陳寶玲 楊開太 黃 森 龔建英 李秋荔 汪小玉 蘇莉花

（1. 廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院，廣西 南寧 530002；2. 廣西國有欽廉林場，廣西 欽州 535099）

兜蘭屬（Paphiopedilum）是蘭科（Orchidaceae）名貴花卉，全世界約有80～85種，中國多達27種，是世界上兜蘭種類最為豐富的國家之一，主要分布在廣西、貴州和云南等地[1-4]。兜蘭屬于蘭科植物中瀕危程度最高的類群，不僅自然分布區(qū)域狹窄，而且大多數(shù)種類自然居群小，個體分布不集中。近年來，由于人類活動的干擾及野生生境的破壞，野生兜蘭居群數(shù)量急劇減少，因此，兜蘭屬的所有種均被納入野生動植物瀕危物種國際貿(mào)易公約（CITES）附錄I的保護范圍[1,5]。由于兜蘭自然繁殖力低，人工繁殖效率不高，生長周期長，兜蘭產(chǎn)業(yè)發(fā)展進程緩慢。兜蘭屬是蘭科中的地生或半附生植物[1]，在自然生長中整個生活史都與菌根真菌有著密不可分的關(guān)系，二者之間獨特的生態(tài)功能構(gòu)成了偏好與蘭科植物一方的復(fù)雜的共生關(guān)系，菌根真菌能促進蘭花種子萌發(fā)和幼苗形態(tài)發(fā)生，有助于蘭花的生態(tài)入侵，影響生物群落的組成，有利于生態(tài)系統(tǒng)的保護、恢復(fù)或重建等方面[6]。此外，兜蘭植物根際具有復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，除了病原菌、益生菌和宿主植物三者在相互作用中形成穩(wěn)固的微生態(tài)平衡外，不同微生物在物理結(jié)構(gòu)、活性成分代謝、功能發(fā)揮等方面也密切相關(guān)，彼此間相互影響，相互作用[7]。目前，微生物相互作用已成為菌根研究中最活躍和最具應(yīng)用前景的領(lǐng)域之一[8]。近年來，國內(nèi)學(xué)者在部分松屬（Pinus）、楊屬（Populus）及降香黃檀（Dalbergia odorifera）等種類上對微生物互作機理進行了研究[9-12]。蘭花菌根的研究已經(jīng)覆蓋了包括蘭屬（Cymbidium）、五唇蘭屬（Doriti）、兜蘭屬及杓蘭屬（Cypripedium）等多數(shù)珍稀瀕危種類[13-23]，然而，關(guān)于多種多樣的菌根真菌在蘭科植物生長中的相互作用，尤其是菌根真菌混合接種對兜蘭生長及生理效應(yīng)的系統(tǒng)研究報道較少。本研究以前期研究中從野生兜蘭分離篩選出3個有益菌根菌種為研究材料，采用7種不同的接種方式回接到帶葉兜蘭組培苗上，在實驗室環(huán)境下揭示了菌根真菌對兜蘭生長和生理的影響，從而提高菌根的生長與合成效率，最大限度地發(fā)揮菌根真菌對宿主植物的有益效果。研究結(jié)果不僅具有重要的生態(tài)價值，促進瀕危兜蘭植物的科學(xué)保護和合理開發(fā)，而且具有重要的經(jīng)濟價值，有助于建立兜蘭高效栽培技術(shù)體系，縮短栽培周期，節(jié)約成本，促進兜蘭產(chǎn)業(yè)向生態(tài)環(huán)保產(chǎn)業(yè)的方向高效、快速發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1供試植株

選取繼代3次以上，根系2～3條，葉片3～4片，長勢一致、植株健壯且無變異的帶葉兜蘭無菌組培苗為供試植株。

1.1.2供試菌種

供試菌種為廣西野生兜蘭營養(yǎng)根中分離、篩選出的3種有益菌根真菌，編號分別為PF02、PF06、PF07，經(jīng)篩選均為帶葉兜蘭幼苗的不致病菌株。經(jīng)16S rDNA序列測定與分析，PF02為Kirschsteiniothelia tectonae、PF06為瓶霉Phialophorasp.、PF07為杯梗孢Cyphellophorasp.，3種真菌均在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC NO. 21 051、21 052、21 053）進行超低溫凍結(jié)保存。

1.2 試驗方法

1.2.1菌株活化

將供試菌株接種于PDA培養(yǎng)基上，人工氣候箱25 ℃培養(yǎng)7～10 d，作為備用菌株。

1.2.2組培苗菌根化

1） 共生培養(yǎng)基。試驗中共生培養(yǎng)基采用DE培養(yǎng)基[16]。

2）共生培養(yǎng)方法。在超凈工作臺上，用無菌水沖洗無菌組培苗根部殘留的培養(yǎng)基，無菌濾紙吸干水分，稱量組培苗的鮮質(zhì)量，葉片數(shù)和根數(shù)，然后移入DE培養(yǎng)基中，每瓶接種6株組培苗，然后用打孔器（孔直徑為0.5 cm）從已活化菌種的PDA平板菌落邊緣打孔單個菌塊，再用接種針挑取該菌塊接入相應(yīng)的位置（方法見表1），接菌量為每個菌種1個菌塊。單菌接種設(shè)3個處理，重復(fù)3次，每瓶6株苗；混合接種試驗采用雙菌混合接種和三菌混合接種方式，共設(shè)4個處理，重復(fù)3次，每瓶6株苗。對照組不接種真菌。接種后瓶口用保鮮膜密封，移入25 ℃培養(yǎng)室中培養(yǎng)，光照時長12 h/d、光照強度25 μmol/(m2·s)，在共生培養(yǎng)45 d內(nèi)每隔3 d觀察1次。

表 1 實驗處理Table 1 Experimental treatments

1.2.3測定方法

1）生長指標(biāo)測定。共生培養(yǎng)120 d后將收獲的菌根苗除去培養(yǎng)基，測定苗的鮮質(zhì)量、干質(zhì)量、葉片數(shù)、根數(shù)及根系長度等生長指標(biāo)，在80 ℃恒溫烘干箱中干燥至恒質(zhì)量，測定干質(zhì)量。計算鮮質(zhì)量增長率及與對照鮮質(zhì)量增長率[16]。

2）生理指標(biāo)測定。共生培養(yǎng)120 d后，采集菌根苗新鮮葉片測定POD、CAT、SOD等葉片保護酶活性和葉綠素含量等生理指標(biāo)，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）活性以及葉綠素含量的測定采用李合生[24]的方法，每個處理各項指標(biāo)重復(fù)3次測定。

1.2.4蘭科菌根真菌的重分離

取帶葉兜蘭單菌接種菌株的植株和不接種的對照植株若干，挑選新生根系。經(jīng)0.1%的HgCl2溶液表面消毒1 min后，用無菌水清洗4次；然后采用組織塊分離法進行菌根真菌的重分離。置于含1 μL/mL慶大霉素的PDA培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫暗培養(yǎng)7～10 d，觀察各處理根段長菌的情況。

1.2.5數(shù)據(jù)處理

采用DPS 7.05分析各處理組所增加的組培物生長指標(biāo)及生理指標(biāo)，并分別進行單因素方差分析，用Duncan新極復(fù)差法進行多重比較，篩選最佳菌根真菌及其互作方式。

2 結(jié)果與分析

2.1 共生關(guān)系的建立

培養(yǎng)120 d后，在接種菌株對應(yīng)的植株根部進行真菌重分離（表2），研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)接種處理均能分離得到對應(yīng)的3個原接種菌株，而無菌苗對照則未分離到任何菌株。說明原接種菌株均與帶葉兜蘭幼苗形成了共生關(guān)系，確定為帶葉兜蘭的蘭科菌根真菌。

表 2 菌根真菌重分離情況Table 2 Re-isolation of mycrrhizal fungi of P. hirsutissimum seedling

2.2 3種菌根真菌對帶葉兜蘭組培苗生長的影響

采用單菌根接種法研究了3種蘭花菌根真菌對兜蘭生長的影響（圖1）。經(jīng)過120 d的培養(yǎng)，數(shù)據(jù)和分析結(jié)果表明，3種菌根真菌均能不同程度地提高兜蘭組培苗的生物量，促進植株干物質(zhì)積累和生長發(fā)育（表3）。其中PF02和PF07兩個菌株對組培苗植株鮮質(zhì)量增長率具有顯著（P<0.05）作用，較對照分別增長了90.0%、105.2%，較PF06分別增長了37.2%、48.2%。同時PF02和PF07兩個菌株對組培苗的干物質(zhì)積累提高顯著，干質(zhì)量比對照增加40.0%、60.0%，差異極顯著（P<0.01），較PF06分別增長了16.7%、33.3%，差異顯著。3種真菌均能較好的侵染和定殖組培苗的根系，發(fā)揮了蘭科菌根的功效，促進根系萌發(fā)和伸長生長。值得一提的是PF07菌株，它體現(xiàn)了較好的促生功能，不僅有利于促進植株干物質(zhì)的積累，而且加快了植株新葉的生長和新根的發(fā)育，平均新增葉片數(shù)2.69片，與對照相比差異顯著，平均新根萌發(fā)數(shù)量多達2.72條，但與對照差異不顯著。

表 3 3種菌根真菌對帶葉兜蘭植株生長的影響Table 3 Effects of 3 beneficial symbiotic fungi on growth of P. hirsutissimum

圖 1 帶葉兜蘭單菌接種育苗Fig. 1 P. hirsutissimum seedling in vitro with mycrrhizal fungi single inoculation and CK

2.3 菌根真菌混合接種對帶葉兜蘭組培苗生長的影響

將3個菌株分別通過雙菌混合接種及三菌混合接種方式接種帶葉兜蘭組培苗（圖2），結(jié)果表明，3種菌根真菌的不同混合接種方式對植株生長產(chǎn)生了不同程度的促進作用，與CK相比具有顯著或極顯著的正向互作效應(yīng)，但雙菌混合接種比單菌接種及三菌混合接種方式對植株的生長更有效。由表4可知，4種混合接種方式對組培苗各項生長指標(biāo)的影響程度不同，特別是PF02×PF06雙菌組合。菌株P(guān)F06單菌接種的植株總體促生效果處于中等水平，但混合接種了菌株P(guān)F02后，雙菌組合的總體促生效果明顯提高，鮮質(zhì)量增長率、新葉數(shù)和新根數(shù)增長極顯著。接種PF02×PF06雙菌組合的組培苗鮮質(zhì)量增長率為220.78%，干質(zhì)量為0.09g，新葉數(shù)為3.2片，新根數(shù)為4.4條，其中，鮮質(zhì)量增長率較PF02×PF07、PF02×PF06×PF07及CK差異極顯著，分別提高了51.4%、74.7%、258.6%，新葉數(shù)較CK差異極顯著，增加了42.7%，新根數(shù)較PF06×PF07、PF02×PF06×PF07及CK差異極顯著，分別提高了50.5%、41.3%、

表 4 菌根真菌及其互作對帶葉兜蘭植株生物量增長的影響Table 4 Effects of mycorrhizal fungi interaction on biomass growth of P. hirsutissimum

圖 2 帶葉兜蘭混合接種育苗Fig. 2 P. hirsutissimum seedling in vitro with mycorrhizal fungi mixed inoculation and CK

150.3%。

其次是PF02×PF07，鮮質(zhì)量增長率為145.9%，干質(zhì)量為0.10 g，新根數(shù)為4.8條，新葉數(shù)為3.0片，各生長指標(biāo)較CK差異極顯著，特別是可較好的促進干質(zhì)量和新根數(shù)的增加。PF02×PF07干質(zhì)量較PF02×PF06×PF07及CK差異極顯著，分別高出42.9%與100%，新根數(shù)較PF06×PF07、PF02×PF06×PF07及CK差異極顯著，分別提高了54.2%、64.3%、173.1%。

PF06×PF07各生長指標(biāo)較CK差異顯著或極顯著，鮮質(zhì)量增長率較PF02×PF06×PF07差異極顯著，提高了51.9%。

由此可見，不同功效的菌株相互組合后產(chǎn)生了不同程度上的菌根真菌互作效應(yīng)，在3組雙菌接種方式中，PF02×PF06及PF06×PF07通過強-弱菌株組合相互作用，相互促進，體現(xiàn)了互作協(xié)同效應(yīng)；PF02×PF07通過強-強菌株組合相互制約，在接種勢、生長空間及養(yǎng)分等方面產(chǎn)生競爭，互作效應(yīng)減弱，促進植株生長緩慢，體現(xiàn)了菌根真菌互作弱協(xié)同效應(yīng)。同理，三菌混合接種的組培苗各項生長指標(biāo)增加效果也不及雙菌混合接種方式，說明菌株的種類、數(shù)量和接種量在一定程度上削弱了互作效應(yīng)。在生產(chǎn)中，應(yīng)重點尋找微生物相互作用增強的協(xié)同效應(yīng)。

2.4 菌根真菌混合接種對帶葉兜蘭組培苗生理的影響

將3個菌株雙菌混合接種及3菌混合接種并共生培養(yǎng)120 d后，比較各處理葉片的保護性酶活性及葉綠素含量等生理指標(biāo)差異，結(jié)果表明，經(jīng)菌株處理的植株，尤其是部分混合接種的植株，其生理指標(biāo)與CK相比均有不同程度上的提高（表5），效果比較突出的是PF02×PF06處理。其中，PF02×PF06的SOD與POD酶活性最高，分別為2472.8、129.4 U/g，與其他處理相比差異顯著或極顯著；PF02×PF06×PF07的CAT酶活性與葉綠素總量最大，分別為108.2、0.8 mg/g，與其他處理相比差異顯著或極顯著。PF02×PF07的SOD酶活性最高，為136.8 U/g，與其他處理相比差異顯著或極顯著。因此，微生物互作對植株生理指標(biāo)有較好的促進作用，但不同的微生物互作組合產(chǎn)生了不同程度的生理效應(yīng)，PF02×PF06是較好的互作組合，該處理能較好的提高植株保護性酶和葉綠素總量，同時又對植株生長指標(biāo)具有極強的促進作用。本研究結(jié)果進一步表明，篩選出最優(yōu)的菌根真菌及最佳的微生物互作組合，將快速提高植株的生長速度和生理響應(yīng)，有效地發(fā)揮菌根真菌之間的協(xié)同作用。

表 5 菌根真菌及其互作對帶葉兜蘭植株生理指標(biāo)的影響Table 5 Effects of mycorrhizal fungi interaction on physiological indexes of P. hirsutissimum

綜上所述，PF02×PF06、PF02×PF07、PF06×PF07等是較適合帶葉兜蘭組培苗生長的菌根真菌互作組合。

3 結(jié)論與討論

菌根-植物共生體與根際微生物之間存在著密切的相互作用模式[7]，同時，根際微生物在菌根定殖過程中起著積極地調(diào)控作用，促進菌根合成和植物生長。目前微生物互作在一些木本植物在研究較深入。多種外生菌根混合接種能顯著促進尾葉桉（Eucalyptus urophylla）、馬尾松（P. mas-soniana）幼苗生長[25-27]；雙接種幼套球囊霉（Glomus etunicatum）與慢生根瘤菌（Bradyrhzobium japonicum）有利于降香黃檀植株生長和必需養(yǎng)分的吸收及AMF侵染率提高[28]。樟子松（Pinus sylvestrisvar.mongolica）復(fù)合接種研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)根際微生物數(shù)量增加，抗氧化酶活性顯著提高[29]。黃秋良等采用芳樟（Cinnamomum camphora）苗高、地徑建立回歸方程，以針對性的微生物菌劑方案促進苗木不同生長指標(biāo)達到最大值[30]。

應(yīng)用微生物互作開展菌根化育苗技術(shù)繁育種苗，是解決兜蘭產(chǎn)業(yè)瓶頸的關(guān)鍵。近年來，蘭科植物有關(guān)微生物互作方面的研究鮮少報道，特別兜蘭的相關(guān)研究尚未發(fā)現(xiàn)。已有的研究證實，菌根真菌雙菌及三菌混合接種促進美花石斛（D.loddigesii）生物量高效積累[31]。絲核菌屬（Rhizoctonia）和角菌根菌屬（Ceratorhiza）混合接種促進美花蘭（Cymbidium insigne）組培苗的鮮質(zhì)量及葉綠素凈a、b含量增加[32]。菌根真菌和內(nèi)生細菌混合接種促進五唇蘭（Doritis pulcherrima）鮮質(zhì)量和干質(zhì)量提高[33]。王曉鳴研究發(fā)現(xiàn)“真菌與細菌”互作組合促進華石斛（D. sinense）礦質(zhì)元素的吸收，光合性能及抗旱性，調(diào)節(jié)內(nèi)源激素[34]。植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和枯草芽孢桿菌ZJU（Bacillus Subtilis）混合接種顯著抑制蘭花莖腐病[35]。因此，微生物相互對蘭花生產(chǎn)具有較廣泛的適用性和應(yīng)用前景。

在本研究中原接種菌株均與帶葉兜蘭幼苗形成了共生關(guān)系，確定為帶葉兜蘭的蘭科菌根真菌。PF07是單菌接種促生功能顯著的菌株，可與兜蘭形成有效的菌根以延伸水分吸收范圍，提供必需的養(yǎng)分，促進植株鮮質(zhì)量增長率的提高與干物質(zhì)的積累，加快了植株新葉的生長，促進植株的生長發(fā)育并參與植物生理代謝。不同功效的菌株相互組合后產(chǎn)生了不同程度的互作效應(yīng)，但雙菌混合接種比單菌接種及三菌混合接種方式對植株的生長更有效。其中，PF02×PF06雙菌組合的總體促生效果最好，有利于植株鮮質(zhì)量、新葉和新根的增長，PF02×PF07次之，促進干質(zhì)量增加和新根的生長發(fā)育。PF02×PF06及PF06×PF07通過強-弱菌株組合出現(xiàn)了強協(xié)同互作效應(yīng)，PF02×PF07的強-強菌株組合受接種勢、生長空間及養(yǎng)分競爭等影響，共生效應(yīng)弱化，緩慢促進植株生長，呈現(xiàn)弱協(xié)同互作效應(yīng)。受菌株的種類、數(shù)量和接種量影響，三菌混合接種效果不及雙菌混合接種方式互作效應(yīng)減弱。PF02×PF06是較好的互作組合，對植株生長指標(biāo)具有極強的促進作用，同時能較好的提高植株保護性酶和葉綠素總量。生產(chǎn)中應(yīng)重點篩選促使微生物相互作用增強的協(xié)同效應(yīng)，快速提高植株的生長速度和生理響應(yīng)。

本研究結(jié)果與前人結(jié)論一致，雙菌混合接種明顯優(yōu)于單菌或三菌混合接種，仲凱研究發(fā)現(xiàn)長速快的真菌優(yōu)先入侵根部并形成侵染通道，利于生長慢的真菌快速獲得侵染方位，同時，生長慢的真菌的入侵改善了根部微生態(tài)環(huán)境，促進相互侵染和植物協(xié)同生長[32]。雖然PF06單菌接種緩慢促進植株鮮質(zhì)量增長，但是聯(lián)合PF02共同侵染后則顯著提高植株生物量，但三菌同時侵染根部后，產(chǎn)生一定程度的抑制作用，說明共生平衡與協(xié)同效應(yīng)是有條件的，隨著菌根真菌種類和數(shù)量的增加，不同真菌種類在侵染潛力、菌絲發(fā)育、菌根分泌物、根系生理變化、營養(yǎng)元素及空間競爭等方面產(chǎn)生影響[26]，證明并非所有的混合接種效果都較單菌接種具有積極作用[27]。篩選優(yōu)勢微生物種類、數(shù)量及相互作用方式，可最大程度上發(fā)揮拮抗性和兼容性的統(tǒng)一[36-39]，最大限度發(fā)揮菌根對宿主植物的有益作用，這將是一個提高提高蘭花栽培效率、節(jié)約成本、提高產(chǎn)量、改善花卉品質(zhì)的有效途徑。此外，植株的生理指標(biāo)尤其是保護酶活性與根系中菌根侵染的不同時期有關(guān)，呈動態(tài)變化，因此，今后的研究將側(cè)重于菌根苗生理指標(biāo)的動態(tài)監(jiān)測與互作機理深入分析方面。