高飛，胡澤斌，段然慧，左甜甜，董喆，黃杰

Fuchs 角膜內(nèi)皮營養(yǎng)不良（Fuchs endothelial corneal dystrophy，F(xiàn)ECD）又稱為滴狀角膜，是角膜內(nèi)皮進行性的損傷。角膜后彈力層增厚，細胞外基質(zhì)贅疣沉積，最終發(fā)展成為角膜內(nèi)皮失代償為特征的進行性遺傳角膜疾病[1]。在美國，40 歲以上人口約有 5% 患有此病。在亞洲，大約 70%Fuchs 角膜內(nèi)皮營養(yǎng)不良患者含有TCF4 的重復(fù)序列擴增，而且含有 CTG 重復(fù)擴增的患者表型更嚴重。這一擴增將使患病風(fēng)險增加 30 倍以上[2]。CTG 重復(fù)數(shù)目小于或等于 37 為正常，在 37 ～ 52 之間表明與 Fuchs 角膜內(nèi)皮營養(yǎng)不良相關(guān)，超過 52 為 Fuchs 角膜內(nèi)皮營養(yǎng)不良高風(fēng)險[3-4]。以上重復(fù)序列擴增所導(dǎo)致的疾病在臨床診斷中面臨著巨大的挑戰(zhàn)，表型相似性高。根據(jù)其臨床癥狀、影像學(xué)表現(xiàn)等輔助檢查進行分型確診面臨非常多的困難，只有通過基因突變檢測才可區(qū)分各種突變型別?；蛟\斷是確診和分型的金標準。TCF4 基因 CTG 重復(fù)擴增所導(dǎo)致的角膜營養(yǎng)不良的發(fā)病進程約為 10年以上，而角膜移植是挽救患者視力的唯一有效方法。因此，盡早進行基因篩查以明確病因是治療 Fuchs 角膜內(nèi)皮營養(yǎng)不良的有效手段。TCF4 基因突變類型與發(fā)病關(guān)系如圖1 所示。

圖1 TCF4 基因型與發(fā)病關(guān)系[3]

據(jù)國內(nèi)外報道，F(xiàn)ECD 是白內(nèi)障手術(shù)后角膜內(nèi)皮細胞功能失代償?shù)闹匾騕5]，導(dǎo)致術(shù)后效果不理想。因此在臨床行白內(nèi)障手術(shù)前進行基因篩查以排除 FECD 是有必要的。鑒于該類患者的樣本獲得困難且具有研究意義，對 FECD臨床樣本進行永生化細胞系的培養(yǎng)以獲得穩(wěn)定的研究用樣本來源是至關(guān)重要的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來源 通過與中南大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)研究中心合作獲取臨床樣本，患者均簽署知情同意書。樣本信息詳見表1。

表1 8 例細胞株樣本信息

1.1.2 試劑耗材 核酸提取用試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司；永生化細胞系建立所需試劑購自美國 Gibco Life Technologies 公司；永生化細胞系驗證所需試劑盒購自廣州市達瑞生物技術(shù)股份有限公司；NanoDrop one 微量分光光度計為美國 ThermoFisher 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 EBV 病毒液制備 采用 RPMI1640 + 1 × 雙抗培養(yǎng)液培養(yǎng) B95-8 細胞至 100 ml，饑餓細胞 5 ～ 7 d 后于-80 ℃ 冰箱凍存，反復(fù)凍融 3 次后，2000 r/min 條件下離心 10 min，取離心后的上清液用 0.2 μm 濾膜過濾并放置于 -80 ℃ 冰箱待用。

1.2.2 分離 Fuchs 角膜內(nèi)皮營養(yǎng)不良患者淋巴細胞 使用肝素抗凝管采集患者外周靜脈全血 5 ml 并轉(zhuǎn)移至離心管中，分別吸取 2 ml RPMI1640 培養(yǎng)基及 4 ml 淋巴細胞分離液加入含有外周血的離心管內(nèi)，充分混勻后在2500 r/min 條件下離心 15 min，然后吸取白色的淋巴細胞層至另一試管中混勻備用。

1.2.3 淋巴細胞的永生化培養(yǎng)轉(zhuǎn)化 使用 RPMI1640 培養(yǎng)基將分離的淋巴細胞洗滌 2 次后在 1000 r/min 條件下離心 15 min，棄去上清并加入 EBV 病毒液 1.5 ml 及環(huán)孢菌素 A 0.2 ml，置于 5% 二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)于 37 ℃ 培養(yǎng)24 h 后使用顯微鏡觀察，期間根據(jù)細胞聚集生長的狀況進行加液或換液，當永生化細胞的生長數(shù)量達到 3 × 106個/ml后，將細胞吹勻備用。

1.2.4 永生化細胞系的凍存 細胞凍存前 24 h，需進行細胞換液；將轉(zhuǎn)化完成的細胞收集到離心管后，于 1000 r/min離心 10 min，棄去上清；分裝于凍存管中，每管需加入 1 ml凍存液，置于 -70 ℃ 2 h 后，于液氮中長期保存。

1.2.5 永生化細胞系的質(zhì)量及穩(wěn)定性觀察 凍存細胞復(fù)融并傳 6 代后鏡下觀察細胞形態(tài)及細胞生長環(huán)境。

1.2.6 永生化細胞系的分子生物學(xué)驗證 將 Fuchs 角膜內(nèi)皮營養(yǎng)不良永生化細胞系取出復(fù)蘇后提取 DNA，再進行熒光 PCR-毛細管電泳檢測。

2 結(jié)果

2.1 永生化細胞系的質(zhì)量及穩(wěn)定性控制結(jié)果

8 份細胞株樣本在復(fù)蘇并培養(yǎng) 7 d 時，在顯微鏡下可見表面光滑的淋巴細胞發(fā)生增大和聚團，且細胞周邊有胞質(zhì)突出的現(xiàn)象（圖2）；30 d 及凍融傳代后，顯微鏡下可見淋巴細胞生長為密集的細胞團且外壁有不規(guī)則毛刺狀（圖3、圖4），表明細胞成功轉(zhuǎn)化為淋巴母細胞樣永生化細胞。

圖2 永生化轉(zhuǎn)化第 7 天結(jié)果（40 × 顯微鏡下觀察）

圖3 永生化轉(zhuǎn)化第 30 天結(jié)果（40 × 顯微鏡下觀察）

圖4 復(fù)融并傳 6 代后結(jié)果（40 × 顯微鏡下觀察）

2.2 永生化細胞系分子生物學(xué)驗證結(jié)果

提取 8 份永生化細胞株樣本的 DNA，提取的 DNA采用 NanoDrop 核酸蛋白測定儀測定OD260/OD280和OD260/OD230值，確定 DNA 的質(zhì)量和濃度；同時，對樣本進行熒光 PCR-毛細管電泳法檢驗分析，分析結(jié)果顯示全部陽性樣本的堿基序列與樣本 CTG 重復(fù)數(shù)一致。檢測結(jié)果見表2、圖5。

表2 8 份 FECD 樣本永生化驗證結(jié)果

圖5 8 份 FECD 樣本的永生化細胞系熒光 PCR-毛細管電泳結(jié)果

3 討論

永生化淋巴細胞系是一類包含人類全基因組用于人類基因研究的重要細胞資源，也是人類遺傳疾病資源保存與應(yīng)用的技術(shù)手段及首選方法[6]。目前，全球較大規(guī)模的細胞遺傳資源保藏機構(gòu)包括美國國家人類基因突變細胞中心、英國生物樣本庫和美國國立衛(wèi)生研究院等，上述機構(gòu)均采用永生化轉(zhuǎn)化技術(shù)作為最主要的遺傳資源保存方法[7]。永生化細胞系具備一些明顯的優(yōu)勢：轉(zhuǎn)化所需樣本量少、轉(zhuǎn)化所需實驗設(shè)備簡單、轉(zhuǎn)化方法規(guī)范易操作；更為重要的是采用取之不盡的人類細胞資源用于遺傳性疾病研究的這一方式具有一定的創(chuàng)新性和實用性。

研究采集的樣本是經(jīng)肝素鈉抗凝的 FECD 各突變型別的人外周血；經(jīng)反復(fù)實驗明確了低密度接種法，即采用轉(zhuǎn)化細胞的密度為 1 × 105個/ml，該密度可以減少 T、B 細胞的接觸，從而增加細胞轉(zhuǎn)化的成功率，具有一定的創(chuàng)新性；同時，通過加入環(huán)孢菌素 A 進一步抑制 T 細胞活性，最終成功建立了包含 FECD 各突變類型的永生化細胞系并完成了永生化細胞的傳代、凍存及復(fù)蘇。同時對建系成功的永生化細胞抽提 DNA 后進行了可準確讀取 CTG 重復(fù)數(shù)的熒光 PCR-毛細管電泳法驗證，并進行細胞顯微鏡下觀察，結(jié)果表明永生化狀態(tài)下的TCF4 基因組 DNA 的遺傳穩(wěn)定，可作為穩(wěn)定的研究用樣本資源為相關(guān)科研機構(gòu)的參考物質(zhì)研制及后續(xù)的 FECD 臨床檢驗與疾病篩查奠定堅實的基礎(chǔ)。