王靜楠， 王麗麗， 胡 筱*， 林 曉， 林 浦， 陳昌梅， 余麗雙*

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州 350122；3.福建省茶葉質(zhì)量檢測(cè)與技術(shù)推廣中心，福建福州 350001)

近年來(lái)，基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Mass Spectrometry，MALDI-MS)成為分析多肽、蛋白質(zhì)、聚合物、多糖等大分子不可或缺的分析工具。在MALDI技術(shù)中，α-氰基-4-羥基肉桂酸(HCCA)、芥子酸(SA)等有機(jī)基質(zhì)實(shí)現(xiàn)了較高的解吸和電離效率。但由于有機(jī)基質(zhì)的自身離子化造成了質(zhì)譜圖中小于700 Da的低質(zhì)量端嚴(yán)重的背景干擾，從而影響小分子化合物的檢測(cè)。因此，有研究者在MALDI原理的基礎(chǔ)上提出了表面輔助激光解吸電離-質(zhì)譜(Surface -Assisted Laser Desorption Ionization-Mass Spectrometry,SALDI-MS)，該方法能夠?qū)ALDI-MS的應(yīng)用范圍擴(kuò)大，使其在檢測(cè)小分子物質(zhì)時(shí)降低了干擾，提高了檢測(cè)靈敏度[1]。

金屬有機(jī)骨架(Metal Organic Frameworks，MOFs)是一種多孔的晶體材料[2]，由于它們獨(dú)特的性質(zhì)，如大比表面積、超高孔隙率、多樣化功能以及良好的化學(xué)穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)，MOFs在生物領(lǐng)域中的應(yīng)用得到了廣泛的研究，特別是在蛋白質(zhì)組學(xué)和肽類研究的樣品制備中[3]。隨著MOFs材料和后修飾技術(shù)的發(fā)展，用作SALDI-MS基質(zhì)的MOFs種類及可分析化合物的種類明顯增多，通過與功能性材料復(fù)合或修飾特定的官能團(tuán)，MOFs材料可以兼具基質(zhì)和富集兩種功能[4]。Lin等人[5]利用磁性ZIF-8納米材料作為MALDI的基質(zhì)實(shí)現(xiàn)了對(duì)脂肪酸、多肽、性激素等一系列小分子化合物的分析；Chen等人[6]合成了兩種新的材料UiO-66-PDC和UiO-66-(OH)2作為基質(zhì)對(duì)磷酸吡哆醛和葡萄糖進(jìn)行分析。因此，將MOFs材料作為基質(zhì)用于SALDI-MS，可實(shí)現(xiàn)其快速檢測(cè)復(fù)雜樣品中的小分子化合物。

小分子黃酮類藥物的分子量大部分小于700 Da，在MALDI-MS分析中，使用傳統(tǒng)基質(zhì)在低質(zhì)量端會(huì)造成嚴(yán)重的背景干擾，故要實(shí)現(xiàn)黃酮類小分子的MALDI-MS分析十分困難。本文將金屬有機(jī)骨架化合物MIL-101(Cr)材料用做SALDI的基質(zhì)，選擇黃酮類化合物作為分析對(duì)象，并對(duì)比考察了MIL-101(Cr)與傳統(tǒng)基質(zhì)的檢測(cè)效果。從結(jié)果上來(lái)看，MIL-101(Cr)在檢測(cè)黃酮類化合物方面與傳統(tǒng)基質(zhì)相比表現(xiàn)出更有利的優(yōu)勢(shì)，可以增強(qiáng)待測(cè)樣品離子信號(hào)強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)對(duì)黃酮類小分子的無(wú)背景干擾檢測(cè)。因此基于MIL-101(Cr)對(duì)蘆丁的吸附富集及對(duì)生物大分子的排除，可以實(shí)現(xiàn)血樣中蘆丁的分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器

UV-1800型紫外-可見分光光度計(jì)(日本，島津公司)；Vortex QL-861型漩渦混合器(海門市其林貝爾儀器制造(中國(guó))有限公司)；KQ-300DE型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；Autoflex Speed基質(zhì)輔助激光解析電離-時(shí)間分辨質(zhì)譜(德國(guó)，布魯克道爾頓)，儀器參數(shù)：激光光源為smartbeam-Ⅱ激光器，激光波長(zhǎng)為355 nm，頻率為500 Hz。

1.2 材料與試劑

MIL-101(Cr)(CAS：869288-09-5；BN：CS016024)購(gòu)于上?？瑯浠瘜W(xué)科技有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(ID：XW37-4SPD，91.9%)、橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品(ID：ZZ3A-1SC5，95.1%)購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所；5-O-甲基維斯阿米醇苷標(biāo)準(zhǔn)品(CAS：84272-85-5，98%)、黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品(CAS：21967-41-9，98%)購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；三氟乙酸(TFA，99%)購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；乙腈(99.5%)購(gòu)于默克化工技術(shù)(上海)有限公司；α-氰基-4-羥基肉桂酸(HCCA)、芥子酸(SA)購(gòu)自布魯克公司。水為去離子水。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制準(zhǔn)確稱量1.00 mg的黃酮類化合物粉末，用70%的乙腈配制成1.00 mg/mL，其他濃度溶液通過對(duì)原溶液進(jìn)行逐級(jí)稀釋得到。配制好的標(biāo)準(zhǔn)品溶液保存在4 ℃條件下，備用。

1.3.2 基質(zhì)溶液的配制稱取HCCA和SA各10 mg，分別溶解在1 mL的AT50溶液(0.1%TFA溶液和乙腈1∶1混合)中；稱取MIL-101(Cr) 5 mg，溶于1 mL去離子水，并將以上基質(zhì)溶液超聲處理10 min。其他濃度的基質(zhì)溶液通過逐級(jí)稀釋獲得。

1.3.3 點(diǎn)樣方法分層點(diǎn)樣法：首先將1 μL的基質(zhì)溶液滴在靶板上，之后在室溫下干燥，然后再將1 μL的待測(cè)樣品溶液滴在基質(zhì)上面，再于室溫下干燥?；旌宵c(diǎn)樣法：將1 μL的基質(zhì)溶液與1 μL的待測(cè)樣品溶液混合后，取1 μL點(diǎn)在靶板上。

1.3.4 樣品的制備取新鮮小鼠血漿200 μL與200 μL 70%的乙腈混合，配制成50%的血漿，精密稱取蘆丁5.00 mg并用1 mL 70%乙腈溶解配制成5 mg/mL，用50%血漿將5 mg/mL的蘆丁稀釋成1 mg/mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 MIL-101(Cr)用作SALDI-MS基質(zhì)性質(zhì)的考察

MIL-101(Cr)用于質(zhì)譜基質(zhì)與傳統(tǒng)基質(zhì)的對(duì)比如圖1所示。傳統(tǒng)基質(zhì)HCCA和SA，由于在激光轟擊下其自身的解離，在低的質(zhì)荷比范圍內(nèi)產(chǎn)生許多背景信號(hào)峰。而MIL-101(Cr)作為固體基質(zhì)時(shí)，在低質(zhì)荷比范圍內(nèi)觀察不到有其自身信號(hào)出現(xiàn)，在對(duì)小分子化合物進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，可以有效地避免背景干擾，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MIL-101(Cr)可用于SALDI的基質(zhì)分析低分子量化合物。

在樣品濃度為1 mg/mL的條件下，以MIL-101(Cr)作為質(zhì)譜基質(zhì)，考察了4種黃酮類物質(zhì)在正離子模式下的檢測(cè)效果，如圖2所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃酮苷類物質(zhì)在激光作用下容易分裂成糖和黃酮苷元(*表示)。在正離子模式下，我們分別測(cè)到了4種苷類在激光下，普遍出現(xiàn)[M+Na]+、[M+Cr-2H]+形式的衍生離子信號(hào)，而4種苷類裂解成的苷元?jiǎng)t容易出現(xiàn)[2M+Cr-2H]+形式的衍生離子信號(hào)。

使用傳統(tǒng)基質(zhì)對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行離子化時(shí)，僅僅在基質(zhì)與分析物共結(jié)晶的某一位置處，才能測(cè)到最佳的SALDI-MS信號(hào)。但對(duì)于MIL-101(Cr)而言，由于均勻的分散性，所以其克服了不同位置信號(hào)強(qiáng)度不同的缺點(diǎn)。如圖2所示，利用傳統(tǒng)基質(zhì)HCCA和SA分別與MIL-101(Cr)作為基質(zhì)對(duì)4種黃酮苷類化合物5-O -甲基維斯阿米醇苷、橙皮苷、蘆丁和黃芩苷進(jìn)行對(duì)比分析檢測(cè)。通過對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，使用MIL-101(Cr)作為新的基質(zhì)背景清晰，無(wú)自身的干擾峰出現(xiàn)。與HCCA相比，MIL-101(Cr)能夠增強(qiáng)5-O -甲基維斯阿米醇苷、蘆丁的信號(hào)值；與SA相比，MIL-101(Cr)能夠增強(qiáng)橙皮苷、蘆丁和黃芩苷的信號(hào)值，且對(duì)蘆丁的檢測(cè)具有較強(qiáng)的增敏效果。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)將開展MIL-101(Cr)-SALDI-MS快速檢測(cè)蘆丁的研究。

圖2 HCCA、SA和MIL-101(Cr)基質(zhì)檢測(cè)黃酮類物質(zhì)質(zhì)譜對(duì)比圖(樣品分別為5-O -甲基維斯阿米醇苷、橙皮苷、蘆丁和黃芩苷；濃度1 mg/mL；激光強(qiáng)度70%；*表示對(duì)應(yīng)的黃酮苷元)

2.2 蘆丁檢測(cè)條件的優(yōu)化

圖3 (a)不同濃度MIL-101(Cr)基質(zhì)檢測(cè)1 mg/mL蘆丁質(zhì)譜對(duì)比圖；(b、c、d、e、f) MIL-101(Cr)對(duì)不同濃度蘆丁的富集效果(蘆丁濃度：b.1 mg/mL；c.500 μg/mL；d.100 μg/mL；e.50 μg/mL；f.1 μg/mL，MIL-101(Cr)濃度為0.5 mg/mL)

此外，不同的點(diǎn)樣方法對(duì)檢測(cè)也有影響。如圖4(a)所示，分層點(diǎn)樣方法測(cè)到的蘆丁[M+Na]+的m/z633 (*表示)質(zhì)譜峰信噪比為666.5，而混合點(diǎn)樣法的質(zhì)譜峰信噪比為48。分層點(diǎn)樣方法測(cè)到的蘆丁的黃酮苷元[2M+Cr-2H]+的m/z655(?表示)質(zhì)譜峰信噪比為1812，而混合點(diǎn)樣法的質(zhì)譜峰信噪比為510。因此，在基質(zhì)點(diǎn)樣方法中，分層點(diǎn)樣法對(duì)蘆丁的檢測(cè)效果最好。主要的原因可能是混合點(diǎn)樣會(huì)包埋很大一部分樣品，從而不能使其離子化，影響檢測(cè)效果。

2.3 血漿樣品中蘆丁的檢測(cè)

我們?cè)谛∈髲?fù)雜的血漿中加入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)其進(jìn)行定性分析。如圖4(b)所示，在3種不同的基質(zhì)下小鼠血漿中的蘆丁被成功地鑒定，其中我們非常明顯檢測(cè)到了m/z633.319的信號(hào)峰，為蘆丁[M+Na]+離子化形式(?表示)。因此，證實(shí)MIL-101(Cr)作為SALDI基質(zhì)的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

圖4 (a)樣品制備方法對(duì)蘆丁檢測(cè)的影響(蘆丁濃度1 mg/mL)；(b)MIL-101(Cr)基質(zhì)和傳統(tǒng)有機(jī)基質(zhì)檢測(cè)血漿中1 mg/mL蘆丁質(zhì)譜圖(HCCA、SA和MIL-101(Cr)濃度均為1 mg/mL；激光強(qiáng)度70%)

2.4 MIL-101(Cr)作為蘆丁檢測(cè)基質(zhì)的反應(yīng)機(jī)理

蘆丁屬于黃酮醇配糖體，可分為片段A黃酮和片段B雙糖分別與MIL-101(Cr)反應(yīng)(圖5(a))。推測(cè)片段A黃酮中有三個(gè)結(jié)合位點(diǎn)可能會(huì)與MIL-101(Cr)發(fā)生交換反應(yīng)，與Cr結(jié)合。具體位點(diǎn)在3-羥基-4-酮、5-羥基-4-酮和3′,4′-二羥基。有研究表明黃酮類化合物-槲皮素可以與Al3+發(fā)生配位反應(yīng)[10]。有文獻(xiàn)表明片段B雙糖中羥基可與對(duì)苯二甲酸中羧基發(fā)生酯化反應(yīng)，這也進(jìn)一步說(shuō)明了MIL-101(Cr)能夠與蘆丁發(fā)生反應(yīng)，并實(shí)現(xiàn)牢固結(jié)合。并且蘆丁最大吸收波長(zhǎng)與和MIL-101(Cr)的吸收波長(zhǎng)靠近激光光源的波長(zhǎng)(355 nm)(圖5(b))，這也有助于蘆丁的解析-電離過程。

圖5 (a)蘆丁的結(jié)構(gòu)式；(b)MIL-101(Cr)和蘆丁的的紫外-可見吸收光譜圖

3 結(jié)論

利用MIL-101(Cr)做SALDI的基質(zhì)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)黃酮類藥物小分子的無(wú)背景干擾檢測(cè)。由于具有π共軛結(jié)構(gòu)，配位不飽和位點(diǎn)和紫外-可見光強(qiáng)吸收特性，MIL-101(Cr)在小分子檢測(cè)方面表現(xiàn)出許多優(yōu)點(diǎn)。對(duì)于已知結(jié)構(gòu)的4種黃酮類化合物，由于蘆丁中黃酮片段和雙糖片段都能與MIL-101(Cr)發(fā)生反應(yīng)，且蘆丁的最大吸收波長(zhǎng)與MIL-101(Cr)相匹配，并據(jù)此建立了蘆丁的分析方法。本文通過方法驗(yàn)證，基于MIL-101(Cr)對(duì)于蘆丁的吸附富集及對(duì)生物樣品中內(nèi)源性大分子的排除，可以實(shí)現(xiàn)血樣中蘆丁的分析。