張 念， 彭怡霖， 陳細(xì)羽， 焦必寧,2,3， 張耀海*,2,3

(1.西南大學(xué)/中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所，重慶 400712;2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部柑桔及苗木質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)測(cè)試中心，重慶 400712;3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部柑桔產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，重慶 400712)

作為一類重要的水溶性色素，花青素廣泛存在于植物的根、莖、葉、花和果實(shí)中，屬于類黃酮化合物，具有抗癌、抗氧化等多種生物功效。目前已知的天然花青素有20多種，常見(jiàn)的有6種，如飛燕草素、矢車菊素、矮牽牛素、天竺葵素、芍藥素和錦葵素等(圖1)[1]?；ㄇ嗨卦谧匀唤缰兄饕蕴擒栈王；?即花色苷)方式存在，花色苷種類眾多，很難建立全部花色苷的檢測(cè)方法。但是將花色苷酸化水解后形成花青素單體后，進(jìn)行檢測(cè)則變得簡(jiǎn)單可行[2]。植物源性食品中花青素的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[3 - 11]、超高效液相色譜法(UPLC)[12,13]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[8 - 11,14]。HPLC法是最常用的方法，具有價(jià)廉、易操作和穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。然而HPLC法存在溶劑用量大、分離度差、耗時(shí)長(zhǎng)等缺點(diǎn)。UPLC法具有高效、分離度高、峰形尖銳、成本低、環(huán)境友好、結(jié)果精確等特點(diǎn)，已逐漸成為食品分析檢測(cè)的有效工具[12,13]。LC-MS聯(lián)用技術(shù)結(jié)合了色譜和質(zhì)譜兩者的優(yōu)點(diǎn)，將色譜的高分離性能和質(zhì)譜的高鑒別特點(diǎn)相結(jié)合，已成為準(zhǔn)確定性檢測(cè)花青素的技術(shù)之一。但LC-MS/MS儀價(jià)格昂貴，難以普及。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)植物源性食品中花青素的研究主要集中于葡萄和一些特色水果，如草莓、黑莓、藍(lán)莓、車?yán)遄?、石榴、覆盆子和黑加侖等，特別是國(guó)外已對(duì)當(dāng)?shù)仄咸哑贩N做了比較詳細(xì)的分析[15 - 22]，但國(guó)內(nèi)還未有UPLC法快速檢測(cè)多種植物源性食品中花青素的相關(guān)報(bào)道，而有關(guān)我國(guó)植物源性食品中花青素也缺乏詳細(xì)系統(tǒng)的研究報(bào)道[18,19]。

圖1 6種花青素的分子結(jié)構(gòu)式

本文在前人研究基礎(chǔ)上，優(yōu)化了植物源性食品中花青素的提取條件，并建立快速、有效的UPLC方法，對(duì)我國(guó)7個(gè)葡萄品種和7種植物源性食品中主要花青素物質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定，分析比較不同植物源性食品中花青素物質(zhì)的種類和含量差異，探究花青素與植物源性食品的相互關(guān)系，旨在充實(shí)植物源性食品功能性成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)，為合理開發(fā)利用植物源性食品資源、提高植物源性食品綜合利用價(jià)值提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑及材料

Waters ACQUITY超高效液相色譜儀(2996 PDA檢測(cè)器，Version 4.1 Empour工作站)，美國(guó)Waters公司；Milli-Q Advantage A10超純水器，美國(guó)Millpore公司；XS205電子天平，PB3002-S/FACT分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司；0.22 μm水相針式濾器，上海安譜科學(xué)儀器有限公司；GENIUS 3漩渦儀，德國(guó)IKA公司；SB 5200DTS超聲波清洗器，寧波新芝生物科技股份有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱器，鄭州科泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

飛燕草色素(純度≥95.0%)、矢車菊色素(純度≥98.0%)、天竺葵色素(純度≥97.0%)，美國(guó)Sigma-Adrich公司；矮牽牛色素(純度≥97.5%)、芍藥素(純度≥97.6%)、錦葵色素(純度≥97.0%)，美國(guó)Chromadex公司；乙腈和甲醇為色譜純，德國(guó)CNW Technologies GmbH公司；乙醇、鹽酸、甲酸為分析純，成都市科龍化工試劑廠。

7個(gè)葡萄品種包括摩爾多瓦、夏黑、巨峰、紅提、美人指、水晶葡萄、陽(yáng)光玫瑰。其中，摩爾多瓦、水晶葡萄和陽(yáng)光玫瑰來(lái)自貴州，夏黑和美人指來(lái)自江蘇，巨峰來(lái)自浙江，紅提來(lái)自廣西。其他7種植物源性食品包括紫薯、紫甘藍(lán)、藍(lán)莓、黑玉米、洋蔥、茄子、血橙，均來(lái)自重慶。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取6種花青素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各5 mg于10 mL容量瓶中，分別用10%鹽酸甲醇溶液溶解并定容至刻度，配制成500 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液，存放于棕色瓶中，于-80 ℃保存，備用。

1.3 樣品前處理

樣品的取樣參考相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[24]，并做一定改進(jìn)。稱取樣品5 g于離心管中，加入25 mL提取液(無(wú)水乙醇+水+鹽酸，體積比為2∶1∶1)，超聲提取30 min；油浴(95 ℃)中水解1 h，取出后冷卻，提取液定容至25 mL。搖勻，靜置，取上清液，經(jīng)0.22 μm微孔水相濾膜過(guò)濾后，上機(jī)檢測(cè)。

加標(biāo)實(shí)驗(yàn)中葡萄的加標(biāo)水平為1 mg/kg和10 mg/kg兩個(gè)水平。分別向5 g樣品中加入100 μL的50 mg/L和100 μL的500 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻備用。前處理如上。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 UPLC條件參考相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[25]，并做相應(yīng)的改進(jìn)：色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18分析柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm，美國(guó)Waters公司)；流動(dòng)相A為1%甲酸水溶液,流動(dòng)相B為1%甲酸乙腈溶液。優(yōu)化后洗脫梯度：0～0.8 min，92%A；0.8～2 min，88%A；2～4 min，82%A；4～4.8 min，80%A；4.8～6 min，75%A；6～7.2 min，70%A；7.2～8 min，55%A；8～8.8 min，80%A；8.8～12 min，92%A。柱溫：35 ℃，流速：0.3 mL/min，進(jìn)樣量：3 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)：530 nm。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品的保留時(shí)間判斷樣品中花青素的組分，并采用不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)樣品與對(duì)應(yīng)的峰面積值間的關(guān)系制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(r2>0.999)，采用積分獲取樣品的峰面積，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品相關(guān)組分含量。

1.4.2 數(shù)據(jù)分析采用Origin 9.0軟件繪圖、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。所有樣品均采用3次平行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果以平均值±SD值表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件的優(yōu)化

相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)(NY/T 2640-2014)《植物源性食品中花青素的測(cè)定》[25]采用HPLC法，相應(yīng)的色譜柱是C18分析柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)，分析時(shí)間達(dá)30 min。本文將HPLC法換成UPLC法，儀器條件優(yōu)化后的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見(jiàn)圖2。6種花青素在5 min內(nèi)達(dá)到較好的分離，盡管芍藥素和錦葵色素未達(dá)到完全的基線分離，但分離效果也好于相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[25]。與傳統(tǒng)的HPLC法相比，UPLC法的分離時(shí)間只有原來(lái)的1/3[2,19]，大大縮短了分析時(shí)間。

圖2 6種花青素標(biāo)準(zhǔn)的色譜圖

2.2 樣品前處理的優(yōu)化

花色苷酸化水解成花青素單體，目前大多采用酸化乙醇體系[2,20]，我們采用無(wú)水乙醇+水+鹽酸(體積比為2∶1∶1)提取體系[2]。實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)考察了油浴溫度和油浴時(shí)間對(duì)葡萄(夏黑)中花青素提取效率的影響，結(jié)果如圖3所示。油浴時(shí)間固定在60 min，增加油浴溫度(選取80、85、90、95、100、110和120 ℃)，隨著油浴溫度的升高(80到90 ℃)，花青素提取效率顯著升高，90～100 ℃趨于平緩，95 ℃達(dá)到最佳，而后逐漸降低；過(guò)高的溫度(大于110 ℃)對(duì)花青素提取是不利的。油浴溫度固定在95 ℃，增加油浴時(shí)間(選取30、45、60、75和90 min)，隨著油浴時(shí)間的延長(zhǎng)(30到60 min)，花青素提取效率逐漸升高，60 min達(dá)到最佳，而后逐漸降低。因此我們選擇油浴溫度95 ℃和油浴時(shí)間60 min。

圖3 反應(yīng)溫度(A)和反應(yīng)時(shí)間(B)對(duì)提取效率的影響

2.3 方法評(píng)價(jià)

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表1。6種花青素在0.1～25 mg/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.999以上。儀器檢出限(S/N=3)為0.02～0.05 mg/L，定量限(S/N=10)為0.05～0.1 mg/L。保留時(shí)間和峰面積的日內(nèi)偏差分別為0.5%～1.6%和0.8%～2.2%；日間偏差分別為1.3%～2.3%和3.4%～6.8%。

表1 6種花青素的線性范圍、線性方程、檢出限和定量限

采用對(duì)葡萄加標(biāo)的方法進(jìn)行回收率和精密度實(shí)驗(yàn)。分別對(duì)樣品進(jìn)行兩個(gè)水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，以“1.3” 的方法對(duì)樣品進(jìn)行前處理，平行測(cè)定6次，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(表2)。結(jié)果表明：在葡萄樣品中，2種添加水平的回收率在82.3%～93.5%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在1.4%～6.8%之間。本方法有較好的準(zhǔn)確度和精密度，滿足葡萄中花青素定量分析的要求。此方法的檢出限為0.1～0.2 mg/kg，定量限為0.2～0.5 mg/kg。

表2 6種花青素的平均回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)、檢出限(LOD)和定量限(LOQ)

2.4 實(shí)際樣品測(cè)定

抽取14種植物源性食品，采用上述方法處理后測(cè)定，結(jié)果列于表3。

表3 14種植物源食品中花青素的含量(mg/kg鮮重)

2.5 植物源性食品中花青素含量

總體上，累計(jì)檢出6種花青素。在14種植物源性食品中，紫甘藍(lán)中矢車菊色素最豐富，最高可達(dá)323.81 mg/kg；摩爾多瓦中錦葵色素含量較高，可達(dá)167.87 mg/kg；藍(lán)莓中的飛燕草色素含量最高可達(dá)121.19 mg/kg；紫薯中芍藥素含量較高，可達(dá)61.07 mg/kg；夏黑中矮牽牛色素含量高達(dá)55.96 mg/kg；藍(lán)莓中天竺葵色素200.42 mg/kg。14種植物源性食品平均含量呈以下規(guī)律：矢車菊色素>錦葵色素>飛燕草色素>天竺葵色素>芍藥素>矮牽牛色素。

14種植物源性食品中的花青素含量變幅大，總含量變幅從2.20 mg/kg到477.42 mg/kg。藍(lán)莓最高，紫甘藍(lán)、摩爾多瓦、夏黑和茄皮其次?；ㄇ嗨剌^高的品種，依次為紫薯、黑玉米、血橙、巨峰、紅提(20 mg/kg到80 mg/kg)?；ㄇ嗨剌^少的品種，依次為美人指、洋蔥(10 mg/kg到20 mg/kg)?；ㄇ嗨刈畹偷钠贩N如水晶葡萄、陽(yáng)光玫瑰均低于5 mg/kg。

不同水果和蔬菜中的花青素種類有顯著性差異。天竺葵色素僅在紫薯、藍(lán)莓、茄皮中檢出，矢車菊色素在13種植物源性食品中均有檢出(除茄皮)。摩爾多瓦、夏黑、巨峰檢出5種花青素(除天竺葵色素)；美人指檢出飛燕草色素、矢車菊色素、芍藥素、錦葵色素等4種花青素；紅提檢出飛燕草色素、矢車菊色素、芍藥素等3種花青素；水晶葡萄和血橙檢出飛燕草色素、矢車菊色素等2種花青素；陽(yáng)關(guān)玫瑰和洋蔥只檢出矢車菊色素1種花青素。紫甘藍(lán)和黑玉米檢測(cè)出矢車菊色素、矮牽牛色素、芍藥素等3種花青素。紫薯矢車菊色素、矮牽牛色素、芍藥素、天竺葵色素等4種花青素。茄皮中只檢測(cè)出飛燕草色素、矮牽牛色素、天竺葵色素等3種花青素。紫薯檢測(cè)出矢車菊色素、矮牽牛色素、芍藥素、錦葵色素、天竺葵色素等5種花青素。藍(lán)莓檢測(cè)出飛燕草色素、矢車菊色素、矮牽牛色素、芍藥素、錦葵色素、天竺葵色素等6種花青素。

花青素的檢測(cè)方法列于表4。本文采用UPLC-PDA方法快速檢測(cè)植物源性食品中6種花青素，所需時(shí)間僅為12 min，僅為現(xiàn)有HPLC方法的4/30至3/7[3 - 11]，其檢測(cè)限低于絕大數(shù)現(xiàn)有方法，回收率良好。

表4 本文方法與其它測(cè)定食品中花青素的方法的比較

(續(xù)表4)

3 結(jié)論

植物源性食品含有豐富的花青素物質(zhì)，由于品種、生長(zhǎng)環(huán)境和基因差異導(dǎo)致花青素物質(zhì)的含量存在明顯差異。藍(lán)莓中花青素含量最豐富，檢測(cè)出的種類也最多。不同植物源性食品的花青素含量變幅大，不同植物源性食品的花青素種類有顯著性差異。本研究利用改進(jìn)的前處理技術(shù)，結(jié)合UPLC技術(shù)，更快速、高效地檢出花青素物質(zhì)，并分析比較了不同植物源性食品中花青素物質(zhì)的種類和含量差異，旨在為植物源性食品的健康價(jià)值評(píng)估提供了數(shù)據(jù)支持，這對(duì)花青素功能成分開發(fā)利用具有重要意義。