楊 萌， 魏 星， 張 璇， 姜 澤， 陳明麗*， 王建華

(東北大學(xué)理學(xué)院化學(xué)系，遼寧沈陽 110819)

鎘是一種用途較為廣泛的金屬，屬于人體非必需元素。人體內(nèi)的鎘主要從外界環(huán)境中攝取，且一旦進(jìn)入體內(nèi)就難以代謝排出，對鎘污染地區(qū)的人類與動物的健康造成了很大的威脅[1]。鎘主要通過呼吸和食物鏈等多種方式進(jìn)入人體[2]，長期處于鎘污染的環(huán)境中，人體會出現(xiàn)不同的病理反應(yīng)。長期接觸鎘的人群中可出現(xiàn)急性胃腸道和呼吸道等疾病[3]。很多鎘中毒引起的病理反應(yīng)被相繼報道，這引起許多學(xué)者研究鎘的毒性機(jī)理[4]。研究結(jié)果表明：鎘經(jīng)消化道和呼吸道進(jìn)入人體后，會對人體的器官造成不同程度的損傷。鎘不僅可以影響人體的消化道，改變消化道的菌群數(shù)量并損害它們正常的代謝活動；鎘附著于腸壁可能造成炎癥反應(yīng)，對腸道細(xì)胞造成一定的損傷[5]。鎘誘導(dǎo)人體患癌的原因有很多，例如相關(guān)基因突變、免疫細(xì)胞的DNA損傷，以及免疫功能的改變是造成癌癥最直接的原因。此外，氧化應(yīng)激反應(yīng)、激素水平失衡等都與鎘誘導(dǎo)癌癥的發(fā)生發(fā)展有一定的關(guān)聯(lián)[6,7]。

細(xì)胞具有復(fù)雜的基質(zhì)，包括高含量的有機(jī)化合物，例如蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等。通常，對于血液等生物樣品中痕量元素的檢測，需要將樣品用有氧化特性的濃酸進(jìn)行消解。但處理過程繁瑣、耗時耗力，還可能導(dǎo)致分析物損失或引入其他污染物[8,10]。文獻(xiàn)報道[11]生物樣品中金屬含量測定的前處理方法包括濕法消解和微波消解。石墨爐原子吸收光譜法在痕量金屬元素定量檢測方面具有突出的優(yōu)勢[12,13]。本文提出了石墨爐原子吸收光譜法直接測定細(xì)胞中重金屬鎘的方法，且測定時細(xì)胞(包括血細(xì)胞)不用再進(jìn)行其他的樣品預(yù)處理，可直接進(jìn)行測定。方法所需樣品量較少，幾百個細(xì)胞即可以滿足測定需要。本方法還可以用于人全血血細(xì)胞中鎘的直接測定，與已報道的石墨爐原子吸收光譜法檢測全血中重金屬的方法[14]相比，本方法所需要樣品量少，幾微升血液就可以滿足測定要求。本研究為人體血液中鎘元素的直接檢測提供了方法保障和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為兒童重金屬中毒和急性鎘中毒人群的血液測定提供了可能性。

1 實驗部分

1.1 主要儀器及試劑

GGX-200原子吸收光譜儀(北京海光儀器公司)；HIRAYAMA HV-50自動高壓滅菌器(日本，Hirayama)；SW-CJ-1FD潔凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；TGL-16G臺式高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；單盤電子天平(北京賽多利斯儀器有限公司)；37 ℃恒溫CO2培養(yǎng)箱(美國，Thermo Electron公司)。

DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)；鏈霉素(Streptomycin，美國Invitrogen公司)；青霉素(Penicillin，美國Invitrogen公司)；胰酶(Amresco，美國Hyclone公司)；胎牛血清(FBS，美國Hyclone公司)；NaCl、KCl、Na2HPO4·12H2O(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；NH4NO3(沈陽新西試劑廠)；(NH4)H2PO4、Mg(NO3)2(天津博迪化工中)。所有試劑除特別說明外皆為分析純，實驗用水為去離子水(18 MΩ·cm)。實驗器皿均使用5%HNO3浸泡過夜后，用去離子水清洗干凈。

1.2 實驗所用溶液的配制

鎘儲備溶液(1 g/L)：取0.1000 g鎘粒(高純)用12.5 mL 8 mol/L的HNO3溶解，用1%的HNO3定容至100 mL。鎘標(biāo)準(zhǔn)工作溶液由儲備溶液逐級稀釋得到。含F(xiàn)BS的DMEM高糖培養(yǎng)基：將5 mL的雙抗與50 mL的FBS加入到500 mL DMEM高糖培養(yǎng)基中，緩慢搖勻。采用相同方法配制不含F(xiàn)BS的DMEM高糖培養(yǎng)基。在無菌超潔凈臺內(nèi)，用無菌濾膜(0.22 μm)過濾除去培養(yǎng)基內(nèi)細(xì)菌和不溶性雜質(zhì)，放置4 ℃冰箱內(nèi)保存，待用。含鎘培養(yǎng)基：用過濾后的無FBS培養(yǎng)基將鎘溶液逐級稀釋到使用濃度，放置4 ℃冰箱保存，待用。

1.3 細(xì)胞的培養(yǎng)與孵育

本文選用HepG2(人肝癌細(xì)胞)細(xì)胞。細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液中，且在37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，每隔24 h左右需更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞數(shù)密度漲至80%～90%時，用胰酶進(jìn)行消化，離心清洗后，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

取兩瓶對數(shù)生長期的細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)徹底清洗。其中，一瓶加入含鎘(2 mg/L)的無FBS培養(yǎng)基，另一瓶加入FBS培養(yǎng)基作為對照組，孵育6 h后，經(jīng)胰酶消化，離心清洗，最后加入1 mL的PBS，并用血細(xì)胞計數(shù)板進(jìn)行計數(shù)，將計數(shù)后的細(xì)胞離心，移去PBS以備使用。

1.4 原子吸收光譜直接測定細(xì)胞中的鎘

將計數(shù)的細(xì)胞逐級稀釋后，將稀釋的細(xì)胞與2 μL的Mg(NO3)2基體改進(jìn)劑同時加入石墨爐內(nèi)，在灰化溫度為350 ℃和原子化溫度為1 900 ℃的條件下，用石墨爐原子吸收光譜直接測定細(xì)胞中鎘的含量。測定條件：用氘背景校正的GGX-200原子吸收光譜儀進(jìn)行檢測，鎘空心陰極燈(中國有色金屬研究院)作為光源(波長228.8 nm)，工作電流為5 mA，狹縫寬度為0.4 nm。峰面積(吸光度積分)值用于定量。石墨爐原子吸收光譜測定的溫度程序列表1中。

表1 石墨爐原子吸收光譜的溫度程序

2 結(jié)果與討論

2.1 肝癌細(xì)胞數(shù)量的確定

細(xì)胞中基體十分復(fù)雜，特別是有機(jī)物質(zhì)，在用石墨爐原子吸收光譜測定時會對鎘產(chǎn)生很大信號干擾，而選擇合適細(xì)胞數(shù)可降低背景吸收。實驗選取用兩組細(xì)胞數(shù)密度為80%左右的細(xì)胞(一組經(jīng)鎘孵育培養(yǎng)的細(xì)胞，一組為正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為對照)，PBS清洗后進(jìn)行后續(xù)條件考察。細(xì)胞孵育6 h后，用胰酶進(jìn)行消化，再用PBS進(jìn)行3次離心清洗，然后加入1 mL的PBS，用細(xì)胞計數(shù)板進(jìn)行計數(shù)，離心去掉PBS。將計數(shù)過的細(xì)胞用去離子水逐級稀釋至一定濃度。用移液槍吸取10 μL細(xì)胞溶液時，吸取的細(xì)胞數(shù)量分別為200、400、800、1 600、4 000個左右。將對照組和孵育組細(xì)胞分別用石墨爐原子吸收光譜直接測定，考察其基體條件的影響，結(jié)果如圖1所示。可以看出隨著細(xì)胞數(shù)的增多，細(xì)胞基本信號的吸光度越大，在進(jìn)樣為200個和400個細(xì)胞的情況下，未經(jīng)鎘孵育的細(xì)胞基體空白接近純水，細(xì)胞個數(shù)為800、1 600和4 000時，細(xì)胞基體對檢測的影響較大。因此，實驗中采用的進(jìn)樣數(shù)為400個細(xì)胞。

圖1 細(xì)胞個數(shù)對鎘測定的影響

2.2 基體改進(jìn)劑及用量的選擇

原子吸收測定復(fù)雜樣品時，加入基體改進(jìn)劑可以提高灰化溫度，減少基體干擾，避免待測元素在原子化階段損失。細(xì)胞因其具有復(fù)雜的成分，因此采用合適的基體改進(jìn)劑，以消除復(fù)雜基體成分的干擾?？疾炝诉M(jìn)樣量為2 μL時，質(zhì)量濃度為0.06%的Mg(NO3)2、1.0%的NH4NO3、1.0%的(NH4)H2PO4等基體改進(jìn)劑對檢測結(jié)果的影響。含鎘細(xì)胞(2 mg/L隔孵育)和空白細(xì)胞按最佳狀況培養(yǎng)，取10 μL細(xì)胞進(jìn)樣(含有約400個細(xì)胞)，2 μL的基體改進(jìn)劑，測得的不同基體改進(jìn)劑與對細(xì)胞中鎘的測定的影響結(jié)果，如圖2所示。從圖中可知，在一定條件下，適當(dāng)?shù)幕w改進(jìn)劑確實會改善測定細(xì)胞中鎘的效果。Mg(NO3)2作為基體改進(jìn)劑時，測定的吸光度信號較大，且原子吸收峰完整。故后續(xù)實驗選擇Mg(NO3)2作為基體改進(jìn)劑。

圖2 基體改性劑對鎘測定的影響

在確定的細(xì)胞數(shù)與基體改進(jìn)劑的情況下，對基體改進(jìn)劑的用量進(jìn)行了考察。實驗結(jié)果表明，0.06%的Mg(NO3)2溶液從1 μL增加到2 μL的過程中，吸光度隨基體改進(jìn)劑體積的增加而逐漸增加，但繼續(xù)增加基體改進(jìn)劑體積，吸光度信號會隨用量增加而逐漸降低，結(jié)果如圖3所示。從圖中可以看出，當(dāng)0.06%的Mg(NO3)2溶液用量為2 μL時，吸光度最大。

圖3 基體改進(jìn)劑用量對鎘測定的影響

2.3 原子化與灰化溫度的選擇

在進(jìn)樣量大約400個細(xì)胞，2 μL 0.06%的Mg(NO3)2溶液作為基體改進(jìn)劑的條件下，逐漸改變原子化或灰化溫度，以得到最佳的原子吸收測定條件。如圖4所示，灰化溫度為350 ℃、原子化溫度為1 900 ℃時，吸光度最大，是最佳的原子吸收檢測條件。

圖4 灰化溫度(a)和原子化溫度(b)對鎘測定的影響(進(jìn)樣量10 μL，2 mg/L Cd孵育的細(xì)胞約400個)

2.4 工作曲線與檢出限

在最佳實驗條件下，將鎘標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級稀釋成質(zhì)量濃度為1、2、3、4、5 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣測定，并用HepG2細(xì)胞和2 μL 0.06%的Mg(NO3)2基體改進(jìn)劑匹配，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖5)。對空白樣品(含有大約400個細(xì)胞和2 μL 0.05%的Mg(NO3)2)進(jìn)行連續(xù)9次測定，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.06%。用3倍空白的標(biāo)準(zhǔn)偏差計算得到方法的檢出限為1.8 ng/L，方法線性范圍為1.0～5.0 μg/L。

圖5 細(xì)胞中鎘測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 原子吸收光譜法直接測HepG2中的鎘含量

為了驗證該方法在測定細(xì)胞中痕量鎘的適用性，將細(xì)胞分別與1 mg/L和2 mg/L的鎘孵育6 h，在最佳實驗條件下，將細(xì)胞稀釋到要求濃度，對孵育后的細(xì)胞直接檢測，測定結(jié)果如表2所示。從表中可以看出，經(jīng)與1 mg/L鎘孵育后，細(xì)胞中可以明顯檢出鎘，大約400個細(xì)胞中鎘的質(zhì)量濃度為1.947±0.086 μg/L；經(jīng)2 mg/L鎘孵育的細(xì)胞中，鎘的質(zhì)量濃度為4.071±0.044 μg/L，多次測定的RSD低于6.0%，加標(biāo)回收率在90%～105%之間。

表2 HepG2細(xì)胞中鎘的檢測結(jié)果

為了進(jìn)一步驗證該方法的準(zhǔn)確性，平行取兩組細(xì)胞分別直接測定和消解后測定。用含500 μg/L鎘的無FBS培養(yǎng)基孵育培養(yǎng)細(xì)胞6 h，將培養(yǎng)后的細(xì)胞，經(jīng)過胰酶消化、PBS 3次離心清洗，加入1 mL的PBS，通過血球計數(shù)板計數(shù)得大約為6.0×106(n=3)，將計數(shù)后的細(xì)胞一半濕法消解后，用石墨爐原子吸收光譜檢測；另一半直接進(jìn)樣進(jìn)行石墨爐原子吸收光譜檢測。用本方法直接測得的細(xì)胞中鎘的總含量約為56.4±1.2 ng(400個細(xì)胞，0.7514±0.0373 μg/L)，濕法消解測得細(xì)胞中鎘的總含量為58.8±1.8 ng，經(jīng)檢驗兩組數(shù)據(jù)沒有顯著差異。

2.6 原子吸收光譜法直接測人全血中的鎘的含量

用無鎘的人全血樣品作為基體匹配，對實驗條件進(jìn)行了優(yōu)化，在最佳條件下對人全血細(xì)胞中痕量的鎘進(jìn)行了測定。取全血10 μL，加入1 mL PBS混勻并離心(3 000 r/min離心10 min，3次)。去掉上清溶液，留取血細(xì)胞，經(jīng)PBS適當(dāng)稀釋后作為細(xì)胞空白基體。鎘孵育的人全血紅細(xì)胞用同樣方式處理。當(dāng)進(jìn)樣量為10 μL(約為4 000個血細(xì)胞)時，加入3 μL基體改進(jìn)劑，鎘的線性檢測范圍為1.4～5.0 μg/L，對4 μg/L的鎘標(biāo)準(zhǔn)溶液與空白溶液(標(biāo)準(zhǔn)溶液包含約為40 000個血細(xì)胞與3 μL NH4NO3基體改進(jìn)劑)連續(xù)測定9次得到兩者的RSD分別為0.39%和0.30%，均小于2.0%，方法的檢出限為0.14 μg/L。隨后，對不同濃度鎘孵育的人全血細(xì)胞中的鎘進(jìn)行了測定，并對樣品進(jìn)行了加標(biāo)回收實驗，回收率在90%～107%之間，結(jié)果如表3所示。結(jié)果表明，該方法可以用于人血液細(xì)胞樣品中痕量鎘的直接測定，取少量全血即可滿足測定要求，能有效減免患者痛苦，尤其是對嬰幼兒重金屬檢測提供可靠方法，有可能在臨床血液重金屬檢測中得到應(yīng)用。

表3 人血細(xì)胞中鎘的檢測結(jié)果

3 結(jié)論

建立了石墨爐原子吸收光譜直接測定細(xì)胞中鎘含量的方法。該方法對細(xì)胞中鎘含量測定的檢出限(3σ)為1.8 ng/L，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.06%(n=9)。探討了石墨爐原子吸收光譜法直接測定人全血細(xì)胞中鎘的方法，只需幾微升全血樣品，不必靜脈抽取，對人體傷害小，能有效減免患者痛苦，尤其是對嬰幼兒重金屬檢測提供可參考方案，有望在臨床血液重金屬檢測中得到應(yīng)用。