周錢森 任憲云 徐 垚 劉 萍 李 健

氨氮脅迫對(duì)錦繡龍蝦代謝酶和抗氧化酶活力的影響*

周錢森1,2任憲云2,3徐 垚2,4劉 萍2,3李 健2,3①

(1. 水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心 上海海洋大學(xué) 上海 201306；2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東 青島 266071；3. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室 山東 青島 266071；4. 江蘇海洋大學(xué) 江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江蘇 連云港 222005)

為了研究急性氨氮脅迫對(duì)錦繡龍蝦()抗氧化系統(tǒng)及氨氮代謝機(jī)制的影響，通過設(shè)置對(duì)照[(0.24±0.07) mg/L]、低濃度[(1.04±0.08) mg/L]、中濃度[(9.75±0.21) mg/L]和高濃度[(19.87±0.46) mg/L]氨氮脅迫方法對(duì)錦繡龍蝦進(jìn)行48 h急性實(shí)驗(yàn)，測(cè)定鰓與肝胰腺中抗氧化及氨氮代謝酶的活性，同時(shí)測(cè)定相關(guān)基因mRNA的相對(duì)表達(dá)變化情況。結(jié)果顯示，氨氮脅迫下錦繡龍蝦鰓和肝胰腺組織總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化(SOD)活力有不同程度的升高，6～12 h均顯著高于對(duì)照組(<0.05)；高濃度組脅迫48 h時(shí)T-AOC、SOD活力則均被抑制；過氧化脂質(zhì)(LPO)含量隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加，48 h均顯著高于對(duì)照組(<0.05)。氨代謝相關(guān)酶谷氨酰胺合成酶(GS)、谷氨酸脫氫酶(GDH)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、黃嘌呤氧化還原酶(XOD)的酶活在氨氮脅迫下與對(duì)照組相比均有不同程度的上調(diào)，表明其共同參與離子氨的代謝轉(zhuǎn)運(yùn)。肝胰腺中GDH、GOT基因表達(dá)量在12～24 h顯著高于對(duì)照組(<0.05)，在鰓組織中變化趨勢(shì)基本相同。由此可見，不同濃度的氨氮脅迫會(huì)對(duì)錦繡龍蝦抗氧化酶活性造成不同程度的誘導(dǎo)；錦繡龍蝦主要通過在肝胰腺GS、GDH等代謝相關(guān)酶的共同作用下合成無毒的谷氨酰胺以避免氨在體內(nèi)過量積累。本研究結(jié)果可為錦繡龍蝦氨解毒代謝機(jī)制的深入研究提供理論依據(jù)。

錦繡龍蝦；氨氮脅迫；抗氧化；氨代謝酶

近年來，隨著養(yǎng)殖技術(shù)的快速發(fā)展及市場(chǎng)需求的增加，高密度集約化養(yǎng)殖已成為主流養(yǎng)殖模式，水體中殘餌和排泄物使得氨氮超標(biāo)成為一種常態(tài)化的環(huán)境問題(Zhang, 2018)。水體中氨氮以非離子氨(NH3)和銨離子(NH4+)形式存在的氮，二者動(dòng)態(tài)平衡，受水質(zhì)的溫度、鹽度和pH等參數(shù)影響可相互轉(zhuǎn)換(周平, 2013; 蔡真珍等, 2015)。氮主要是以NH3形式經(jīng)鰓組織進(jìn)入甲殼動(dòng)物機(jī)體(Roumieh, 2013)。氨氮中毒會(huì)導(dǎo)致甲殼動(dòng)物免疫低下、生長(zhǎng)遲緩，同時(shí)伴隨炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激等(Koo, 2005; Chen, 1995; Cheng, 2002)。研究發(fā)現(xiàn)，由于環(huán)境脅迫因子改變誘導(dǎo)的生理效應(yīng)可能經(jīng)氧化還原途徑實(shí)現(xiàn)(Romano, 2007)，當(dāng)機(jī)體受到氨氮脅迫且超出自身調(diào)節(jié)閾值時(shí)，抗氧化系統(tǒng)被破壞，機(jī)體清除活性自由基(reactive oxygen species, ROS)能力下降，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物增加，導(dǎo)致機(jī)體氧化損傷(Reinehr, 2007)。

目前，關(guān)于水產(chǎn)動(dòng)物氨氮轉(zhuǎn)運(yùn)代謝機(jī)制的研究已有一定基礎(chǔ)，主要通過以下代謝途徑減少生物體內(nèi)氨氮的積累，從而降低毒性：(1)通過谷氨酰胺合成途徑，如斑節(jié)對(duì)蝦() (周發(fā)林等, 2016)、凡納濱對(duì)蝦() (熊大林等, 2019)等可通過谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)、谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase, GDH)等合成谷氨酰胺實(shí)現(xiàn)機(jī)體內(nèi)氨的轉(zhuǎn)運(yùn)；(2)通過氨基酸代謝途徑，如大彈涂魚() (楊洋等, 2019)、泥鰍()(Chew, 2001)、大菱鲆()(孟振等, 2020)等通過相關(guān)轉(zhuǎn)氨脫氫酶將氨轉(zhuǎn)化為自由氨基酸儲(chǔ)存；(3)通過鳥氨酸循環(huán)途徑，如中國(guó)明對(duì)蝦() (李少飛等, 2014)、三疣梭子蟹() (劉勝男等, 2015)等通過鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶(OTC)結(jié)合精氨酸酶(arginase)等形成尿素；(4)通過嘌呤核苷酸分解途徑，如挪威海螯蝦() (Bernasconi, 2011)等可經(jīng)黃嘌呤氧化還原酶(xanthine oxidoreductase, XOD)等形成尿酸。

錦繡龍蝦隸屬于十足目(Decapoda)、腹胚亞目(Pleocyemata)、龍蝦科(Palinuroidea)、龍蝦屬()(梁華芳等, 2012)。錦繡龍蝦()作為我國(guó)主要龍蝦養(yǎng)殖品種之一，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，但其人工繁育尚未突破，主要依靠捕撈野生苗種(Liu, 2016; 梁華芳等, 2012)，利用適溫的地下海水進(jìn)行陸基工廠化流水養(yǎng)殖和循環(huán)水集約化養(yǎng)殖。高密度的養(yǎng)殖條件下，氨氮已成為影響蝦類正常生理代謝的重要環(huán)境因素之一。氨氮脅迫下，甲殼動(dòng)物解毒代謝機(jī)制方面的研究主要集中在谷氨酰胺合成酶、谷氨酸脫氫酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶(glutamic oxalacetic transaminase, GOT)等(趙海濤, 2006; Qiu, 2018; Geng, 2020)。本研究側(cè)重于錦繡龍蝦的解毒代謝途徑在氨氮脅迫下的響應(yīng)機(jī)制，測(cè)定了氨氮脅迫下錦繡龍蝦鰓及肝胰腺組中代謝關(guān)鍵酶GS、GDH、GOT、XOD活性和、基因mRNA表達(dá)量、抗氧化酶總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化(SOD)活性及過氧化脂質(zhì)(LPO)含量，旨在為錦繡龍蝦氨解毒代謝機(jī)制的深入研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用錦繡龍蝦購(gòu)于海南省瓊海市永賀生物科技有限責(zé)任公司，平均體長(zhǎng)為(15.6±0.2) cm，平均體重為(187.0±0.5) g，暫養(yǎng)于黑色PVC桶中，實(shí)驗(yàn)用水為過濾凈化后的天然海水，鹽度為32.57，水溫為23.7℃，pH為8.14，每日07:00更換砂濾海水，連續(xù)充氣，10 d后開始正式實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 實(shí)驗(yàn)濃度設(shè)置參考Chen (1988)和鐘碩良等(1997)測(cè)定海水養(yǎng)殖池塘底層水的氨氮濃度(0～46 mg/L和0.01～29.3 mg/L)、Zhao(2020)關(guān)于氨氮對(duì)蝦類生理免疫影響的匯總以及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選用NH4Cl (分析純，RG≥99.5%)配置不同實(shí)驗(yàn)組的氨氮濃度，分別為對(duì)照組(0.24±0.07) mg/L、低濃度組(1.04±0.08) mg/L、中濃度組(9.75±0.21) mg/L和高濃度組(19.87±0.46) mg/L。采用奈氏試劑法測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組實(shí)際氨氮濃度。每組3個(gè)平行，每天07:00和17:00按照對(duì)應(yīng)濃度梯度進(jìn)行全換水，實(shí)驗(yàn)期間不投餌。

1.2.2 樣品采集和處理 在脅迫0、6、12、24和48 h時(shí)，從每組的每個(gè)平行中隨機(jī)挑選3尾龍蝦，快速解剖取得鰓、肝胰腺組織，分別稱取0.2 g，剪碎后加入1∶9的預(yù)冷生理鹽水，超聲波冰浴破碎，4℃低溫4000 r/min離心20 min，取上清液，置于–80℃冰箱保存，用于酶活測(cè)定。剩余組織放于1.5 mL EP管投入液氮中儲(chǔ)存，用于基因mRNA表達(dá)量分析。

1.2.3 氧化酶與氨氮代謝相關(guān)酶活性測(cè)定 按照南京建成生物工程研究所試劑盒說明書測(cè)定T-AOC、SOD、GS、GDH、GOT、XOD酶活力和LPO含量。

1.3 基因mRNA的表達(dá)分析

1.3.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)錦繡龍蝦目的基因cDNA序列，利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)qRT-PCR引物，上述引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，其序列見表1。

1.3.2 RNA提取 使用總RNA提取試劑盒提取處理后組織RNA，核酸定量?jī)x檢測(cè)RNA濃度，1.5%非變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性。

表1 本研究所用引物

Tab.1 Primers used in this study

1.3.3 cDNA第一鏈的合成 組織RNA經(jīng)過RNA-free的DNA酶消化后，使用HiScript?Ⅱ Q RT superMix for qPCR(+g DNA wiper)試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，–20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 熒光定量PCR擴(kuò)增 按照ChamQTMSYBR?Color qPCR master mix說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體積10 μL：5.0 μL SYBR color qPCR master mix (2×)，4.0 μL cDNA，0.2 μL Rox reference dyeⅡ (50×)，上下游引物各0.4 μL (10 μmol/L)，將上述試劑在1.5 mL離心管內(nèi)混勻后，分裝入96孔PCR板中。反應(yīng)程序：95℃ 30 s；95℃ 10 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，加樣完成后瞬時(shí)離心，收集液體在管底，在ABI 7500 Fast熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，使用2–ΔΔCt法計(jì)算目的基因、的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有分析采用SPSS 18.0.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，使用OriginPro 2016軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨氮脅迫對(duì)錦繡龍蝦氨氮代謝相關(guān)酶活性的影響

2.1.1 對(duì)錦繡龍蝦鰓和肝胰腺GS活性的影響 如圖1所示，對(duì)照組谷氨酰胺合成酶(GS)活性變化不顯著(>0.05)，各時(shí)間低、中濃度組鰓和肝胰腺GS活力點(diǎn)均顯著高于對(duì)照組(<0.05)，高濃度組GS活力在48 h受到顯著抑制(<0.05)。不同濃度組鰓組織GS活性呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，除24 h高濃度組與對(duì)照組無顯著差異外(>0.05)，其他時(shí)間點(diǎn)均有顯著差異(<0.05)。不同濃度組肝胰腺GS活力均在12 h達(dá)到最大值，隨后低濃度組無明顯變化趨勢(shì)，中、高濃度組呈下降趨勢(shì)。

圖1 錦繡龍蝦不同組織谷氨酰胺合成酶活性隨氨氮脅迫時(shí)間的變化

A：鰓；B：肝胰腺。不同字母表示不同組之間差異顯著(<0.05)。下同

A: Gill; B: Hepatopancreas. Different letters indicate significant difference in different groups (<0.05). The same as below

2.1.2 對(duì)錦繡龍蝦鰓和肝胰腺GDH活性的影響 如圖2所示，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，中、高濃度組鰓和肝胰腺中的谷氨酸脫氫酶(GDH)活力呈先升高后降低的變化趨勢(shì)。中濃度組鰓GDH活力在12 h達(dá)到最大值且顯著高于其他組(<0.05)，高濃度組在48 h時(shí)顯著低于對(duì)照組(<0.05)。中、高濃度組肝胰腺GDH活力最大值分別出現(xiàn)在6 h和12 h，與對(duì)照組相比具有顯著差異(<0.05)。

2.1.3 對(duì)錦繡龍蝦鰓和肝胰腺GOT活性的影響 如圖3所示，低濃度組鰓谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)活力在6～ 48 h變化規(guī)律不明顯，但與對(duì)照組均有顯著差異(< 0.05)。中濃度組呈先升高后下降的趨勢(shì)，高濃度組出現(xiàn)先降低后升高再降低的波浪式變化，最大值均出現(xiàn)在12 h且顯著高于對(duì)照組(<0.05)。48 h高濃度組鰓GOT活力受到顯著抑制(<0.05)。中濃度組肝胰腺GOT活力出現(xiàn)先升高后降低再升高的波浪式變化，高濃度組呈先升高后下降的變化趨勢(shì)。

2.1.4 對(duì)錦繡龍蝦鰓和肝胰腺XOD活性的影響 如圖4所示，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，各濃度組鰓黃嘌呤氧化酶(XOD)活力呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，中、高濃度組XOD活力顯著升高，分別在12、24 h均達(dá)到最大值且顯著高于對(duì)照組(<0.05)。低、中濃度組各時(shí)間點(diǎn)肝胰腺XOD活力均顯著高于對(duì)照組(<0.05)。而高濃度組6～24 h均顯著高于對(duì)照組(<0.05)，48 h肝胰腺XOD活力受到顯著抑制(<0.05)。

圖2 錦繡龍蝦不同組織谷氨酸脫氫酶活性隨氨氮脅迫時(shí)間的變化

A：鰓；B：肝胰腺

A: Gill; B: Hepatopancreas

圖3 錦繡龍蝦不同組織GOT活性隨氨氮脅迫時(shí)間的變化

A：鰓；B：肝胰腺

A: Gill; B: Hepatopancreas

圖4 錦繡龍蝦不同組織黃嘌呤氧化酶活性隨氨氮脅迫時(shí)間的變化

A：鰓；B：肝胰腺

A: Gill; B: Hepatopancreas

2.2 氨氮脅迫對(duì)錦繡龍蝦氨氮代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.2.1 對(duì)錦繡龍蝦鰓和肝胰腺中基因表達(dá)的影響 如圖5所示，各濃度組鰓和肝胰腺谷氨酸脫氫酶()基因相對(duì)達(dá)量表現(xiàn)出明顯的時(shí)效性。低、中濃度組鰓組織相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降再上升的變化趨勢(shì)，除6 h外，各時(shí)間點(diǎn)均顯著高于對(duì)照組(<0.05)。而高濃度組鰓組織相對(duì)表達(dá)量則呈先上升后下降的趨勢(shì)。不同濃度組肝胰腺相對(duì)表達(dá)量均呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，除48 h外，各時(shí)間點(diǎn)均與對(duì)照組有顯著差異(<0.05)。

2.2.2 對(duì)錦繡龍蝦鰓和肝胰腺中基因表達(dá)的影響 如圖6所示，低、中濃度組鰓谷草轉(zhuǎn)氨酶()基因的相對(duì)表達(dá)量呈先升高后降低再升高的波浪式變化，高濃度組則出現(xiàn)先升高后下降的變化趨勢(shì)，除6 h外，其余各時(shí)間點(diǎn)鰓相對(duì)表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組(<0.05)。隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，中、高濃度組肝胰腺相對(duì)表達(dá)量最大值均出現(xiàn)在12 h，與對(duì)照組相比具有顯著差異(<0.05)，除48 h外，各時(shí)間點(diǎn)均與對(duì)照組有顯著差異(<0.05)。

圖5 錦繡龍蝦不同組織GDH基因相對(duì)表達(dá)量隨氨氮脅迫時(shí)間的變化

A：鰓；B：肝胰腺

A: Gill; B: Hepatopancreas

圖6 錦繡龍蝦不同組織GOT基因相對(duì)表達(dá)量隨氨氮脅迫時(shí)間的變化

A：鰓；B：肝胰腺

A: Gill; B: Hepatopancreas

2.3 氨氮脅迫對(duì)錦繡龍蝦抗氧化酶活性的影響

2.3.1 對(duì)錦繡龍蝦鰓和肝胰腺T-AOC活性的影響 如圖7所示，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，低濃度組鰓T-AOC活力呈持續(xù)升高的趨勢(shì)，而中、高濃度組均呈先升高后下降的變化趨勢(shì)，最大值均出現(xiàn)在12 h且顯著高于對(duì)照組(<0.05)。中、高濃度組肝胰腺T-AOC活性最大值分別出現(xiàn)在12 h和6 h，與對(duì)照組相比差異顯著(<0.05)。低、中濃度組48 h T-AOC活性仍顯著高于對(duì)照組(<0.05)，高濃度組則被顯著抑制(<0.05)。

2.3.2 對(duì)錦繡龍蝦鰓和肝胰腺SOD活性的影響 如圖8所示，在脅迫過程中，各濃度組SOD活性隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)均呈先上升后下降的趨勢(shì)。低、中濃度組鰓SOD活性最高值均出現(xiàn)在12 h，高濃度組則在6 h，且均顯著高于對(duì)照組(<0.05)。低、中濃度組肝胰腺SOD活性最大值均出現(xiàn)在12 h，與對(duì)照組相比有顯著差異(<0.05)。高濃度組SOD活性在48 h被顯著抑制(<0.05)。

2.4 氨氮脅迫對(duì)錦繡龍蝦LPO的影響

錦繡龍蝦肝胰腺中脂質(zhì)過氧化物(LPO)含量明顯高于鰓組織(圖9)。低、中濃度組鰓和肝胰腺LPO含量逐步提升，高濃度組呈先升高后下降的變化趨勢(shì)，不同濃度組在48 h均與對(duì)照組有顯著差異(<0.05)。

圖7 錦繡龍蝦不同組織T-AOC活性隨氨氮脅迫時(shí)間的變化

A：鰓；B：肝胰腺

A: Gill; B: Hepatopancreas

圖8 錦繡龍蝦不同組織SOD活性隨氨氮脅迫時(shí)間的變化

A：鰓；B：肝胰腺

A: Gill; B: Hepatopancreas

圖9 錦繡龍蝦不同組織脂質(zhì)過氧化物含量隨氨氮脅迫時(shí)間的變化

A：鰓；B：肝胰腺

A: Gill; B: Hepatopancreas

3 討論

3.1 氨氮脅迫對(duì)錦繡龍蝦代謝機(jī)制的影響

研究表明，當(dāng)水體環(huán)境中氨氮含量發(fā)生改變時(shí)，水生生物排泄方式也會(huì)發(fā)生變化，尿素排泄量增加(Chen, 1995)。在濃度為25 mmol/L氨氮脅迫下，砂棲胡鯰()谷氨酰胺和尿素含量顯著增加，認(rèn)為其在高氨水平下可誘導(dǎo)鳥氨酸–尿素循環(huán)將氨解毒為谷氨酰胺和進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為尿素排泄來緩解氨氮毒性(Bodhisattwa, 2018)。金魚()在濃度為3.6 mmol/L的高氨水平下，腦中谷氨酰胺增加4倍(Wilkie, 2015)。本研究結(jié)果顯示，氨氮脅迫下，低、中濃度組GS酶活在氨氮脅迫12 h內(nèi)急速升高，隨后在24 h顯著下降，為了降低氨氮在體內(nèi)的積累，機(jī)體可能通過主動(dòng)運(yùn)輸或者被動(dòng)擴(kuò)散的方式消除多余的氨氮，同時(shí)啟動(dòng)解毒代謝機(jī)制，表明錦繡龍蝦具有一定的氨氮耐受能力。但48 h時(shí)，高濃度組GS酶活受到抑制，長(zhǎng)時(shí)間氨氮脅迫使機(jī)體調(diào)節(jié)能力越來越弱，龍蝦體內(nèi)會(huì)出現(xiàn)過多的自由基而抑制相關(guān)酶活力，相關(guān)研究還見于中華烏塘鱧() (Anderson, 2002)、三疣梭子蟹(劉勝男等, 2015)等。氨氮脅迫組GDH活力的顯著上調(diào)與周發(fā)林等(2016)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致，表明在氨氮脅迫下將氨合成中性、無毒的谷氨酰胺是錦繡龍蝦重要的氨代謝途徑。隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，錦繡龍蝦體內(nèi)氨氮逐漸積累，其排泄方式發(fā)生改變，6 h后GOT表達(dá)量顯著上調(diào)，推測(cè)是其催化轉(zhuǎn)氨反應(yīng)生成天門冬氨酸參與尿素形成的緣故。雖然然而尿素形成十分消耗能量，甲殼動(dòng)物的主要排氨途徑仍是合成谷氨酰胺，GOT表達(dá)量再次下調(diào)。氨氮脅迫下，各濃度組XOD活性顯著高于對(duì)照組，并表現(xiàn)出一定的劑量效應(yīng)，24 h后，XOD活性顯著下調(diào)，可能是脅迫前期產(chǎn)生的尿酸使XOD活性受到抑制。不同處理組48 h XOD活性具有顯著差異，在肝胰腺組織中尤為明顯。高濃度組XOD活性呈逐漸下降狀態(tài)，且顯著低于對(duì)照組?？赡苁怯捎谒w中氨氮濃度過大，肝細(xì)胞遭到破壞的緣故。張克儉(1993)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)氨氮濃度高于10.44 mg/L時(shí)，中國(guó)明對(duì)蝦肝胰腺中的吸收細(xì)胞部分轉(zhuǎn)化為分泌細(xì)胞，并逐漸解體，解體后的細(xì)胞碎片及大量的溶酶體等結(jié)構(gòu)堆積于肝管部位。推測(cè)氨氮脅迫下錦繡龍蝦會(huì)通過嘌呤核苷酸分解代謝途徑將氨轉(zhuǎn)化為尿酸。

GDH是一種需借助輔酶實(shí)現(xiàn)谷氨酸生物合成的線粒體酶，作為動(dòng)物獲得能量腺嘌呤核苷三磷酸(adenosinetriphosphate, ATP)的重要途徑，GDH催化反應(yīng)連接著三羧酸循環(huán)與谷氨酸，在氨氮代謝過程中發(fā)揮重要作用(王秋菊等, 2011)。GOT作為轉(zhuǎn)氨反應(yīng)的高效催化劑，主要通過輔酶在磷酸吡哆胺(pyrodoxamine photophate, PMP)和磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate, PLP)之間的相互轉(zhuǎn)換實(shí)現(xiàn)氨基的轉(zhuǎn)運(yùn)(嚴(yán)明等, 2004)。本研究發(fā)現(xiàn)，氨氮脅迫下各濃度組與對(duì)照組目的基因表達(dá)量具有明顯差異，高濃度組與低、中組相比，和基因的相對(duì)表達(dá)量后期下降明顯，可能是由于長(zhǎng)時(shí)間高濃度的脅迫打破了體內(nèi)平衡，導(dǎo)致錦繡龍蝦組織細(xì)胞受到損傷。研究結(jié)果顯示，各處理組和基因表達(dá)量與酶活性的變化趨勢(shì)有部分不同，考慮從基因表達(dá)到蛋白合成是一個(gè)復(fù)雜的修飾加工過程，蛋白活化會(huì)受到磷酸化等不定因素的影響，酶的活性也會(huì)受活性位點(diǎn)識(shí)別及激活因子濃度等多方面的影響，因此，表現(xiàn)出基因表達(dá)量與酶活性不一致的現(xiàn)象。這也說明基因的mRNA豐度與翻譯產(chǎn)物的表達(dá)量不一定具有線性關(guān)系(Martin, 2008)。

3.2 氨氮脅迫對(duì)錦繡龍蝦抗氧化系統(tǒng)的影響

當(dāng)機(jī)體受到脅迫時(shí)，體內(nèi)ROS含量迅速增加，未被抗氧化系統(tǒng)及時(shí)清除的ROS逐漸積累，促使細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化物形成，從而造成氧化損傷(段亞飛等, 2014; Sun, 2011)。本研究中，氨氮脅迫初期，錦繡龍蝦體內(nèi)抗氧化酶活力顯著升高。強(qiáng)俊等(2011)認(rèn)為，抗氧化酶活力提升可視為生物體對(duì)ROS的適應(yīng)，從而減輕脂質(zhì)過氧化損傷。由于毒性效應(yīng)，低、中濃度組T-AOC、SOD活性于脅迫12 h內(nèi)呈短暫升高趨勢(shì)，但隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，6 h后逐漸受到抑制，高濃度組T-AOC、SOD活性在12 h后呈顯著下降趨勢(shì)。原因可能與氨氮脅迫過程中有毒物質(zhì)(如LPO)積累量超過機(jī)體的耐受上限有關(guān)。脅迫初期，較低濃度的氨氮對(duì)機(jī)體抗氧化酶具有誘導(dǎo)作用，這種誘導(dǎo)作用是由于ROS增加引起的機(jī)體代償。一定時(shí)間后，由于歧化反應(yīng)產(chǎn)生超出了其承受量的H2O2，導(dǎo)致其活力受到抑制(王貞杰等, 2017)。洪美玲等(2007)認(rèn)為，隨著氨氮脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)氨氮的增益效應(yīng)消失，導(dǎo)致機(jī)體抗氧化酶活性下降，與任海等(2014)報(bào)道的氨氮脅迫對(duì)脊尾白蝦抗氧化系統(tǒng)酶活力的影響以及強(qiáng)俊等(2011)報(bào)道的氨氮與密度脅迫對(duì)羅非魚幼魚肝臟抗氧化指標(biāo)的聯(lián)合影響結(jié)果相似。結(jié)合本研究高濃度組鰓和肝胰腺T-AOC和SOD活力在48 h時(shí)顯著低于對(duì)照組，也說明較高濃度的氨氮脅迫對(duì)機(jī)體產(chǎn)生了一定程度的毒害作用。

LPO作為脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)生的細(xì)胞毒性物質(zhì)，其含量一定程度反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化水平和細(xì)胞損傷程度，同時(shí)間接反映生物體內(nèi)ROS含量(何吉祥等, 2016)。本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度氨氮脅迫后，肝胰腺LPO含量明顯大于鰓組織，可能由于肝胰腺是錦繡龍蝦主要的代謝組織。脅迫前期生物體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)被激活，但LPO含量仍在顯著上升，說明機(jī)體仍然處于脂質(zhì)過氧化狀態(tài)。各濃度組鰓和肝胰腺LPO含量均有不同程度的升高，推測(cè)由于水中氨氮濃度的升高，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化作用增強(qiáng)，也進(jìn)一步提示氨氮脅迫下LPO積累可能是氨氮對(duì)錦繡龍蝦產(chǎn)生毒害作用的主要原因之一。

ANDERSON P M, BRODERIUS M, FONG K C,. Glutamine synthetase expression in liver, muscle, stomach and intestine ofin response to a high exogeneous ammonia concentration. Journal of Experimental Biology, 2002, 205(14): 2053–2053

BERNASCONI C J, UGLOW R F. Purineolytic capacity response ofto prolonged emersion: An ammonia detoxification process. Aquatic Biology, 2011, 11(3): 263–270

BODHISATTWA B, DEBAPRASAD K, GITALEE B,. Differential expression of multiple glutamine synthetase genes in air-breathing magur catfish,and their induction under hyper-ammonia stress. Gene, 2018, 671: 85–95

CAI Z Z, ZHENG S H, WANG X. The relationship between NO3–-N, NH4+-N and environmental factors in coastal aquaculture water. Journal of Quanzhou Normal University, 2015, 33(6): 45–50 [蔡真珍, 鄭盛華, 王憲. 近海養(yǎng)殖水體中NO3–-N、NH4+-N和環(huán)境因子的關(guān)系. 泉州師范學(xué)院學(xué)報(bào), 2015, 33(6): 45–50]

CHEN J C, LIN C Y. Responses of oxygen consumption, ammonia-N excretion and urea-N excretion ofexposed to ambient ammonia at different salinity and pH levels. Aquaculture, 1995, 136(3/4): 243–255

CHEN J C, LIU P C, LIN Y T,. Super intensive culture of red- tailed shrimp. Journal of the World Aquaculture Society, 1988, 19(3): 127–131

CHENG W, CHEN J C. The virulence of enterococcus to freshwater prawnand its immune resistanceunder ammonia stress. Fish and Shellfish Immunology, 2002, 12(2): 97–109

CHEW S F, JIN Y, IP Y K. The loachreduces amino acid catabolism and accumulates alanine and glutamine during aerial exposure. Physiological and Biochemical Zoology, 2001, 74(2): 226– 237

DUAN Y F, ZHANG J S, DONG H B,. The non-specific immune response oftochallenge. Journal of Fisheries of China, 2014, 38(9): 1557–1564 [段亞飛, 張家松, 董宏標(biāo), 等. 副溶血弧菌對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦非特異性免疫酶活性的影響. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2014, 38(9): 1557–1564]

GENG Z, LIU Q, WANG T,. Changes in physiological parameters involved in glutamine and urea synthesis in Pacific white shrimp,, fedsp. meal and exposed to ammonia stress. Aquaculture Research, 2020, 51(7): 2725–2734

HE J X, PAN T S, JIANG Y Y,. Effects of dietary carbohydrate to protein ratios and feeding rate on growth and lipid metabolism index of. Journal of Shanghai Ocean University, 2016, 25(2): 198– 206 [何吉祥, 潘庭雙, 蔣陽(yáng)陽(yáng), 等. 飼料糖蛋白質(zhì)比和投喂率對(duì)異育銀鯽生長(zhǎng)及脂質(zhì)代謝指標(biāo)的影響. 上海海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2016, 25(2): 198–206]

HONG M L, CHEN L Q, GU S Z,. Effects of ammonia exposure on immunity indicators of haemolymph and histological structure of hepatopancreas in Chinese mitten crab (). Journal of Fishery Sciences of China, 2007, 14(3): 412–418 [洪美玲, 陳立僑, 顧順樟, 等. 氨氮脅迫對(duì)中華絨螯蟹免疫指標(biāo)及肝胰腺組織結(jié)構(gòu)的影響. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué), 2007, 14(3): 412–418]

KOO J G, KIM S G, JEE J H,. Effects of ammonia and nitrite on survival, growth and moulting in juvenile tiger crab,(Linnaeus). Aquaculture Research, 2005, 36(1): 79–85

LI S F, HE Y Y, LI J T,. Cloning and expression analysis of aspartate aminotransferase cDNA infollowing ambient ammonia stresses. Journal of Fishery Sciences of China, 2014, 21(6): 1125–1133 [李少飛, 何玉英, 李吉濤, 等. 中國(guó)明對(duì)蝦天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因的克隆及氨氮脅迫對(duì)其時(shí)空表達(dá)的影響. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué), 2014, 21(6): 1125–1133]

LIANG H F, HE J G. Growth model for one-year old. Journal of Fishery Sciences of China, 2012, 19(2): 364–370 [梁華芳, 何建國(guó). 實(shí)驗(yàn)條件下1齡錦繡龍蝦的生長(zhǎng)特性. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué), 2012, 19(2): 364–370]

LIANG H F, HE J G. Study on the artificial propagation and embryonic development of. Acta Hydrobiologica Sinica, 2012, 36(2): 236–245 [梁華芳, 何建國(guó). 錦繡龍蝦人工繁殖和胚胎發(fā)育的研究. 水生生物學(xué)報(bào), 2012, 36(2): 236–245]

LIU L, YANG X L, LIU C W. Eleven novel polymorphic microsatelliteloci in the ornate spiny lobster(Decapoda: Palinuridae). Journal of Genetics, 2016, 93(2): 65–67

LIU S N, PAN L Q, LIU M Q. Effects of ammonia exposure on key detoxification metabolism associated genes expression in swimming crab. Transactions of Oceanology and Limnology, 2015(2): 97–104 [劉勝男, 潘魯青, 劉茂琪. 氨氮脅迫對(duì)三疣梭子蟹解毒代謝關(guān)鍵基因表達(dá)的影響. 海洋湖沼通報(bào), 2015(2): 97–104]

MARTIN R G, BARTLETT E S, ROSNER J L,. Activation of themarA/soxS/rob regulon in response to transcriptional activator concentration. Journal of Molecular Biology, 2008, 380(2): 278–284

MENG Z, ZHANG H L, LIU X F,. Toxic effects of acute ammonia stress on young turbot. Progress in Fishery Sciences, 2020, 41(2): 51–60 [孟振, 張鴻麗, 劉新富,等. 氨氮急性脅迫對(duì)大菱鲆幼魚的毒性效應(yīng). 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2020, 41(2): 51–60]

QIANG J, XU P, HE J,. The combined effects of external ammonia and crowding stress on growth and biochemical activities in liver of (GIFT) Nile tilapia juvenile (). Journal of Fisheries of China, 2011, 35(12): 1837–1848 [強(qiáng)俊, 徐跑, 何杰, 等. 氨氮與擁擠脅迫對(duì)吉富品系尼羅羅非魚幼魚生長(zhǎng)和肝臟抗氧化指標(biāo)的聯(lián)合影響. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2011, 35(12): 1837–1848]

QIU L, SHI X, YU S,. Changes of ammonia-metabolizing enzyme activity and gene expression of two strains in shrimpunder ammonia stress. Frontiers in Physiology, 2018, 9: 211

REINEHR R, G?RG B, BECKER S,. Hypoosmotic swelling and ammonia increase oxidative stress by NADPH oxidase in cultured astrocytes and vital brain slices. Glia, 2007, 55(7): 758–771

REN H, LI J, LI J T,. Effects of acute ammonia stresses on antioxidant enzyme activities and GPx gene expression in. Journal of Agro-Environment Science, 2014, 33(4): 647–655 [任海, 李健, 李吉濤, 等. 急性氨氮脅迫對(duì)脊尾白蝦()抗氧化系統(tǒng)酶活力及GPx基因表達(dá)的影響. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2014, 33(4): 647–655]

ROMANO N, ZENG C. Ontogenetic changes in tolerance to acute ammonia exposure and associated gill histological alterationsduring early juvenile development of the blue swimmer crab,. Aquaculture, 2007, 266(1/2/3/4): 246–254

ROUMIEH R, BARAKAT A, ABDELMEGUID N E,. Acute and chronic effects of aqueous ammonia on marbled spinefoot rabbitfish,(Forssk?l 1775). Aquaculture Research, 2013, 44(11): 1777–1790

SUN H, YANG W, CHEN Y,. Effect of purified microcystin on oxidative stress of silver carplarvae under different ammonia concentrations. Biochemical Systematics and Ecology, 2011, 39(4/5/6): 536–543

WANG Q J, XU L, FAN M Z. Recent advances in transport systems of glutamate and glutamine. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2011, 23(6): 901–907 [王秋菊, 許麗, 范明哲. 谷氨酸和谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的研究進(jìn)展. 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào), 2011, 23(6): 901–907]

WANG Z J, CHEN S Q, CAO D Z,. Effects of acute ammonia nitrogen stress on histopathology of gill and liver and enzyme activities of juvenile. Progress in Fishery Sciences, 2017, 38(2): 59–69 [王貞杰, 陳四清, 曹棟正, 等. 急性氨氮脅迫對(duì)圓斑星鰈()幼魚鰓和肝組織結(jié)構(gòu)及相關(guān)酶活性的影響. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2017, 38(2): 59–69]

WILKIE M P, STECYK J A W, COUTURIER C S,. Reversible brain swelling in crucian carp () and goldfish () in response to high external ammonia and anoxia. Comparative Biochemistry and Physiology, Part A Molecular and Integrative Physiology, 2015, 184: 65–75

XIONG D L, DUAN Y F, XU J M,. Physiological responses in gills ofexposed to the combined stress of temperature and ammonia. Journal of Southern Agriculture, 2020, 51(9): 2296–2303 [熊大林, 段亞飛, 徐敬明, 等. 凡納濱對(duì)蝦鰓組織對(duì)高溫和氨氮脅迫的生理響應(yīng). 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2020, 51(9): 2296–2303]

YAN M, XU W, CHEN F. Advances in structure and function ofAspAT. Chinese Journal of Bioprocess Engineering, 2004, 2(3): 14–18 [嚴(yán)明, 許偉, 陳菲.天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究進(jìn)展. 生物加工過程, 2004, 2(3): 14–18]

YANG Y, MENG F X, WANG R X. On the detoxification metabolic pathways ofexposed to acute ammonia-nitrogen stress. Biotechnology Bulletin, 2019, 35(11): 72–81 [楊洋, 孟繁星, 王日昕. 急性氨氮脅迫下大彈涂魚解毒代謝途徑的研究.生物技術(shù)通報(bào), 2019, 35(11): 72–81]

ZHANG K J. Toxication of Zn2+and NH3-N on hepatopancreas of. Journal of Fisheries of China, 1993, 17(1): 52–59 [張克儉. 鋅和氨氮對(duì)對(duì)蝦肝胰臟的毒性作用. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 1993, 17(1): 52–59]

ZHANG L, XU E G , LI Y,. Ecological risks posed by ammonia nitrogen (AN) and unionized ammonia (NH3) in seven major river systems of China. Chemosphere, 2018, 202(1): 136–144

ZHAO H T. Effects of ammonia on haematologieal and immune parameters of juvenile Southern catfish (Chen). Master′s Thesis of Southwest University, 2006 [趙海濤. 氨氮對(duì)南方鯰(Chen)幼魚血液生理, 生化及非特異性免疫指標(biāo)的影響. 西南大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文, 2006]

ZHAO M M, YAO D F, LI S K,. Effects of ammonia on shrimp physiology and immunity: A review. Reviews in Aquaculture, 2020, 12(4): 2194–2211

ZHONG S L, CHEN Y Z, LIN K B,. Studies on variations of contents of NH4+-N, S2–and heterotrophic bacteria in substrate of shrimp ponds and their correlations. Journal of Applied Oceanography, 1997, 16(4): 449–454 [鐘碩良, 陳月忠, 林克冰, 等. 蝦池底質(zhì)中NH4+-N、S2–和異養(yǎng)細(xì)菌含量的變化及其相關(guān)性研究. 臺(tái)灣海峽, 1997, 16(4): 449– 454]

ZHOU F L, CHEN J S, HUANG J H,. Molecular cloning and expression analysis of glutamate dehydrogenase (GDH) inunder ammonia nitrogen stress. Journal of Fishery Sciences of China, 2016, 23(6): 1236–1246 [周發(fā)林, 陳勁松, 黃建華, 等. 斑節(jié)對(duì)蝦谷氨酸脫氫酶基因克隆及氨氮脅迫對(duì)其時(shí)空表達(dá)的影響. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué), 2016, 23(6): 1236–1246]

ZHOU P. The harm of ammonia nitrogen to aquaculture and its prevention measures. China Fisheries, 2013(8): 63–64 [周平.氨氮對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖的危害及防治措施. 中國(guó)水產(chǎn), 2013(8): 63–64]

Effects of Ammonia Stress on Metabolic and Antioxidant Enzyme Activities in

ZHOU Qiansen1,2, REN Xianyun2,3, XU Yao2,4, LIU Ping2,3, LI Jian2,3①

(1. National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Qingdao, Shandong 266071, China; 3. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao, Shandong 266071, China; 4. Bioresources and Environment/Jiangsu Key Laboratory of Marine Biotechnology, Jiangsu Ocean University, Lianyungang, Jiangsu 222005, China)

In this study, in order to explore the effects of acute ammonia stress on the antioxidant and ammonia-nitrogen metabolism systems of, lobsters were exposed to different concentrations of ammonia (0.24±0.07, 1.04±0.08, 9.75±0.21, and 19.87±0.46 mg/L) for up to 48 h. The activity of antioxidant and ammonia-nitrogen metabolizing enzymes and related gene expression were assessed in the gills and hepatopancreas at 0, 6, 12, 24, and 48 h after ammonia stress. From 6 to 12 h, total antioxidant capacity (T-AOC) and superoxide dismutase (SOD) activity in the gills and hepatopancreas of.under ammonia nitrogen stress increased to varying degrees, and was significantly higher than that of the control group (<0.05). In the high-concentration group, T-AOC and SOD activity was inhibited for 48 h. The LPO content gradually increased with prolonged stress and was significantly higher than that of the control group (<0.05) at 48 h. The activities of the ammonia metabolism enzymes glutamine synthetase (GS), glutamate dehydrogenase (GDH), glutamic-oxalacetic transaminase (GOT), and xanthine oxidoreductase (XOD) were all up-regulated to varying degrees under ammonia stress compared with those of the control group, indicating that they are jointly involved in the metabolic transport of NH4+. Additionally, from 12 to 24 h, the expression of GDH and GOT genes in the hepatopancreas was significantly higher than that of the control group (<0.05); the same trend was identified in gill tissue. In brief, different concentrations of ammonia stress induce different levels of antioxidant enzyme activity.mainly synthesizes glutamine under the combined action of hepatopancreas GS, GDH, and other metabolic enzymes to avoid excessive ammonia in the body.

; Ammonia nitrogen stress; Antioxidant; Ammonia metabolic enzyme

LI Jian, E-mail: lijian@ysfri.ac.cn

S917.4

A

2095-9869(2022)02-0147-10

10.19663/j.issn2095-9869.20210125002

* 國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃課題(2019YFD0900403)和中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院院級(jí)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)(2020TD46)共同資助 [This work was supported by projects of the National Key R&D Program of China (2019YFD0900403), and Central Public-Interest Scientific Institution Basal Research Fund, CAFS (2020TD46)]. 周錢森，E-mail: qiansenzhou@126.com

李 健，研究員，E-mail: lijian@ysfri.ac.cn

2021-01-25,

2021-02-25

周錢森, 任憲云, 徐垚, 劉萍, 李健. 氨氮脅迫對(duì)錦繡龍蝦代謝酶和抗氧化酶活力的影響. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2022, 43(2): 147–156

ZHOU Q S, REN X Y, XU Y, LIU P, LI J. Effects of ammonia stress on metabolic and antioxidant enzyme activities in. Progress in Fishery Sciences, 2022, 43(2): 147–156

(編輯 馮小花)