馬 雪，李璐迪，王 裕，邢云昆，付娟玲，姚碧云，趙 鵬

（1.北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院毒理學(xué)系，食品安全毒理學(xué)研究與評價北京市重點實驗室，北京 100191；2.中國疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與健康相關(guān)產(chǎn)品安全所，北京 100021）

苯并[a]芘（benzo[a]pyrene，BaP）屬于多環(huán)芳烴類化合物，可經(jīng)Ⅰ相和Ⅱ相代謝酶代謝活化后發(fā)揮毒作用，與癌癥如肺癌、膀胱癌、食管癌和皮膚癌等發(fā)生有關(guān)[1]。實驗研究也證實，BaP可誘發(fā)實驗動物腫瘤以及體外培養(yǎng)細胞的惡性轉(zhuǎn)化[2-3]。因暴露因素明確，體外細胞惡性轉(zhuǎn)化已成為研究化學(xué)致癌機制的重要方法。國內(nèi)外學(xué)者利用BaP終致癌物（+）-反式-7，8-二氫二醇-9，10-環(huán)氧BaP（antibenzo[a]pyrene-7，8-diol-9，10-epoxide，anti-BPDE）成功誘導(dǎo)人支氣管上皮細胞16HBE和BEAS-2B惡性轉(zhuǎn)化，并以此為模型開展了大量工作，在研究BaP致癌機制，特別是表觀遺傳機制方面取得了重要進展。研究發(fā)現(xiàn)，微RNA（microRNA，miRNA）miR-106a，miR-506和miR-377-3p等，長鏈非編碼RNA AF118081，LOC728228和DQ786227等，以及環(huán)狀RNA Circ_CARM1等分別在anti-BPDE誘導(dǎo)16HBE和BEAS-2B細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮重要作用[4-10]。盡管對BaP致癌機制已開展了大量研究工作，并發(fā)現(xiàn)了若干BaP致癌的遺傳和表觀遺傳事件，但綜合現(xiàn)有研究證據(jù)，尚不能完全闡明BaP通過影響哪些信號通路和網(wǎng)絡(luò)使正常細胞惡性轉(zhuǎn)化為腫瘤細胞，相關(guān)機制仍需進一步研究。叉頭框蛋白A1（forkhead-box A1，F(xiàn)OXA1）又稱肝細胞核因子3α（hepatocyte nuclear factor-3α，HNF-3α），是具有開放染色質(zhì)能力的先鋒轉(zhuǎn)錄因子[11]。在表觀遺傳和其他輔因子的作用下，F(xiàn)OXA1可影響與發(fā)育和代謝等有關(guān)的基因的表達，從而參與肝、消化道上皮、肺上皮、胰腺、腸和神經(jīng)元等內(nèi)胚層衍生器官的發(fā)育以及機體的新陳代謝[12-13]。有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXA1參與腫瘤細胞增殖、侵襲、遷移和凋亡等的調(diào)控，在肺癌、膀胱癌、乳腺癌和前列腺癌等多種腫瘤中表達失調(diào)，且與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)[14-19]。本課題組利用BaP誘導(dǎo)16HBE細胞惡性轉(zhuǎn)化，建立了T-16HBE-c1（THBEc1）細胞系。THBEc1細胞形態(tài)雖無明顯改變，但可復(fù)層生長和錨定非依賴性生長，在裸鼠體內(nèi)可成瘤，并呈高遷移和侵襲表型[3]。通過構(gòu)建FOXA1敲除THBEc1細胞模型THBEc1-ΔFOXA1-c34開展的研究發(fā)現(xiàn)，敲除FOXA1能抑制THBEc1細胞的體外克隆形成和細胞遷移能力及裸鼠體內(nèi)成瘤和轉(zhuǎn)移能力，提示FOXA1可能在BaP致癌中發(fā)揮癌基因作用[17]。本研究以THBEc1-ΔFOXA1-c34和對照細胞THBEc1-ctrl為模型，利用二代測序技術(shù)篩選模型細胞間差異表達基因，并對差異基因進行生物信息學(xué)分析，識別FOXA1可能參與調(diào)控的生物學(xué)過程、信號通路和網(wǎng)絡(luò)，為探討FOXA1在BaP致癌作用中的可能機制提供線索。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素，美國Sigma公司，TRIzol?試劑，美國Invitrogen公司；FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒、SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）和Pro-Light HRP化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒，北京天根生化科技有限公司；兔抗人FOXA1單克隆抗體，英國Abcam公司；小鼠抗人β肌動蛋白單克隆抗體和辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG抗體均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。SCI-I65D CO2恒溫培養(yǎng)箱，日本ASTEC公司；MEM培養(yǎng)基和胎牛血清，美國Gibco公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

BaP惡性轉(zhuǎn)化細胞THBEc1由本課題組構(gòu)建并保存。FOXA1基因敲除THBEc1單克隆細胞THBEc1-ΔFOXA1-c34為利用CRISPR/Cas9技術(shù)經(jīng)FOXA1雙切口酶質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和篩選所獲的THBEc1細胞單克隆株，由本實驗室構(gòu)建并保存[17]。對照細胞THBEc1-ctrl由本實驗室構(gòu)建并保存，其FOXA1外顯子序列及FOXA1蛋白表達水平與THBEc1細胞均無差異[17]。細胞培養(yǎng)均使用含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液（完全培養(yǎng)液），培養(yǎng)于37℃，5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中。

1.3 Western印跡法檢測FOXA1蛋白表達

收集對數(shù)生長期細胞，使用RIPA裂解液提取細胞總蛋白，Bradford法測定蛋白濃度。將30 μg蛋白樣品經(jīng)12% SDS-PAGE分離，再經(jīng)濕式電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜（NC膜）。NC膜經(jīng)5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，分別與兔抗人FOXA1抗體（1∶3000）和小鼠抗人β肌動蛋白抗體（1∶3000）4℃孵育過夜，繼而與二抗（1∶20 000）室溫孵育 2 h。經(jīng)TBST清洗后，使用Pro-Light HRP化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒檢測蛋白條帶，利用天能化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)獲取圖像。利用Image J軟件分析每個條帶積分吸光度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的積分吸光度比值表示目的蛋白表達水平。

1.4 克隆形成實驗計數(shù)克隆數(shù)目和克隆形成率

將對數(shù)生長期細胞以每皿200個接種于6 cm直徑培養(yǎng)皿，每組細胞設(shè)5個平行皿。培養(yǎng)14 d后，使用磷酸鹽緩沖液清洗細胞2次，甲醇室溫固定15 min。固定結(jié)束，使用0.01%結(jié)晶紫染液染色15 min。高純水清洗后，晾干拍照。計數(shù)克隆數(shù)目并計算克隆形成率，克隆形成率（%）=克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100%。

1.5 遷移實驗計數(shù)遷移細胞數(shù)

將對數(shù)生長期細胞經(jīng)無血清MEM培養(yǎng)液饑餓24 h后，重懸于無血清MEM培養(yǎng)液中并調(diào)整細胞密度為6.67×108L-1。將該細胞懸液150 μL（1×105個細胞）接種于8 μm孔徑Transwell小室（Thermo）的上室，下室加入500 μL含10%胎牛血清的MEM完全培養(yǎng)液。培養(yǎng)48 h后，用棉簽擦去上室中的非遷移細胞。上室下表面的遷移細胞經(jīng)甲醇固定后，用蘇木素染色。每次實驗均在顯微鏡下計數(shù)每種細胞10個不同視野（20×）的遷移細胞數(shù)，以每視野平均細胞數(shù)表示細胞的遷移能力。實驗重復(fù)3次。

1.6 轉(zhuǎn)錄組測序樣品收集

將 THBEc1-ΔFOXA1-c34 和 THBEc1-ctrl細胞分別以每皿6.0×105個接種于6 cm直徑培養(yǎng)皿。接種后48 h，細胞處于對數(shù)生長期時，棄培養(yǎng)液，每皿加入2.5 mL TRIzol?試劑。室溫靜置5 min，輕輕吹打使細胞完全裂解后收集于凍存管中，-80℃保存。

1.7 轉(zhuǎn)錄EBseq算法篩選差異表達基因

細胞總RNA提取與轉(zhuǎn)錄組測序委托上海卓灝醫(yī)藥科技有限公司完成。根據(jù)定量數(shù)據(jù)counts值，利用EBseq算法篩選差異表達基因，以差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）＞2或＜0.5且錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜0.05為篩選條件。

1.8 實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）測定mRNA水平

利用TRIzol?試劑提取對數(shù)生長期細胞總RNA。以總RNA為模板，使用FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒合成cDNA。通過RT-qPCR檢測差異表達基因的mRNA水平，以GAPDH作為內(nèi)參，計算相對表達量，并與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果進行比較。引物序列見表1。

Tab.1 Primer sequences of real-time quantitative PCR（RT-qPCR）

Tab.1 continued

1.9 生物信息學(xué)分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫對差異表達基因進行基因本體論（gene ontology，GO）和京都基因與基因百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。利用STRING 11.5數(shù)據(jù)庫對差異表達基因編碼蛋白進行蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)分析，下載PPI標簽分隔符文件。將數(shù)據(jù)按combined score＞0.8進行篩選，將篩選后的PPI數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件，構(gòu)建可視化PPI網(wǎng)絡(luò)圖。利用cytoHubba插件計算Degree值，設(shè)定網(wǎng)絡(luò)中圖形顏色和大小分別反映Log2（FC）和Degree值。利用MCODE插件，以Degree cutoff值為2，K-Core為2，對PPI網(wǎng)絡(luò)進行聚類分析，篩選得分＞6的核心功能模塊。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

利用SPSS 26.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，Graphpad Prism 8.0軟件進行圖表繪制。數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)實驗結(jié)果，以±s表示。兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 THBEc1-ΔFOXA1-c34中FOXA1蛋白表達水平

在利用課題組前期CRISPR/Cas9技術(shù)制備的THBEc1-ΔFOXA1-c34中未檢出FOXA1蛋白表達（圖1），表明細胞模型可靠。

Fig.1 Protein expression levels of forkhead box protein A1（FOXA1）in THBEc1-ΔFOXA1-c34 and THBEc1-ctrl cells by Western blotting.THBEc1：transformed human bronchial epithelial 16HBE cells；THBEc1-ctrl：control cells；THBEc1-ΔFOXA1-c34：FOXA1 knockout THBEc1 cells.

2.2 FOXA1敲除對THBEc1細胞增殖和遷移的影響

經(jīng)過多次（n＞20）傳代培養(yǎng)的THBEc1-ΔFOXA1-c34細胞克隆形成率和每視野遷移細胞數(shù)均明顯低于THBEc1-ctrl細胞對照組（P＜0.01）（圖2），表明敲除FOXA1基因可抑制細胞增殖和體外遷移能力。

Fig.2 Effect of FOXA1 knockout on cell proliferation（A）and migration（B）in vitro.A1：photos of clone formation experiment；A2：clone formation rate（n=5）；B1：pohotos of migration experiment；B2：counting results of migration experiment.Colony formation rate（%）=number of clones/number of cells seeded ×100%.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with THBEc1-ctrl cells.

2.3 THBEc1-ΔFOXA1-c34和THBEc1-ctrl細胞轉(zhuǎn)錄組差異分析

在THBEc1-ΔFOXA1-c34和THBEc1-ctrl細胞中分別共檢出19150±327和19540±467個基因，所檢出全部基因的表達FC（與THBEc1-ctrl細胞比較）和FDR值如圖3所示。在THBEc1-ΔFOXA1-c34和THBEc1-ctrl細胞中共篩選出1332個基因的表達FC＞2或＜0.5，且FDR＜0.05，其中691個基因在THBEc1-ΔFOXA1-c34細胞中的表達高于THBEc1-ctrl細胞，641個基因在THBEc1-ΔFOXA1-c34細胞中表達低于THBEc1-ctrl細胞。

Fig.3 Fold change（FC）and false discovery rate（FDR）value of genes between THBEc1-ΔFOXA1-c34 and THBEc1-ctrl cells.Compared with THBEc1-ctrl cells，641 genes（green） were down-regulated，and 691 genes（red）were up-regulated in THBEc1-ΔFOXA1-c34 cells.

2.4 THBEc1-ΔFOXA1-c34和THBEc1-ctrl細胞差異表達基因的驗證

為驗證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，本研究利用RT-qPCR對隨機選擇的47個差異表達基因在模型細胞中的mRNA表達水平進行了檢測，結(jié)果如圖4所示。與THBEc1-ctrl細胞比較，維甲酸相關(guān)孤核受體A（RAR related orphan receptor A，RORA），C-C趨化因子配體22（C-C motif chemokine ligand 22，CCL22）、雙特異性磷酸酶5（dual specificity phosphatase 5，DUSP5）、雙特異型磷酸酶 4（dual specificity phosphatase 4，DUSP4）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 3（AKT serine/threonine kinase 3，AKT3）、趨化素樣因子超家族成員7（CKLF like MARVEL transmembrane domain containing 7，CMTM7）、肝癌缺失基因-1（deleted in liver cancer 1，DLC1）、golgin A7家族成員 B（golgin A7 family member B，GOLGA7B）等 8個基因在THBEc1-ΔFOXA1-c34細胞中上調(diào)；鈣電壓門控通道輔助亞基γ4（calcium voltage-gated channel auxiliary subunit gamma 4，CACNG4）、乙醛脫氫酶 3A1（aldehyde dehydrogenase 3 family member A1，ALDH3A1）、跨膜蛋白98（transmembrane protein 98，TMEM98）、磷脂酶Cε1（phospholipase C epsilon 1，PLCE1）、生長分化因子6（growth differentiation factor 6，GDF6）、cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白5（cAMP responsive element binding protein 5，CREB5）、細胞色素P4501B 1（cytochrome P450 family 1 subfamily B member 1，CYP1B1）、IKAROS 家族鋅指2（IKAROS family zinc finger 2，IKZF2）、乙醛脫氫酶 3B2（aldehyde dehydrogenase 3 family member B2，ALDH3B2）、Ras激酶抑制因子（kinase suppressor of ras 1，KSR1）、含銅氨氧化酶1（amine oxidase copper containing 1，AOC1）、單胺氧化酶A（monoamine oxidase A，MAOA）、異檸檬酸脫氫酶1〔isocitrate dehydrogenase（NADP（+））1，IDH1〕、絲裂原活化蛋白激酶激酶6（mitogen-activated protein kinase kinase 6，MAP2K6）、熱休克蛋白 B1〔heat shock protein family B（small）member 1，HSPB1〕、轉(zhuǎn)錄因子 7樣 1（transcription factor 7 like 1，TCF7L1）、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子5（TNF receptor associated factor 5，TRAF5）、環(huán)指蛋白128（ring finger protein 128，RNF128）、轉(zhuǎn)化生長 因 子 β2（transforming growth factor-β2，TGFB2）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2型受體（bone morphogenetic protein receptor type 2，BMPR2）、Ⅲ型磷脂酰肌醇3-磷酸5-激酶（phosphoinositide kinase，PIKFYVE）、蝸牛家族轉(zhuǎn)錄抑制因子2（snail family transcriptional repressor 2，SNAI2）、凝溶膠蛋白（gelsolin，GSN）、氨基甲酰磷酸合成酶1（carbamoyl-phosphate synthase 1，CPS1）、絲裂原活化蛋白激酶 10（mitogen-activated protein kinase 10，MAPK10）、卷曲蛋白10（frizzled class receptor 10，F(xiàn)ZD10）、蛋白激酶 Cα（protein kinase C alpha，PRKCA）、GATA 結(jié)合蛋白3（GATA binding protein 3，GATA3）、賴氨酸羥化酶2（procollagenlysine，2-oxoglutarate 5-dioxygenase 2，PLOD2）、谷氨酸氨連接酶（glutamate-ammonia ligase，GLUL）、胰島素樣生長因子1受體（insulin like growth factor 1 receptor，IGF1R）、成纖維細胞生長因子受體2（fibroblast growth factor receptor 2，F(xiàn)GFR2）、肌動蛋白相關(guān)蛋白復(fù)合體2（actin related protein 2/3 complex subunit 2，ARPC2）、蛋白激酶C相關(guān)激酶N3（protein kinase N3，PKN3）、甲狀旁腺激素樣激素（parathyroid hormone-like hormone，PTHLH）、葉酸受體1基因（folate receptor alpha，F(xiàn)OLR1）、細胞周期蛋白依賴性激酶6（folate receptor alpha，CDK6）、RUNX 家族轉(zhuǎn)錄因子 2（RUNX family transcription factor 2，RUNX2）和肌醇1，4，5-三磷酸受體1型（inositol 1，4，5-trisphosphate receptor type 1，ITPR1）等 39個基因在THBEc1-ΔFOXA1-c34中下調(diào)，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。轉(zhuǎn)錄組測序與RT-qPCR所檢出的上述基因表達差異倍數(shù)一致，相關(guān)系數(shù)R=0.9808，表明轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果可靠。

Fig.4 Comparison of transcriptome sequencing（RNAseq）and RT-qPCR results of THBEc1-ΔFOXA1-c34 cells.A：logarithm of gene expression FC detected by RNAseq and RT-qPCR，respectively.FC refers to the ratio of THBEc1-ΔFOXA1-c34 to THBEc1-ctrl cells.Compared with the THBEc1-ctrl cells，F(xiàn)DR（by RNAseq）and P value（by RT-qPCR）of the indicated genes is less than 0.05.B：linear correlation between the logarithm of gene expression FC detected by the two methods.

2.5 THBEc1-ΔFOXA1-c34和 THBEc1-ctrl細胞差異表達基因的生物信息學(xué)分析

GO分析（圖5）發(fā)現(xiàn)，差異表達基因涉及生物過程203項、分子功能44項、細胞組分30項。富集的生物過程包括血管生成、細胞黏附、基因表達的正調(diào)控、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）活性的激活、肽基酪氨酸磷酸化的正調(diào)控、細胞增殖的負調(diào)控、炎癥反應(yīng)、內(nèi)肽酶活性的負調(diào)控、表皮發(fā)育和細胞生長調(diào)節(jié)等。富集的分子功能涉及生長因子活性、細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)組成、細胞因子活性、肝素結(jié)合、金屬內(nèi)肽酶活性、絲氨酸型內(nèi)肽酶抑制劑活性、RNA聚合酶Ⅱ核心啟動子近端區(qū)域序列特異性DNA結(jié)合、Ras鳥苷酸交換因子活性和胰島素樣生長因子Ⅰ結(jié)合和整合素結(jié)合等。富集的細胞組分有細胞外間隙、胞外域、蛋白質(zhì)細胞外基質(zhì)、質(zhì)膜的組成部分、高爾基體腔、質(zhì)膜、細胞外基質(zhì)、胞外外泌體、細胞表面和黏著斑等。

Fig.5 Gene Ontology（GO）and KEGG pathways of differentially expressed genes in THBEc1-ΔFOXA1-c34 cells.GO and KEGG pathway were gathered via DAVID database.Top 10 items of each GO term，and all KEGG pathways are shown in the graph.The number at the top of the entry referred to enriched genes.

KEGG通路分析（圖6）發(fā)現(xiàn)，差異表達基因富集于36條信號通路，主要涉及到細胞因子和細胞因子受體相互作用、補體和凝血級聯(lián)通路、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）通路、癌癥的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、癌癥中的蛋白多糖通路、瞬時受體電位（transient receptor potential，TRP）通道的炎癥介質(zhì)調(diào)節(jié)、調(diào)控干細胞多能性的信號通路、Hippo通路、Rap1通路、癌癥通路、造血細胞譜系、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶 B（phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）通路，叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O（forkhead box O，F(xiàn)oxO）通路、TGF-β通路和MAPK通路等（圖5）。

Fig.6 Protein-protein interaction network of proteins encoded by differentially expressed genes.A：the interaction network between proteins encoded by 349 differentially expressed genes created using STRING 11.5 tool，and visualized by Cytoscape 3.8.2 software.B：the top 4 core function modules created via MCODE plug in Cytoscape 3.8.2.The protein in the blue circle box was the seed node.

PPI網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，349個差異表達基因所編碼的蛋白質(zhì)彼此間存在相互作用并形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)（圖6A）。進一步分析發(fā)現(xiàn)，在此PPI網(wǎng)絡(luò)中，存在分別以CCL3，GCNT3，MMP3和FZD8作為種子節(jié)點的4個核心功能模塊（圖6B）。這些核心功能模塊主要參與免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)、O-聚糖加工、膠原分解代謝過程、以及典型WNT通路等。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，模型細胞間共1332個基因差異表達，涉及多項GO功能和多條信號通路，包括血管生成、黏附、細胞增殖、炎癥反應(yīng)、基因表達調(diào)控、細胞因子-細胞因子受體相互作用、蛋白聚糖、MAPK激活、代謝、免疫應(yīng)答和細胞外基質(zhì)分解等多種與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)的生物學(xué)事件。提示FOXA1可能通過參與調(diào)節(jié)以上生物學(xué)過程影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。

TNF通路與細胞增殖、遷移、侵襲和血管生成密切相關(guān)[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXA1敲除后，參與TNF通路及與其相關(guān)的MAPK通路的多個基因表達發(fā)生改變，如TRAF5，MAP2K6，MAPK14，MAPK10，CREB5和CASP8等均表達下調(diào)。TRAF5是腫瘤壞死因子相關(guān)受體家族成員，可促進腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲等[22]。TNF通路可以通過影響MAPK通路發(fā)揮作用[23]。MAPK通路是對氧化應(yīng)激、細胞因子等外界刺激產(chǎn)生反應(yīng)的關(guān)鍵通路。在多種腫瘤中，MAPK通路被激活，從而促進腫瘤細胞增殖和遷移[24-25]。如有研究發(fā)現(xiàn)，Kin17作為一種DNA和RNA結(jié)合蛋白，可通過激活P38 MAPK信號通路促進甲狀腺癌細胞增殖[26]。LncRNA TUC338通過激活MAPK通路促進肺癌的侵襲潛能[27]。MAPK通路包括ERK，JNK和P38 MAPK 3條經(jīng)典通路。敲除FOXA1后，MAPK信號通路相關(guān)基因表達明顯改變。ERK通路中Ⅰ型跨膜AMPA受體調(diào)節(jié)蛋白編碼基因CACNG4、受體酪氨酸激酶編碼基因IGF1R和FGFR2、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶編碼基因PRKCA表達均下調(diào)，DUSP4和DUSP5表達均上調(diào)，DUSP4和DUSP5可負調(diào)控ERK/JNK。JNK和P38 MAPK信號通路中相關(guān)蛋白編碼基因TGFB2，MAPK10，MAPK14，MAP2K6和HSPB1表達均下調(diào)。上述TNF和MAPK信號通路多個基因表達失調(diào)，提示FOXA1敲除可能通過直接或間接干擾TNF和MAPK通路導(dǎo)致THBEc1細胞增殖和遷移能力降低。

在差異表達基因編碼蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)分析中，本研究發(fā)現(xiàn)了分別以CCL3，GCNT3，MMP3和FZD8為種子節(jié)點的4個核心功能模塊。這些功能模塊主要參與免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)、黏蛋白型O-聚糖生物合成、膠原分解代謝過程及典型WNT通路等。

WNT通路是調(diào)控上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-tomesenchymal transition，EMT）的重要通路之一，其異常活化與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。WNT蛋白與膜受體Frizzled蛋白結(jié)合是啟動WNT通路的重要步驟。以FZD8為種子節(jié)點的功能模塊包含了5種WNT蛋白（WNT5A，WNT7A，WNT9A，WNT10A，WNT11）和2種Frizzled蛋白（FZD8和FZD10）。WNT10A高表達能促進多種腫瘤的遷移、侵襲和增殖[28-30]。載有FZD10和FZD10mRNA的外泌體可體外促進多種腫瘤細胞增殖[31]。用小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）干擾FZD10表達可抑制腫瘤細胞生長[32]。FZD10的表觀遺傳沉默可抑制WNT3-FZD10-β聯(lián)蛋白異?；罨瑥亩种颇[瘤轉(zhuǎn)移[33]。此外，WNT5A的異常激活可以抑制肝癌和乳腺癌細胞的遷移和侵襲[34-35]。FOXA1敲除后WNT10A和FZD10表達均下調(diào)，而WNT5A表達上調(diào)，提示W(wǎng)NT信號通路擾動可能是FOXA1影響THBEc1細胞遷移的重要機制。

以GCNT3為種子節(jié)點的功能模塊包含11種蛋白，分別是黏蛋白家族的MUC3A，MUC4，MUC5AC，MUC5B，MUC6和MUC16，葡萄糖氨基轉(zhuǎn)移酶家族的GCNT3，以及催化黏蛋白O型糖基化修飾起始酶的N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶家族的GALNT5，GALNT10，GALNT12和GALNT15。黏蛋白異常表達可通過破壞上皮細胞極性，影響細胞間相互作用，促進EMT。MUC3A，MUC4，MUC5AC和MUC5B在非小細胞肺癌和肺粘液腺癌中高表達，并與不良預(yù)后有關(guān)[36-38]。GCNT3在非小細胞肺癌中表達上調(diào)，抑制GCNT3可降低A549細胞增殖、遷移和侵襲能力[39]。FOXA1敲除后，上述4種黏蛋白以及GCNT3編碼基因均下調(diào)，提示其亦可能是FOXA1敲除后細胞增殖和遷移能力降低的原因之一。

綜上所述，F(xiàn)OXA1敲除后BaP惡性轉(zhuǎn)化細胞THBEc1轉(zhuǎn)錄組明顯改變，增殖和遷移能力降低。敲除FOXA1可能通過直接或間接干擾TNF，MAPK和WNT等通路抑制細胞增殖和遷移。FOXA1可能作為BaP致癌的潛在生物標志物和肺癌的潛在治療靶點。本研究為后續(xù)FOXA1的靶基因探索提供了基礎(chǔ)，有助于進一步闡明FOXA1在BaP致癌作用中的機制。