陳若冰，魏秀娟，莊曉純，黃國彬,4，陳小蕓,4，陳一村

（1．汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院靜脈用藥調(diào)配中心，廣東 汕頭 515041；2．汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，廣東 汕頭 515041；3．潮汕職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 普寧 515300；4．廣東維安檢測(cè)科技有限公司，廣東 普寧 515300）

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性炎癥性自身免疫性疾病，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)滑膜炎、關(guān)節(jié)軟骨破壞、關(guān)節(jié)功能障礙等[1]。中醫(yī)稱為“痹癥”、“頑痹”等[2]。癥狀為關(guān)節(jié)的疼痛、腫脹、僵硬，甚者伴有心血管、肺、骨骼等并發(fā)癥[3]。由于發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前尚未有能夠完全治愈的藥物。獨(dú)活寄生湯由獨(dú)活、桑寄生、杜仲、牛膝、細(xì)辛、秦艽、茯苓、川芎、肉桂、防風(fēng)、人參、甘草、當(dāng)歸、干地黃、芍藥多味中藥組成[4]。臨床常用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病[5]。獨(dú)活、桑寄生為獨(dú)活寄生湯的君藥藥對(duì)，是本復(fù)方制劑的重要組成部分。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對(duì)獨(dú)活-桑寄生藥對(duì)進(jìn)行分析，探討這一藥對(duì)的藥效物質(zhì)、作用靶點(diǎn)和相關(guān)通路，預(yù)測(cè)其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 查找獨(dú)活、桑寄生的有效成分和靶點(diǎn)

在TCMSP數(shù)據(jù)庫（https://tcmsp-e.com/）查找獨(dú)活、桑寄生兩味中藥的成分和靶點(diǎn)。篩選條件：口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，藥物相似性（drug likenes，DL）≥0.18。通過UniProt數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/），限定物種為“Homo Sapiens”，將得到的靶蛋白轉(zhuǎn)換成基因，刪除重復(fù)基因，得到獨(dú)活-桑寄生藥對(duì)的靶點(diǎn)。導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件，繪制獨(dú)活-桑寄生靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2 查找成分—疾病的交集靶點(diǎn)

在人類基因數(shù)據(jù)庫GeneCards（https://www.genecards.org/） 和 DrugBank數(shù)據(jù)庫 （https://go.drugbank.com/）中以“rheumatoid arthritis”為關(guān)鍵詞，物種為“Homo Sapiens”，檢索RA的疾病靶點(diǎn)。利用在線工具Venny2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）繪制韋恩圖，得到RA與獨(dú)活-桑寄生的交集靶點(diǎn)。

1.3 構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

在 STRING 數(shù) 據(jù)庫 （https://string-db.org/）中，輸入交集靶點(diǎn)，物種選擇“Homo sapiens”，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，等值置信度為0.7，其余參數(shù)為默認(rèn)值。保存結(jié)果中的csv文件，導(dǎo)入Cytoscape 3.2.7軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，根據(jù)Degree值的大小對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化分析。

1.4 GO基因注釋和KEGG通路富集分析

登錄David數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/），物種選擇“Homo Sapiens”，對(duì)共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG富集分析。將結(jié)果整理后，通過微生信平臺(tái)（http://www.bioinformatics.com.cn/）繪制柱形圖和氣泡圖進(jìn)行可視化分析。

1.5 分子對(duì)接驗(yàn)證成分與靶點(diǎn)的結(jié)合能力

將有效活性成分與核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接。在PubChem網(wǎng)站（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）上下載有效成分的3D結(jié)構(gòu)（sdf格式），然后在RCSB蛋白數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）下載腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、蛋白激酶B（又稱Akt1激酶）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）的結(jié)構(gòu)（pdb格式），分別導(dǎo)入薛定諤軟件Maestro 11.1中，先對(duì)蛋白分子進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化、去除水分子、能量最小化，然后以小分子配體所在的位置為對(duì)接位點(diǎn)，進(jìn)行分子對(duì)接，得到對(duì)接分?jǐn)?shù)。

2 結(jié)果

2.1 獨(dú)活-桑寄生藥的有效成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過檢索得到獨(dú)活-桑寄生有效活性成分11個(gè)（表1），獨(dú)活的有效成分靶點(diǎn)54個(gè)，桑寄生的有效成分靶點(diǎn)145個(gè)，刪除重復(fù)項(xiàng)后得到獨(dú)活-桑寄生靶點(diǎn)170個(gè)。圖1為有效成分與靶點(diǎn)的關(guān)系圖，共有179個(gè)節(jié)點(diǎn)，251條邊。根據(jù)Degree值設(shè)置節(jié)點(diǎn)的大小。Degree值排名前5的化合物有槲皮素、β-谷甾醇、O-乙酰二氫歐山芹酯、當(dāng)歸酮和歐前胡素。其中，槲皮素（SJS1）在網(wǎng)絡(luò)中起著重要的作用，與146個(gè)靶點(diǎn)有關(guān)。成分DH9沒有對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，在網(wǎng)絡(luò)中未體現(xiàn)。

圖1 獨(dú)活-桑寄生成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

表1 獨(dú)活-桑寄生有效成分

2.2 查找疾病靶點(diǎn)和交集靶點(diǎn)

通過GeneCards數(shù)據(jù)庫，得到RA相關(guān)的靶基因5 017個(gè)，兩次截取相關(guān)性評(píng)分（relevance scores）在中位數(shù)以上（≥2.61）的靶基因，得到1 259個(gè)靶基因。在DrugBank數(shù)據(jù)庫中，查找到RA靶基因154個(gè)。合并去重后得到1 352個(gè)疾病靶基因。繪制韋恩圖，找出與有效成分的交集靶點(diǎn)89個(gè)，見圖2。

圖2 藥物—疾病靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將STRING數(shù)據(jù)庫上獲得的結(jié)果中的csv文件導(dǎo)入Cytoscape3.7.2，得到含85個(gè)節(jié)點(diǎn)和619條邊的網(wǎng)絡(luò)圖（圖3）。使用工具Network Analyzer進(jìn)行分析，選擇Degree設(shè)置節(jié)點(diǎn)大小和顏色深淺。Degree值越大，節(jié)點(diǎn)越大，顏色越深。Degree值在中位數(shù)以上的靶點(diǎn)有40個(gè)，其中TNF、Akt1、IL-6、JUN、TP53、RELA、IL1B、EGFR、CASP3、MAPK1等靶點(diǎn)與其他靶點(diǎn)密切聯(lián)系，在PPI網(wǎng)絡(luò)中起著重要的作用。

圖3 獨(dú)活-桑寄生治療RA的共同靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 交集靶點(diǎn)的GO和KEGG富集分析

GO富集分析共獲得生物過程（biological process）380項(xiàng)，主要是干擾RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子、DNA模板轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、炎癥反應(yīng)等生物過程；細(xì)胞組成（cell components）35項(xiàng)，涉及細(xì)胞核、細(xì)胞外間隙、細(xì)胞質(zhì)等；分子功能（molecular function）68項(xiàng)，涉及蛋白質(zhì)結(jié)合、相同蛋白質(zhì)結(jié)合及酶結(jié)合等。每個(gè)類別取基因數(shù)排名前10的項(xiàng)進(jìn)行作圖分析，見圖4。其中，蛋白質(zhì)結(jié)合（protein binding）的基因數(shù)最多。KEGG分析中獲得97條通路。篩選出基因數(shù)排名前20的通路，繪制氣泡圖（圖5）。結(jié)果顯示，腫瘤通路（pathways in cancer）、乙型肝炎通路（Hepatitis B）、TNF信號(hào)通路（TNF signaling pathway）富集的基因數(shù)最多。這些通路中與炎癥相關(guān)的通路見表2。

圖4 交集靶點(diǎn)GO富集分析

圖5 交集靶點(diǎn)的KEGG通路氣泡圖

表2 炎癥相關(guān)的信號(hào)通路及涉及的靶點(diǎn)數(shù)

2.5 分子對(duì)接

對(duì)接分?jǐn)?shù)為實(shí)驗(yàn)解離/抑制常數(shù)的負(fù)對(duì)數(shù)，其絕對(duì)值大于5表示化合物和靶點(diǎn)有較好的結(jié)合能力[6]。表3為獨(dú)活-桑寄生藥對(duì)有效成分與核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接結(jié)果。其中當(dāng)歸醇D與TNF-α，異歐前胡素與Akt1，槲皮素與IL-6的分子對(duì)接分?jǐn)?shù)絕對(duì)值較高。

表3 有效成分與核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接結(jié)果

3 討論

獨(dú)活-桑寄生藥對(duì)是獨(dú)活寄生湯的君藥成分，在該復(fù)方制劑中占核心地位。獨(dú)活具有祛風(fēng)勝濕止痛的功效。研究表明，獨(dú)活的藥理作用有抗炎、抗風(fēng)濕、抗氧化和抗腫瘤[7-8]。桑寄生能補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕、安胎元，具有抗腫瘤、抗炎等多種藥理作用[9]。

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，先找到獨(dú)活-桑寄生藥對(duì)與RA的共同靶點(diǎn)，然后構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，篩選出核心的靶點(diǎn)，其中腫瘤壞死因子TNF是關(guān)鍵的核心靶點(diǎn)。TNF在體內(nèi)有α和β兩種結(jié)構(gòu)，其中TNF-α發(fā)揮主要的作用。TNF-α與其受體TNFR1結(jié)合后激活TNF信號(hào)傳導(dǎo)通路，調(diào)控Caspase家族介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、NF-κB和JNK蛋白激酶的活化，引起炎癥反應(yīng)[10-11]。Akt在體內(nèi)起調(diào)控細(xì)胞存活和凋亡的作用，包括Akt1、Akt2和Akt3，其中Akt1是PI3K/Akt通路的重要組成。在外界細(xì)菌、病毒等炎癥因子刺激下，Akt蛋白被PI3K磷酸化激活，磷酸化Akt蛋白參與NF-κB、mTOR和JNK等炎癥信號(hào)通路的激活[12-13]。IL-6是體內(nèi)重要的炎癥細(xì)胞因子，可促進(jìn)細(xì)胞的增值與分化，IL-6還能促進(jìn)激活STAT3信號(hào)通路，促使STAT3持續(xù)磷酸化，進(jìn)一步抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞增值。IL-6/STAT3信號(hào)通路可介導(dǎo)TNF-α、IL-1β等多種炎癥因子的產(chǎn)生，引起一系列炎癥反應(yīng)[14]。獨(dú)活-桑寄生對(duì)靶蛋白的調(diào)節(jié)作用，間接影響各種炎癥信號(hào)通路，從而發(fā)揮抗炎作用。

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種復(fù)雜的慢性病，尚未有能夠完全治愈的藥物。目前的治療藥物以非甾體抗炎藥為主，然而治標(biāo)不治本，副作用較大，部分患者不能耐受藥物，病情不能得到有效控制。近年來也出現(xiàn)了各種抗風(fēng)濕藥、生物制劑和合成靶向藥物[15]，但是價(jià)格非常昂貴。從中醫(yī)的角度入手，挖掘中藥的寶庫。其中，獨(dú)活寄生湯治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的療效顯著，得到很多臨床的證實(shí)。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，找到獨(dú)活-桑寄生藥對(duì)的治療靶點(diǎn)和相關(guān)通路，為其治療作用提供理論的基礎(chǔ)。同時(shí)，還需要通過試驗(yàn)的手段來驗(yàn)證這些理論，為中藥復(fù)方制劑的療效提供有力的科學(xué)依據(jù)。