張 成， 姚興東*， 雷福厚

(1.廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西民族大學(xué)，廣西南寧 530006;2.廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西民族大學(xué)，廣西南寧 530006)

巖黃連為罌粟科紫堇屬多年生草本植物石生黃堇(CorydalissaxicolaBunting)的全草，主要分布于我國廣西、云南、貴州、四川等地，常用作肝病等疾病的治療[1]。研究表明，巖黃連的有效成分是以脫氫卡維丁為代表的生物堿類化合物，主要為脫氫卡維丁、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿3種生物堿，具有抗腫瘤、保肝、抗肝炎病毒、抗菌等藥理活性[2 - 5]，通過測定草藥中這3種生物堿的含量可實(shí)現(xiàn)中草藥的質(zhì)量控制[6 - 8]。由于這幾種生物堿均為強(qiáng)堿性季銨鹽類生物堿，其結(jié)構(gòu)與性質(zhì)非常相似，因此增加了分離的難度。已有文獻(xiàn)報(bào)道均使用ODS色譜柱進(jìn)行分離[9 - 11]。但我們的實(shí)驗(yàn)表明，由于這3種生物堿分子的極性較大，在ODS色譜柱上保留值較小，很多情況下難以實(shí)現(xiàn)這3種生物堿完全分離。通過增加固定相極性，提高這3種生物堿在色譜柱上的保留值，有望改善分離效果。SiO2@松香基高分子(Ru131)柱是我們課題組以天然松香為原料開發(fā)的新型高效液相色譜柱，由于其含有羧基，有助于生物堿在色譜柱上的保留和分離，已在喜樹堿、吳茱萸、咖啡因等生物堿的分離中得到了應(yīng)用[12,13]。

本文在SiO2@松香基高分子(Ru131)色譜柱上，優(yōu)化色譜分離條件，建立了一種測定巖黃連中脫氫卡維丁、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿含量的液相色譜分析方法。方法線性范圍寬，回收率高，結(jié)果準(zhǔn)確，為測定中草藥中有效成分脫氫卡維丁、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿的含量、評價(jià)巖黃連的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀(LC-15 C，日本島津公司)；裝柱機(jī)(CP-24，美國科學(xué)系統(tǒng)公司)；不銹鋼空液相色譜柱管(250 mm×4.6 mm，大連依利特分析儀器有限公司)。

馬來海松酸丙烯酸乙二醇酯(EGMRA)(98%，廣西梧州日成林產(chǎn)化工股份有限公司)、甲基丙烯酸(MMA)(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、脫氫卡維丁(純度>99%，上海源葉生物科技有限公司)、鹽酸巴馬汀(純度>98%，阿拉丁生化科技股份有限公司)、鹽酸小檗堿(純度>98%，阿拉丁生化科技股份有限公司)；乙腈、甲醇(色譜純，賽默飛世爾科技有限公司)；NaH2PO4(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。水為二次超純水。

巖黃連藥材干草購于南寧市廣耀實(shí)驗(yàn)裝備有限責(zé)任公司，產(chǎn)自廣西大化縣，經(jīng)粉碎后備用。

1.2 色譜固定相的制備

Ru131固定相參照文獻(xiàn)的方法[12]合成?；|(zhì)使用5 μm球形硅膠(蘇州納微科技股份有限公司)。固定相采用勻漿法將填料填入250 mm×4.6 mm色譜柱。

1.3 生物堿對照品溶液的配制與樣品處理

對照品混合溶液的配制：稱取適量脫氫卡維丁、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿對照品，以甲醇分別配成質(zhì)量濃度為0.2180 mg·mL-1脫氫卡維丁、0.2120 mg·mL-1鹽酸巴馬汀和0.2060 mg·mL-1鹽酸小檗堿的對照品儲備溶液。分別吸取適量各對照品儲備溶液混合，以甲醇稀釋成相應(yīng)濃度的對照品混合溶液。

供試品溶液的配制：參照文獻(xiàn)的方法[14]，精確稱取巖黃連粉末2.0000 g，加入150 mL含1%HCl的甲醇溶液，索氏提取8 h后，旋蒸濃縮，并用甲醇定容至100 mL。取適量該溶液，過微孔濾膜(0.22 μm)后，進(jìn)行液相色譜分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 Ru131固定相的表征

文獻(xiàn)[12]曾采用傅立葉紅外(FTIR)光譜、核磁共振(NMR)、掃描電鏡(SEM)等方法表征了Ru131色譜固定相，結(jié)果表明有機(jī)基團(tuán)成功地鍵合到硅膠表面。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也與文獻(xiàn)報(bào)道一致。此外，參照文獻(xiàn)的方法[13]測定了合成時不同EGMRA∶MMA比例所得固定相的酸值，當(dāng)單體比例分別為5∶1、5∶1.5、5∶2 和5∶3 時，固定相的酸值分別為0.07420、0.09423、0.1070和0.1154 mmol/g。這表明增加MMA用量可以增加固定相中羧基的含量，從而增強(qiáng)其與生物堿的作用，延長生物堿在色譜柱上的保留并改善分離效果。

2.2 色譜分離條件的優(yōu)化

2.2.1 Ru131固定相的單體比例對分離效果的影響將0.08000 mg/mL的混合對照品溶液分別以不同的Ru131液相色譜柱進(jìn)行分離。在不同單體比例(EGMRA∶MMA)合成所得SiO2@松香基高分子(Ru131)色譜柱上，以乙腈-0.0050 mol/L磷酸緩沖溶液為流動相時，脫氫卡維丁、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿均能實(shí)現(xiàn)分離，隨著固定相中MMA的含量增加，3種生物堿的保留時間均增大。這是因?yàn)樵黾覯MA含量后，固定相上的羧基含量也相應(yīng)增加，增強(qiáng)了羧基與生物堿正離子間的庫侖力作用。當(dāng)單體比例達(dá)到5∶2 時，繼續(xù)增大MMA的比例，3種生物堿的保留時間并無明顯增加。在單體比例為5∶2 時3種生物堿在SiO2@松香基高分子(Ru131)柱上分離效果最好，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用此色譜柱進(jìn)行分離。

2.2.2 流動相中乙腈濃度對分離效果的影響以乙腈-0.0050 mol/L磷酸緩沖溶液(pH=3.0)為流動相時，當(dāng)乙腈濃度從40%降低到20%，脫氫卡維丁、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿3種生物堿的保留時間隨乙腈濃度的降低而逐漸增加。當(dāng)乙腈-磷酸鹽緩沖溶液混合比為20∶80(V/V)時分離效果好且保留時間適中。因此實(shí)驗(yàn)中選擇乙腈-磷酸緩沖鹽溶液(pH=3.0)作為本實(shí)驗(yàn)的流動相。產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因主要是由于固定相和3種生物堿均有大的非極性基團(tuán)，因此兩者之間存在較強(qiáng)的色散力作用，也表現(xiàn)出反相色譜的特性。隨著流動相中乙腈濃度的降低，生物堿的保留時間變長，分離度增大。但當(dāng)乙腈濃度低于20%后，3種生物堿的保留時間過長，峰形也較差，分離度反而下降。因此，流動相中適宜的乙腈濃度為20%。

2.2.3 流動相pH對分離效果的影響調(diào)節(jié)磷酸緩沖溶液的pH分別至3.0、4.0和5.0。以不同pH的流動相對混合對照品溶液在Ru131柱上進(jìn)行色譜分離。結(jié)果如圖1所示，隨著流動相的pH增高，脫氫卡維丁、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的保留時間變長。這是因?yàn)镾iO2@松香基高分子(Ru131)柱中存在羧基，在流動相pH較低時主要以—COOH形式存在。而當(dāng)pH增大時羧基發(fā)生解離以—COO-的形式存在，后者與帶正電荷的生物堿之間的庫侖力作用更強(qiáng)，因此保留時間增加。但由于隨著保留時間的增長，色譜峰變寬，3種生物堿間的分離度并無明顯改善。因此后期實(shí)驗(yàn)中均選用pH=3.0的流動相。

圖1 不同pH流動相分離脫氫卡維丁、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的色譜圖

2.3 草藥巖黃連中脫氫卡維丁、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿的測定

2.3.1 供試品溶液與混合對照品溶液色譜圖綜合以上實(shí)驗(yàn)，最佳色譜分離條件為：乙腈-0.0050 mol/L磷酸緩沖溶液(pH=3.0)=20∶80(V/V)，流速1.00 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長347 nm，進(jìn)樣量20 μL。分別對巖黃連混合對照品溶液與巖黃連供試品溶液進(jìn)行分離，結(jié)果如圖2所示。在此條件下脫氫卡維丁、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿可實(shí)現(xiàn)良好的分離，且與草藥巖黃連中其他組分均有很好的分離。

圖2 巖黃連溶液的色譜圖

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線分別精密吸取適量體積的上述對照品溶液，配制成混合對照品溶液。按照“2.3.1”的條件進(jìn)行測定，分別以脫氫卡維丁、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的色譜峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，混合對照品溶液中各生物堿的濃度為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。3種生物堿的相關(guān)回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍列于表1。

表1 脫氫卡維丁、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿的線性方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)

2.3.3 精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取含有脫氫卡維丁25.11 μg·mL-1、鹽酸巴馬汀13.74 μg·mL-1、鹽酸小檗堿5.93 μg·mL-1的混合樣對照品溶液20 μL，根據(jù)“2.3.1”色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣10次，以3種生物堿的峰面積計(jì)算結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。脫氫卡維丁、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿峰面積的RSD分別為0.45%、0.58%和2.56%。表明結(jié)果具有較高的精密度。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)按照“1.3”的方法制備巖黃連供試品溶液，分別放置0、2、4、8、12、24 h后進(jìn)樣分析測定。結(jié)果顯示，24 h內(nèi)脫氫卡維丁、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀的RSD分別為2.5%、2.7%、0.42%，表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn)取同一批巖黃連藥材粉末，并按照“1.3”的方法配制供試品溶液6份，以“2.3.1”中液相色譜條件測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，脫氫卡維丁、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿含量測定結(jié)果的RSD分別為1.91%、2.29%和2.27%，表明分析結(jié)果有較好的重現(xiàn)性。

2.3.6 加入回收試驗(yàn)精密量取已知含量的樣品溶液9份，分別加入相當(dāng)于巖黃連樣品中脫氫卡維丁、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿80%、100%、120%含量的對照品，用1%HCl甲醇溶液定容后，按前述方法進(jìn)樣測定，分別計(jì)算3種生物堿的加樣回收率，結(jié)果如表2所示。

表2 脫氫卡維丁、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的加樣回收率測定結(jié)果

2.3.7 樣品含量測定取巖黃連藥材粉末，按照“1.3”的方法平行制備3份供試品溶液，并按照色譜條件依次進(jìn)樣測定，測得樣品中脫氫卡維丁、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿含量分別為0.9894%、0.6655%、0.1694%，即3種生物堿總含量為1.824%。

3 結(jié)論

采用SiO2@松香基高分子(Ru131)色譜柱，對巖黃連中脫氫卡維丁、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿含量進(jìn)行分離測定，和ODS柱相比，3種生物堿的保留值和分離度均明顯增加，且?guī)r黃連中除3種生物堿外的其他物質(zhì)在此色譜柱上保留時間較短，能與3種生物堿可完全分離從而不會影響測定。這表明與ODS柱相比，SiO2@松香基高分子(Ru131)色譜柱更適用中草藥中生物堿的分析檢測。