(tài)平衡[33]。Twist同樣屬于bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族[51], 小鼠Twist可以與Myod結(jié)合抑制后者的作用[52]且表達(dá)twist2的肌源性干細(xì)胞被報(bào)道作為一種新的干細(xì)胞類型參與了肌肉的生長(zhǎng)和再生[53]。結(jié)合上述研究,我們發(fā)現(xiàn)的候選轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件可能通過與Myod為中心的多種轉(zhuǎn)錄因子組成的調(diào)控復(fù)合體結(jié)合, 調(diào)控基因在早期發(fā)育的肌肉細(xì)胞中定向表達(dá)。但基于目前的分析, 我們尚不清楚除上述候選轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)外, 該保守DNA區(qū)段的是否還存在其他重要的功能區(qū), 也不了解這些候選結(jié)合位點(diǎn)是否同時(shí)發(fā)揮作用。此外, 也不排除該元件部分區(qū)域具有啟動(dòng)子活性。研究該片段的具體轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制, 還需要更多信息學(xué)分析以及更多實(shí)驗(yàn)證據(jù), 如堿基突變功能驗(yàn)證、DNA與蛋白作用檢測(cè)、啟動(dòng)子活性檢測(cè)等實(shí)驗(yàn), 進(jìn)行深入探討。

綜上所述, 本研究通過生信分析在多個(gè)斑馬魚肌肉高表達(dá)基因上游發(fā)現(xiàn)一段序列保守的DNA區(qū)域, 體內(nèi)熒光報(bào)告基因表達(dá)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該DNA片段可能是一段肌肉組織特異的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件, 可能通過與Myod為中心的多種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合調(diào)控基因表達(dá)。該發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研究肌肉形成相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。該片段也有望作為基因工程的工具, 引導(dǎo)基因在肌肉中特異表達(dá)。