吳 浩，符麗珍，趙 勇，柯維春，莊乙君

（海南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院東湖分院內(nèi)科，海南 ?？?570105）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是終末期腎衰竭的主要原因，發(fā)病機制錯綜復雜，發(fā)展到晚期難以治愈[1]。世界衛(wèi)生組織估計，到2040年全球?qū)N患者上升到6.42億[2]。DN的特征在于持續(xù)性白蛋白尿、腎小球濾過率逐漸下降和血壓升高，臨床上主要通過控制血壓和血糖，以及減少蛋白尿作為DN的標準療法[3]。目前尚無治療DN的特效藥物，相關(guān)藥物研發(fā)是當前工作重點。

桔梗皂苷D為桔梗科植物桔梗的干燥根，具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、保肝和調(diào)節(jié)免疫等藥理作用[4-5]。有研究表明，桔梗皂苷D對四氧嘧啶誘導糖尿病模型小鼠具有保護作用[6]，桔梗皂苷D預處理可通過抑制氧化應激和NF-κB P65表達改善順鉑誘導的腎毒性[7]。然而，桔梗皂苷D對DN的影響機制并不清楚。本研究通過采用高脂飲食聯(lián)合腹腔注射鏈尿佐菌素的方法制備DN模型大鼠，觀察桔梗皂苷D對DN模型大鼠腎組織損傷、炎癥反應、氧化應激和磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of Rapamycin，mTOR）信號通路的影響，為DN的臨床治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和主要儀器

桔梗皂苷D（純度≥97.7%）和鹽酸二甲雙胍（中國食品藥品檢定研究院）；鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）（美國Sigma-Aldrich公司）；尿蛋白定量試劑盒、蘇木素-伊紅染液、總膽固醇（total cholesterol，TC）測定試劑盒、甘油三酯（triglyceride，TG）測定試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）測定試劑盒和高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）測定試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司）；總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測定試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）測定試劑盒和辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗兔IgG抗體（南京建成生物工程研究所）；山羊抗大鼠PI3K、磷酸化PI3K（phospho-PI3K，p-PI3K）、Akt、p-Akt、mTOR和 p-mTOR 多克隆抗體（英國Abcam公司）。瑞特GM720血糖儀（華廣生技股份有限公司）；全自動糖化血紅蛋白（glycated hemoglobin，HbA1c）檢測分析儀DT480（盛世東唐江蘇生物科技有限公司）；U-T6A可見分光光度計（上海屹譜儀器制造有限公司）。

1.2 動物、模型制備和分組

72只雄性SD大鼠（海南藥物研究所有限責任公司），體重180～200 g，許可證號SCXK（瓊）2020-0007，飼養(yǎng)于SPF級屏障實驗室。將大鼠隨機分為6組：正常對照組、模型組、模型+桔梗皂苷D 25，50和100 mg·kg-1組及模型+二甲雙胍500 mg·kg-1組。參照祁珊珊等[8]方法復制DN大鼠模型，除正常對照組大鼠外，其余大鼠飼喂高脂高糖飼料的同時ip給予STZ 60 mg·kg-1，72 h后檢測血糖，以空腹血糖≥16.7 mmol·L-1表明糖尿病模型制備成功。繼續(xù)喂食高脂高糖飼料，28 d后，以24 h尿蛋白含量＞30 mg視為DN模型造模成功。DN模型大鼠分為模型組，模型+桔梗皂苷D 25，50，100 mg·kg-1[9]及模型+二甲雙胍 500 mg·kg-1組[10]（均ig給予），每天1次，連續(xù)14 d；正常對照組ig給予同體積生理鹽水。

1.3 樣本采集

按1.2分組大鼠，最后一次給藥后，留取各組大鼠24 h尿液。尾靜脈采血，血糖儀檢測血糖。使用3%戊巴比妥鈉（40 mg·kg-1）麻醉大鼠，腹主動脈取血5 mL，離心收集上清，分裝保存于-20℃。采血后，處死各組大鼠，取大鼠腎組織，部分于冰上用小剪刀剪開，按腎組織∶水=1∶9（V/V）的比例置0℃生理鹽水中，制成10%腎組織勻漿；部分腎組織采用4%多聚甲醛固定液固定，石蠟包埋切片，-20℃保存。

1.4 糖化血紅蛋白水平和尿蛋白含量檢測

取1.3中留取的尿液和血清，采用尿蛋白定量試劑盒檢測24 h尿蛋白含量，全自動糖化血紅蛋白檢測分析儀檢測血清中糖化血紅蛋白。

1.5 HE染色觀察腎組織病理損傷

取1.3中制備好的切片，常規(guī)脫蠟脫水后行HE染色，并在光學顯微鏡下觀察并拍攝。并參照Paller法[11]對腎小管損傷情況進行半定量評分。Paller評分標準：腎小管明顯擴張，細胞扁平計1分；刷狀緣損傷計1分，脫落計2分；細胞質(zhì)空泡計1分；間質(zhì)水腫計1分；腎小管腔內(nèi)有脫落的壞死細胞，未形成管型或碎片計1分，形成管型或碎片計2分。

1.6 試劑盒檢測血清血脂指標

取1.3中留取的血清標本，根據(jù)試劑盒說明書，采用可見分光光度計測定TC，TG，LDL-C和HDL-C水平。

1.7 ELlSA 檢測腎組織中的 lL-6，lL-1 β和 TNF- α水平

取1.3中制備的腎組織勻漿，16 099×g離心15 min，收集上清液，按照ELISA試劑盒說明書檢測炎癥因子IL-6，IL-1β和TNF-α水平。

1.8 試劑盒檢測腎組織中SOD和GSH-Px活性及MDA含量

取1.3中制備的腎組織勻漿，根據(jù)SOD，MDA和GSH-Px測定試劑盒說明書分別測定腎組織勻漿中SOD，GSH-Px活性和MDA含量。

1.9 Western印跡法檢測腎組織中Pl3K，Akt和mTOR蛋白磷酸化水平

取各組大鼠腎組織裂解提取總蛋白，通過BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)含量。提取等量的蛋白質(zhì)樣品100℃變性5 min后用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，在4℃條件下加相應一抗（1∶1000）并孵育過夜，清洗，4℃下加HRP標記山羊抗兔IgG（1∶10 000），孵育2 h，最后加入ECL發(fā)光液曝光處理。ImageJ軟件統(tǒng)計各條帶積分吸光度值，以p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR積分吸光度值比值，表示蛋白磷酸化水平。

1.10 統(tǒng)計學分析

采用GraphPad Prism 5進行統(tǒng)計分析，實驗結(jié)果數(shù)據(jù)表示為±s，組間比較采取t-SNK檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 桔梗皂苷D對DN模型大鼠血糖、糖化血紅蛋白水平和尿蛋白含量的影響

與正常對照組比較，模型組血糖、糖化血紅蛋白水平和尿蛋白含量升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，模型+桔梗皂苷D 50和100 mg·kg-1組和模型+二甲雙胍組血糖、糖化血紅蛋白水平和尿蛋白含量降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表1）。

Tab.1 Effect of platycodin D on blood glucose，glycated hemoglobin（HbA1c）and urinary protein in diabetic nephropathy（DN）model rats

2.2 桔梗皂苷D對DN模型大鼠腎組織損傷的影響

正常對照組腎小球結(jié)構(gòu)完整，基質(zhì)和系膜未見異常變化，腎小管結(jié)構(gòu)完整。模型組大鼠和桔梗皂苷D 25 mg·kg-1組腎組織壞死明顯，腎小球萎縮，腎小管上皮細胞大量變性，并可見大量炎癥細胞，腎小管損傷評分升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與模型組相比，模型+桔梗皂苷D 50和100 mg·kg-1組及模型+二甲雙胍組腎小球基底膜增厚程度明顯改善，腎小球系膜基質(zhì)增生程度明顯減輕，腎小管損傷評分較模型組降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖1和表2）。

Fig.1 Effect of platycodin D on pathological changes of renal tissue in DN model rats.See Tab.1 for the rat treatment.Arrows show sites of kidney tissue damage.

Tab.2 Effect of platycodin D on renal tubule injury scores in DN model rats

2.3 桔梗皂苷D對DN模型大鼠血清中TC，TG，LDL-C和HDL-C水平的影響

與正常對照組比較，模型組TC，TG和LDL-C水平升高，HDL-C水平降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，模型+桔梗皂苷D 50和100 mg·kg-1組及模型+二甲雙胍組TC,TG和LDL-C水平降低，HDL-C水平升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表3）。

Tab.3 Effect of platycodin D on levels of total cholesterol（TC），triglyceride（TG），low-density lipoprotein cholesterol（LDL-C）and high-density lipoprotein cholesterol（HDL-C）in serum of DN model rats

2.4 桔梗皂苷D對DN模型大鼠腎組織中TNF- α，lL-6和lL-1 β水平的影響

與正常對照組比較，模型組TNF-α，IL-6和IL-1β水平升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，模型+桔梗皂苷D 50和100 mg·kg-1組及模型+二甲雙胍組TNF-α，IL-6和IL-1β水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表4）。

Tab.4 Effect of platycodin D on levels of tumor necrosis factor- α（TNF- α），interleukin-6（lL-6）and lL-1 β in kidney tissues of DN model rats

2.5 桔梗皂苷D對DN模型大鼠腎組織中MDA含量及SOD和GSH-Px活性的影響

與正常對照組比較，模型組MDA含量升高，SOD和GSH-Px活性降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，模型+桔梗皂苷D 50和100 mg·kg-1組及模型+二甲雙胍組MDA含量降低，SOD和GSH-Px活性升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表5）。

Tab.5 Effect of platycodin D on malondialdehyde（MDA）content and activities of superoxide dismutase（SOD）and glutathione peroxidase（GSH-Px）in kidney tissues of DN model rats

2.6 桔梗皂苷D對DN模型大鼠腎組織中Pl3K，Akt和mTOR磷酸化水平的影響

Western印跡結(jié)果顯示（圖2），與正常對照組比較，模型組p-PI3K/PI3K，p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR比值顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，模型+桔梗皂苷D 50和100 mg·kg-1組及模型+二甲雙胍組p-PI3K/PI3K，p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR比值顯著降低（P＜0.05），表明PI3K，Akt和mTOR磷酸化水平降低。

Fig.2 Effect of platycodin D on phosphorylation levels of phosphatidylinositol-3-kinase（Pl3K），protein kinase B（Akt）and mammalian target of Rapamycin（mTOR）in kidney tissues of DN model rats.See Tab.1 for the rat treatment.B was the semi-quantatitive result of A.±s，n=12.＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with model group.

3 討論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ig桔梗皂苷D后，DN模型大鼠血糖、糖化血紅蛋白水平及TC、TG和LDL-C水平降低，HDL-C水平升高，表明桔梗皂苷D可有效改善DN大鼠血脂異常。腎損傷往往伴隨著蛋白尿的產(chǎn)生，蛋白尿是DN進展的獨立危險因素之一[12]。DN模型大鼠ig給予桔梗皂苷D后，尿蛋白含量降低，腎組織病理損傷明顯改善，表明桔梗皂苷D可改善DN大鼠腎功能。

DN作為炎癥性疾病，往往存在炎癥細胞浸潤和炎癥因子水平升高[13]。桔梗皂苷D具有良好的抗炎活性，如通過抑制炎癥因子IL-6和TNF-α的生成改善膠原性關(guān)節(jié)炎小鼠的骨和軟骨損傷[14]，抑制炎癥因子TNF-α，IL-1β和IL-6水平的升高對乙醇誘導小鼠肝損傷模型具有保護作用[15]。本研究結(jié)果表明，DN模型大鼠ig給予桔梗皂苷D后，TNF-α，IL-6和IL-1β水平降低，提示桔梗皂苷D可抑制DN大鼠的炎癥反應。

越來越多實驗研究發(fā)現(xiàn)，許多抗氧化應激物質(zhì)對DN的發(fā)展起到了預防、延緩甚至是治療的作用[16]。MDA是脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應的氧化終產(chǎn)物，測定MDA含量可反映機體脂質(zhì)過氧化的程度。SOD和GSH-Px是體內(nèi)重要的氧自由基清除劑，其含量越低，表明抗氧化能力越弱，反之則越強。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DN模型大鼠ig給予桔梗皂苷D后，MDA含量升高，SOD和GSH-Px活性降低，提示桔梗皂苷D抑制氧化應激對DN大鼠模型具有保護作用。

相關(guān)研究表明，DN患者腎組織PI3K/Akt/mTOR信號通路被異常激活，自噬受到抑制，從而引起腎系膜細胞增殖、胞外基質(zhì)積聚，導致腎損傷、腎小球肥大[17]。何康婧等[18]研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤多苷片可能通過調(diào)控PI3K/Akt/mTOR通路改變腎自噬活性狀態(tài)，對DN模型大鼠腎損傷起保護作用。本研究結(jié)果表明，DN模型大鼠ig給予桔梗皂苷D后，p-PI3K/PI3K，p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR比值降低，提示桔梗皂苷D抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路的活化對DN大鼠模型起保護作用。

綜上所述，桔梗皂苷D可改善DN模型大鼠腎組織病理損傷，調(diào)控血脂異常，抑制炎癥因子的釋放，抑制氧化應激，可能是通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路的活化實現(xiàn)的。