胡 峻，陳天瑩，李孟純，段嘉寶，李 鈾,2，楊具田

（1.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730100；2.西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心，甘肅省動(dòng)物細(xì)胞技術(shù)創(chuàng)新中心，生物工程與技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730030）

中國(guó)固有的綿羊品種大致分為3 類，即蒙古羊系統(tǒng)、哈薩克羊系統(tǒng)和藏羊系統(tǒng)，其中以蒙古羊系統(tǒng)為主；而因各地區(qū)的地域差異，又可將中國(guó)綿羊分布劃分為多個(gè)區(qū)域，由沿海區(qū)的寒羊、湖羊，到云貴高原區(qū)的小尾寒羊，再到北疆區(qū)的哈薩克羊、當(dāng)巴什羊[1-2]。地方品種綿羊的種質(zhì)資源對(duì)中國(guó)畜牧業(yè)發(fā)展以及綿羊育種有著十分重要的價(jià)值，但在現(xiàn)實(shí)生產(chǎn)中，為了獲取更高的經(jīng)濟(jì)效益，牧民們常常通過(guò)雜交的手段來(lái)改良地方品種，從而使得生產(chǎn)性能相對(duì)較低的古老地方品種日趨減少甚至瀕臨滅絕，進(jìn)而引發(fā)世界性的畜禽品種資源危機(jī)。因此，綿羊種質(zhì)資源的保護(hù)意義重大且迫在眉睫[3]。

甘肅省的綿羊品種主要有甘肅高山細(xì)毛羊、蘭州大尾羊、灘羊和藏羊等[4]。而蘭州大尾羊（Lanzhou fat tailed sheep）更是我國(guó)特有的地方品種之一，主要分布在甘肅中部的干旱地區(qū)，具有成熟早、繁殖力高等特點(diǎn)，適合在蘭州地區(qū)飼養(yǎng)[5]。近年來(lái)，由于對(duì)地方特有品種的認(rèn)識(shí)不充分，對(duì)其保護(hù)力度不夠；加上外來(lái)品種引進(jìn)的影響，甘肅省各個(gè)綿羊品種均存在不同程度的滅絕危機(jī)。據(jù)研究，蘭州大尾羊滅絕頻率為0.77，居北方11 個(gè)綿羊品種之首，品種貢獻(xiàn)率為10.52%，居于第三，保護(hù)潛力為0.141 9，居第1 位，現(xiàn)已被國(guó)家列為瀕臨滅絕的遺傳資源[6]。

線粒體DNA（mtDNA）是動(dòng)物核外遺傳的主要遺傳物質(zhì)，也是研究動(dòng)物起源進(jìn)化及群體遺傳分化的理想對(duì)象[7]；在世代間沒(méi)有基因重組，為嚴(yán)格母系遺傳，同時(shí)還具有高突變率等特點(diǎn)，突變速率為單拷貝核DNA 的5～10 倍。因此，線粒體DNA 被廣泛用于動(dòng)物起源進(jìn)化、物種鑒定、疾病診斷、衰老及動(dòng)物經(jīng)濟(jì)性狀的核外基因效應(yīng)等研究[8]。已有許多學(xué)者對(duì)不同物種的mtDNA 進(jìn)行了多方面的研究與探索[9]。

該研究對(duì)甘肅地區(qū)的蘭州大尾羊（Lanzhou fat tailed sheep）、灘羊（Tan sheep）、小尾羊（Small tailed han sheep）和藏羊（Tibetan sheep）的線粒體ND4和ND2基因進(jìn)行擴(kuò)增，利用生物信息學(xué)軟件將擴(kuò)增得到的序列與GenBank 上下載的其他綿羊品種的ND2和ND4基因序列進(jìn)行比對(duì)，以探討不同種群之間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，為研究甘肅地區(qū)綿羊品種的起源以及進(jìn)一步利用和保護(hù)地方綿羊品種提供參考與借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

于甘肅當(dāng)?shù)匮驁?chǎng)采集大尾羊（D1～D6）、灘羊（S1～S12）、小尾羊（X1～X9）和藏羊（T1～T10）的組織樣本。

1.2 基因組擴(kuò)增

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 使用Gentra Puregene extraction kit（GentraSystems Inc.）從動(dòng)物組織中提取純度較高且分子量大的基因組DNA 用于后續(xù)試驗(yàn)。參照GenBank已發(fā)表的綿羊ND2與ND4基因序列設(shè)計(jì)引物，引物序列、退貨溫度與產(chǎn)物大小見(jiàn)表1，引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

表1 引物序列

1.2.2 PCR 反應(yīng)體系 上、下游引物濃度10 mmol/L，各0.5 μL；DNA 樣品濃度50 ng/μL，2 μL；PremixTaq（Takara）濃度5 U/μL，12.5 μL；無(wú)菌水9.5 μL；最終得到25 μL 的PCR 反應(yīng)體系。

1.2.3 PCR 反應(yīng)條件 94℃預(yù)變性3 min；94℃變性45 s，54（58）℃退火45 s，72℃延伸1 min，循環(huán)35 次；72℃延伸10 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物在1.4%的瓊脂糖凝膠上電泳，采用凝膠成像儀檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)著重觀察PRC產(chǎn)物是否擴(kuò)增成功以及是否有二聚體形成。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

將成功擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物送至蘭州天啟基因生物科技有限公司測(cè)序，反饋的測(cè)序結(jié)果使用Geneious 11.0.4 進(jìn)行處理，拼接獲得較為完整的序列波峰圖，并進(jìn)一步校對(duì)，獲得單個(gè)樣本的完整序列，導(dǎo)出Fasta格式的文件以進(jìn)一步處理分析。使用MEGA-X 軟件將所得全部ND2、ND4基因序列與Genbank 上已發(fā)表的其他20 個(gè)綿羊品種的ND2、ND4基因序列（表2）進(jìn)行比對(duì)。

表2 Genbank 上已發(fā)表的其他綿羊物種信息

該研究以盤(pán)羊（Ovis ammon）作為進(jìn)化樹(shù)的外群，采用MEGA-X 軟件分別用鄰接法Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建NJ 樹(shù)與最大似然法（Maximum Likelihood，ML）構(gòu)建ML樹(shù)。其中，鄰接法構(gòu)建的NJ樹(shù)以p-distance法計(jì)算遺傳距離，Bootstrap 重復(fù)選擇為1 000 次；最大似然法構(gòu)建的ML 樹(shù)，以Find BestDNA/Protein Models （ML）中最低的BIC 分?jǐn)?shù)的模型作為最佳模型，Bootstrap 重復(fù)選擇也為1 000 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因測(cè)序結(jié)果

測(cè)序結(jié)果顯示，PCR 擴(kuò)增所得ND2、ND4基因序列大小均為200 bp 左右，經(jīng)Geneious11.0.4 校對(duì)，并與國(guó)內(nèi)外ND2、ND4基因序列比對(duì)，確定樣品中DN2基因序列為184 bp，ND4基因序列為235 bp。

利用MEGA-X 軟件中的Statistic 功能分析表明：ND2基因中T、C、A、G 平均含量分別為25.2%、27.9%、38.1%、8.8%，A+T=63.3%、C+G=36.7%，含有保守位點(diǎn)177 個(gè)，變異位點(diǎn)7 個(gè)（顛換位點(diǎn)4 個(gè)、轉(zhuǎn)換位點(diǎn)3 個(gè)），簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)3 個(gè)，自裔位點(diǎn)4 個(gè)，顛換多在A-G 間發(fā)生，轉(zhuǎn)換多在C-T 間發(fā)生；ND4基因中T、C、A、G 平均含量分別為28.8%、26.7%、29.8%、14.6%，A+T=58.6%、C+G=41.3%，含有保守位點(diǎn)230 個(gè)，變異位點(diǎn)6 個(gè)（均為顛換位點(diǎn)），簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)4 個(gè)，自裔位點(diǎn)2 個(gè)，顛換均在A-G 間發(fā)生。DN2與ND4基因中G含量明顯低于其他3種堿基，出現(xiàn)典型的反G 偏倚。

2.2 基于ND2 與ND4 基因的綿羊系統(tǒng)發(fā)育分析

利用MEGA-X 將拼接校對(duì)后的所有ND2、ND4基因與GenBank 上下載的20 個(gè)序列，使用鄰近法和最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，結(jié)果如圖1、圖2 所示。

基于ND2、ND4基因所構(gòu)建的ML 樹(shù)與NJ 樹(shù)結(jié)果略有差異，其原因可能是所研究的樣本量較小且序列較短。其中ND2基因構(gòu)建的ML 樹(shù)（圖1A）中，大部分灘羊樣本與其他樣本間的親緣關(guān)系相距較遠(yuǎn)，故而單獨(dú)聚為1 小支，這樣的情況在其他3 種羊中也有體現(xiàn)，但存在個(gè)別不同品種樣本間親緣關(guān)系較近的情況；而NJ 樹(shù)（圖1B）所示結(jié)果中，哈姆達(dá)尼羊、烏拉藏羊、葉城羊等與部分大尾羊、藏羊、小尾羊樣本聚為1支；而薩赫勒羊、賈倫克羊等與另一部分藏羊、小尾羊以及個(gè)別大尾羊樣本、大部分灘羊樣本聚為1支；除去上述2 大支之外，X1、T9、S5 這3 個(gè)樣本之間親緣關(guān)系更為接近，故而單獨(dú)聚為1 小支，這樣的情況在基于ND4基因構(gòu)建的NJ 樹(shù)中也存在，但有所不同的是在基于ND4基因的NJ 樹(shù)中，T9、S1、S5、X1 這4 個(gè)樣本單獨(dú)聚為1 小支，其余樣本則分為2 支。基于ND4基因構(gòu)建的ML 樹(shù)（圖2A）中所有樣本大致分為2 支，而T9、S5、S2、S1、X1 聚為1 小支，其余樣本聚為1 支，從中可以推斷T9、S5、S2、S1、X1 樣本可能存在基因流故而親緣關(guān)系較近；而基于ND4基因的NJ 樹(shù)（圖2B）中，樣本在分為2大支的同時(shí)，還包含有2 個(gè)小分支，分支中個(gè)樣本的親緣關(guān)系情況與ND2基因構(gòu)建的NJ 樹(shù)中大致相似。

圖1 基于ND2 基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)

圖2 基于ND4 基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)

3 結(jié)論與討論

近年來(lái)，線粒體DNA（mtDNA）已經(jīng)成為分子遺傳學(xué)的熱點(diǎn)之一。動(dòng)物線粒體基因組的13 個(gè)蛋白基因包括細(xì)胞色素b 基因（Cytb）、細(xì)胞色素氧化酶3 個(gè)亞基基因 （COXⅠ、COXⅡ、COXⅢ）、NADH氧化還原酶7 個(gè)亞基基因（ND1、ND2、ND3、ND4、ND4L、ND5、ND6）和ATP 酶2 個(gè)亞基基因 （ATPase6，ATPase8），這13 個(gè)蛋白或亞基都是線粒體內(nèi)膜呼吸鏈的組分[10-11]。這些蛋白基因組的研究在探討品種起源及分化、種間的系統(tǒng)演化、種內(nèi)母系演化、地方品種資源與地理分布的關(guān)系等方面有廣泛應(yīng)用。

該研究選取NADH 氧化還原酶7 個(gè)亞基基因中的ND2和ND4基因進(jìn)行擴(kuò)增，探討甘肅地區(qū)4 種綿羊與國(guó)內(nèi)外其他品種的親緣關(guān)系，通過(guò)反復(fù)試驗(yàn)確定最佳的PCR 反應(yīng)條件，再利用生物信息學(xué)軟件對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，最后構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。

試驗(yàn)結(jié)果表明，甘肅地區(qū)4 種綿羊與國(guó)內(nèi)外綿羊均有不同程度的親緣關(guān)系，在NJ 樹(shù)中所有樣本（除外群）聚為1 大支，進(jìn)而再分為2 小支，其中2 小支中大尾羊、灘羊、小尾羊和藏羊樣本均有分布，而在ML 樹(shù)中所有樣本（除外群）均聚為1 支且并無(wú)分支，說(shuō)明試驗(yàn)所選4 種綿羊與這20 個(gè)綿羊品種有較近的親緣關(guān)系，也說(shuō)明所采集到綿羊樣本有可能與這20 個(gè)親緣關(guān)系較近的品種存在基因流。傳統(tǒng)觀點(diǎn)則認(rèn)為小種群內(nèi)的過(guò)度基因交流會(huì)造成金角衰退、遺傳多樣性的喪失以及種群數(shù)量的減少，而不同物種種群間的基因交流則可以豐富自然界生物多樣性的程度[11]。甘肅地區(qū)綿羊品種基因流存在的主要原因可能是從20世紀(jì)就開(kāi)始進(jìn)行的世界范圍內(nèi)的綿羊品種雜交，隨著社會(huì)的發(fā)展與生活水平的提升，農(nóng)牧民已經(jīng)不滿足于當(dāng)?shù)鼐d羊品種的單一優(yōu)勢(shì)性狀，開(kāi)始從國(guó)內(nèi)外不同地區(qū)引入各種優(yōu)質(zhì)綿羊種質(zhì)資源與當(dāng)?shù)靥赜械木d羊品種進(jìn)行雜交并培養(yǎng)出具有更高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的新品種，但由于長(zhǎng)期進(jìn)行雜交，新的經(jīng)濟(jì)價(jià)值高的品種不斷形成導(dǎo)致世界各國(guó)生產(chǎn)性能低的古老地方品種趨于減少，瀕臨滅絕，從而引發(fā)世界性的畜禽品種資源危機(jī)。